1. Protokoll zum Multi-Flaschen für die Zellkultur Einsatz <ol><li> Vorbereitung der Schiffe und das Hinzufügen von Zellsuspension <ol><li> Bereiten Sie das Zellwachstum Medium, wie gebraucht. </li><li> Line up Multi-Flask vertikal auf die Seite mit der Kappe nach oben auf die Arbeitsfläche (sterile Laminarströmungshaube). <ol><li> Diese Kolben sind in 3 und 5-Schicht-Formate und verwenden ein ähnliches Work-Flow-Muster als T-175 Kolben. </li></ol></li><li> Lösen und entfernen Sie caps. Fügen Sie benötigte Menge an vorgewärmten Medium in Kolben mit einem 50 oder 100 mL Pipette oder durch Ausgießen. <ol><li> Pipetten sind, die ≤ 10 ml kann der Boden des Gefäßes zu erreichen, wenn Multi-Flaschen vertikal mit Kappe nach oben gelegt werden. Pipetten ≥ 10 ml in das Gefäß sofort erreichen vergangenen Logo auf der Multi-Flask, wodurch eine komfortable Portal größere Mengen an Medien Schiff hinzuzufügen. </li></ol></li><li> Zur Vermeidung von Blasenbildung des Mediums erlauben Flüssigkeitsstrom zu flow entlang der Innenwand des Multi-Flask Deckel (logo-Seite). </li><li> Add Zellsuspension aus einer konzentrierten Zelle Lager in Wachstumsmedium durch die obere Schicht mit einem 10-ml-Pipette und Kappe Flaschen. Tipps: - Transport Multi-Flaschen auf einem Wagen zum Inkubator Ort und führen verbleibenden Schritte. - Die Zelle Aussaatdichte variiert je nach Zelltyp, mittel-und Kultur Dauer benötigen. Beginnen Sie mit der Aussaatdichte und Medien Lautstärke auf, dass im Standard-T-175 Flaschen verwendet und vermehren sich durch 3 oder 5 in Abhängigkeit von der Multi-Flask-Format verwendet. </li></ol></li><li> Mischen der Zellen <ol><li> Mix Position: Halten Sie den Multi-Flask aufrecht mit dem Logo nach Ihnen und wiederum gegen einen 45 °-Winkel im Uhrzeigersinn mit Mix-Anschluss nach oben ein. </li><li> Halten unter dem gleichen Winkel, sanft kippen Multi-Flask von vorne nach hinten (Hals von Ihnen weg), bis die Flüssigkeit in der oberen Schicht fließt vollständig downwards durch den Mix-Port. Pivot auf Mix-Port-Seite. </li><li> Ebenso sanft Rock Multi-Flask von hinten nach vorne (Hals nach dir) bis mittleren Abflüsse in vollem Umfang von der unteren Schicht nach oben hin durch den Mix-Port. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 ein weiteres Mal, um die ordnungsgemäße Durchmischung sicherzustellen. </li><li> Bringen Sie Multi-Flask zurück zur Mix-Position (Schritt 1.2.1) und fahren bis 1,3 Schritt </li><li> Alternativ können Zellsuspension extern aus dem Multi-Kolben hergestellt werden und Zellsuspension kann das Schiff mit einer Pipette oder durch vorsichtiges Gießen aufgenommen werden. <ol><li> Mix-Port ermöglicht in-vessel Mischen von Zellen mit Medien und beseitigt die Notwendigkeit, große Mengen von Zellsuspensionen extern zu machen. </li><li> Es ermöglicht auch Medien Ausgleich über die Schichten des Multi-Flask </li></ol></li></ol></li><li> Äquilibrierung von Flüssigkeit <ol><li> Nach dem Mischen / Zugabe der Zellsuspension, um Platz Multi-Flask senkrecht auf einer ebenen Arbeitsfläche auszugleichen Flüssigkeitsvolumen Gleichunglly in allen Schichten. </li></ol></li><li> Partition Flüssigkeit in jeder Schicht <ol><li> Halten Sie den Multi-Flasche mit dem Logo nach Ihnen und einem 45 ° Winkel zu partitionieren die Flüssigkeit in jeder der Schichten im Uhrzeigersinn drehen. Tipp: - Für beste Ergebnisse ist es wichtig, eine ebene Arbeitsfläche für Steps 1,3-1,4 verwenden </li></ol></li><li> Transport <ol><li> Sobald Medien mit Zellsuspension wird partitioniert, Transport Multi-Flask gleichzeitig Winkel von 45 ° (im Uhrzeigersinn) wie in Schritt 1.4.1 mit den Medien vom Mix-Port in Inkubator. Diese Position eignet sich auch bei der Entfernung von Flaschen aus Inkubator für die Wiedergabe auf einem Mikroskop. </li></ol></li><li> Platzieren Multi-Flask auf Inkubator Regal <ol><li> Halten Multi-Flask im Winkel von 45 ° (im Uhrzeigersinn, weg von Mix-Port), drehen Sie ihn leicht nach unten waagerecht auf dem Inkubator Oberfläche (unter Verwendung der Ecke weg von der Mix-Port alsPivot). Lay Multi-Kolben mit Logo nach oben zeigt. <ol><li> Falcon Multi-Flask Design ermöglicht Schiffen gestapelt werden und hält sie an ihrem Platz durch ein robustes Stacking Rippe. </li></ol></li></ol></li><li> Verteilung von Zellen und Reagenzien <ol><li> Nach der Platzierung Multi-Flask flach auf Arbeitsfläche, sanft hin und her Rock-und Seiten-und her, um Zellen gleichmäßig zu verteilen auf Kultur Oberflächen dabei nicht um Flüssigkeit aus jeder Schicht zu verschütten. Stack-Flaschen. <ol><li> Dieser Kolben wird von optisch klaren Material und Zellen auf der letzten Schicht kann leicht an einem Mikroskop betrachtet werden. </li></ol></li></ol></li><li> Medien Austausch <ol><li> Saugen Sie beim Kippen der Multi-Flask auf der linken Seite (mix-Port-Seite) mit dem Logo zu Ihnen zeigt. </li><li> Dann kippen, die Multi-Flask nach rechts, weiterhin alle restlichen Medien absaugen. </li><li> Fügen Sie entsprechende Menge an Medien und führen Sie die Schritte 1,3-1,7 </li></ol></li></ol> 2.Ernten von Zellen aus Multi-Flaschen <ol><li> Um Zellen, line up Multi-Flaschen senkrecht distanzieren und bringen jeden in die Position (Schritt 1.2.1) Mix. Vorsichtig auf den Kopf Flaschen mit dem Hals nach oben ein, um damit Medien auf die oberste Schicht der Multi-Flask abtropfen lassen. </li><li> Legen Sie eine 5 oder 10 mL Absaugen Spitze durch den Hals, bis Sie Flüssigkeitsstand in der Nähe des Mix-Anschluss zu erreichen. Saugen Sie erschöpft Medium. </li><li> Add Dissoziation Reagenz / Waschpuffer und bringen zu positionieren, wie in Schritt 1.2.1 Mix, dann gehen Sie und folgen Sie den Schritten von 1,3 bis 1,7. Neutralisieren mit Wachstumsmedium / Neutralisationsmittel und gießen Zellsuspension in ein Aufnahmerohr oder Invertzucker Kolben, so dass Zellen ablaufen die obere Schicht des Schiffes und sammeln Zellen mit Hilfe einer 10 ml Pipette. Tipp: Um Rückgewinnung von Zellen oder Reagenzien zu verbessern, bringen Multi-Flask zu positionieren (Schritt 1.2.1) mischen, kehren mit dem Hals in Richtung Bediener komplette Entwässerung von Medien aus al erlauben<html> l Schichten auf die oberste Schicht. Dann kippen Multi-Flask zu 45 °-Winkel (weg von der Mix-Port) im Uhrzeigersinn drehen, während der Multi-Flask bleibt invertiert. Mit einer Pipette (1-10 mL), um alle verbleibenden Reagenzien sammeln. </li></ol> 3. Empf. Arbeitsvolumen in Falcon Multi-Flaschen Nährmedien 3-Schicht: 75-150 ml pro Multi-Flask 5-Schicht: 125-250 ml pro Multi-Flask Dissoziation Agent 3-Layer: ≥ 15 ml pro Multi-Flask 5-Schicht: ≥ 25 ml pro Multi-Flask Tipp: Beginnen Sie mit mittlerer Lautstärke in Standard-T-175 Flaschen verwendet und vermehren sich durch 3 oder 5 mal in Abhängigkeit von der Multi-Flask-Format ausgewertet, so dass mL pro Flächeneinheit gleich bleibt. 4. Repräsentative Ergebnisse: 1. Design von Falcon Multi-Flask files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg &quot;/&gt; . Abbildung 1: Multi-Flask Zellkulturgefäße werden in einem 3 - und 5-Schicht-stapelbar Format für Scale-up von Zellen bieten 525 und 875 cm 2 Wachstum Oberfläche, bzw.. Pipette Zugang erleichtert Hinzufügen und Entfernen von Zellen und Reagenzien in-und außerhalb des Schiffes. Anwesenheit von Mix-Anschluss erlaubt eine schnelle in-vessel Misch-und Ausgleichsbecken von Medien in allen Schichten der Multi-Flask. . 2 Cell Yield mit Multi-Flask: Diese Schiffe sind im 3-Schicht-und 5-Schicht-Formate, die bis 3 entsprechen und 5-mal die Fläche des T-175 Flaschen zur Verfügung. Dementsprechend ≥ 3 und 5-mal (130 ± 6,8 x 10 6 und 218 ± 23,6 x 10 6 Zellen, bzw.) die Anzahl der BHK-21 (baby hamster kidney) Zellen wurden gezüchtet und erholte sich von Multi-Flask im Vergleich zu T-175 Flaschen (43,2 ± 3,5 x 10 6 Zellen; Abb.2a). Zell-Ertrag pro unit Oberfläche wurde in 3 entspricht - und 5-Schicht-Multi-Flaschen und T-175 Flaschen für BHK-21, LNCaP (menschlichen Prostata-Adenokarzinom-Zelllinie), Hep-G2 (human Hepatokarzinom Zelllinie), EcoPack 2-293 (human Nieren-Zelllinie) für einen Zeitraum von 48-96h (Abb.2b) in Nährmedien (35 ml pro Schicht), wie Zelle Anbieter (ATCC, Sigma und / oder Clontech) empfohlen kultiviert. Die Zellen wurden auf einem automatischen Vi-CELL-Zähler (1) aufgezählt. <img alt="2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg" /> Abbildung 2A: Drei bis fünf mal die Anzahl der BHK-21 Zellen wurden gezüchtet und von 3 erholt - und 5-Schicht-Multi-Flaschen im Vergleich zu T-175 Flaschen. Erwartete Rendite wurde mit meinen Zellausbeute von der Steuerung T-175 Flaschen von drei und fünf Mal für die 3 multipliziert - und 5-Schicht-Multi-Flaschen bzw. (n = 4 Flaschen / Format). <img alt="2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg" /><br/&gt; 2B: Cell Ertrag pro cm 2 wurde in 3 entspricht - und 5-Schicht-Multi-Flaschen und T-175 Flaschen für BHK-21, LNCaP, HepG2 und EcoPack2-293-Zellen. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert von 4 bis 6 Flaschen. BHK-21-Zellen (11.000 Zellen/cm2) wurden für 72 Stunden, LNCaP-Zellen (20.000 Zellen/cm2) und EcoPack2-293-Zellen (~ 35.000 Zellen/cm2) kultiviert wurden für 96 Stunden und HepG2-Zellen (25.000 Zellen / cm 2 kultiviert ) wurden 48 Stunden vor der Ernte kultiviert. 3. Medienverteiler unter Schichten von Multi-Flask Zellkulturmedium (DMEM; Invitrogen) wurde auf 5-Schicht-Multi-Flaschen (250 mL/5-layer Schiff) zugegeben und partitioniert in Schichten nach oben beschriebenen Protokoll. Medien Verteilung wurde durch Bohren von Löchern in jeder Schicht und Medien aus einzelnen Schichten gepumpt gemessen. Gewicht von Flüssigkeit aus jeder Schicht wieder erwies sich als relativ einheitlich von Schicht zu Schicht, wie in Abb. 3 dargestellt. Sie sind wie folgt: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg" /> Abbildung 3. Uniform Medien Verteilung in jeder der fünf Schichten eines 5-Schicht-Multi-Flask. Zellkulturmedium wurde Multi-Flaschen (250 ml/5-layer Schiff), äquilibriert und partitioniert werden, um einzelne Schichten aufgenommen. Die Medien wurde durch die Löcher in einzelne Schichten und Flüssigkeit Gewicht gebohrt gepumpt wurde aus jeder Schicht (n = 6 Flaschen) aufgenommen. 4. Zellverteilung zwischen Lagen von Multi-Flask Die Zellen können hinzugefügt und gemischt werden innerhalb des Multi-Flask. Wir simulierten Verteilung der Zellen zwischen den Schichten des Multi-Flask mit Perlen (10 um; Polysciences Inc.) eine ähnliche Größe wie Zellen. Bead Suspension wurde in Multi-Flask Schiff mit einer 10 ml Pipette durch die obere Schicht zugegeben und vermischt mit den Medien in das Schiff als described in das Protokoll über. Bead Verteilung wurde durch Bohren von Löchern in jeder Schicht und Flüssigkeit mit Bead-Suspension erfolgte aus einzelnen Schichten gepumpt gemessen. Bead-Konzentration aus jeder Schicht wieder auf einem Coulter Counter abgelesen und notiert. Hier findest du entsprechende inter-layer bead-Distributionen im 3-Schicht Multi-Flaschen (Abb. 4a). Der Mix-Anschluss ermöglicht die homogene Verteilung der Zellen und Reagenzien zwischen Multi-Flask Schichten. <img alt="Abbildung 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg" /> Abbildung 4A: Bead Verteilung in jeder der drei Schichten eines 3-Schicht-Multi-Flask. Eine Suspension von Perlen (3,6 x10 6 / ml) wurde auf Medium in Multi-Flaschen verzichtet hinzugefügt (Bead-Suspension: media Volumen beträgt 1:10, vol: vol) und gemischt, gefolgt von Gleichgewichts-und-Trennung mit Hilfe des Protokolls beschrieben. Bead-Konzentration aus jeder Schicht (Medium, durch Löcher auf jeder Schicht gebohrt gepumpt wird) wieder auf einem Coulter Count lesener und aufgezeichnet. Hier findest du entsprechende inter-layer bead-Distributionen in 3 - Schicht Multi-Flaschen (n = 5 Flaschen) Hier findest du repräsentative Bilder von Ecopack 2-293 Färbungsmuster von Zellen gezüchtet, um&gt; 80% Konfluenz auf 3-Schicht-Multi-Flaschen in ergänzt das Wachstum Medien. Zellmonoschichten wurden fixiert und mit Kristallviolett gefärbt und Multi-Flask Schichten wurden dann abgeschnitten und Bilder gescannt (2). Beachten Sie, Zelle Musterung war homogen auf alle Schichten der Multi-Flask (Abb.4b). Ähnliche Ergebnisse wurden mit verschiedenen Zelltypen untersucht (Daten nicht gezeigt). <img alt="4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg" /> 4B: Diese Abbildung zeigt homogene Zellwachstum zwischen den Schichten des Multi-Flaschen. Ecopack-2-293 Zellen gezüchtet, um&gt; 80% Konfluenz in 3-Schicht-Multi-Flaschen und T-175 wurden fixiert und mit Kristallviolett gefärbt. Multi-Flask Schiffe wurden geschnitten und jedes gefärbte Schicht wurde durchsucht. 5 Air Supply in Multi-Flask.: Analyse verbracht Medien mit BioProfile FLEX-Analysator (3,4) (Nova Biomedical) aus EcoPack2-293-Zellen für 96 Stunden kultiviert zeigten keinen Unterschied in der Sättigung der Zellen in 5-Schicht-Multi-Flaschen vs T-175 Flaschen (81,03 gestiegen ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% Umgebungstemperatur O 2). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg" /> Abbildung 5: Air-Sättigung (% Umgebungstemperatur O 2) von verbrauchten Medien waren in pre-mixed media aus 5-Schicht-Multi-Flaschen vs T-175 Flaschen. EcoPack2-293-Zellen wurden in einer Dichte von 35.000 Zellen / cm 2 ausgesät und kultiviert für 96 Stunden vor der Media-Analyse (n = 3 Flaschen).

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	<li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+mesurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells.">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).</li><li>Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+growth+assay+for+epidermal+cell+cultures+by+their+crystal+violet+binding+capacity.">Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity.</a> Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).</li><li>Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Flux+analysis+of+CHO+cell+metabolism+in+the+late+non-growth+phase.">Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).</li><li>Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+elevated+pCO2+and+osmolality+on+growth+of+cells+and+production+of+antibody&#x2013;fusion+protein+B1:+a+case+study.">Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody&#x2013;fusion protein B1: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 21, (2005).</li><li>Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+culture+medium+volume+on+cell+density+and+life-span+of+human+diploid+fibroblasts.">The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts.</a> Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).</li><li>Flaherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , (2009).</li><li>Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , (2011).</li><li>DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+coordinately+modulates+liver+transcription+factors+and+hepatocyte+morphology.">The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).</li><li>Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+of+&#x03B2;1+integrins+for+keratinocyte+migration+in+vitro+and+during+cutaneous+wound+repair.">A crucial role of &#x03B2;1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair.</a> Dev. 129, 2303-2303 (2002).</li></ol>

Alle Autoren sind Mitarbeiter von Becton Dickinson, Biosciences Segment, Discovery Labware Unit.

Die aktuelle Studie zeigt die Steigerung der Produktivität, dass die Multi-Flask Design Forschern bietet. Zwar ist es wichtig, dass die oben genannten Schritte für eine optimale Leistung skizzierte bei der Verwendung von Multi-Flaschen folgen, gibt es nur wenige kritische Schritte in diesem Protokoll, das als wichtigste sind. Dazu gehören (i) Mischen von Zellen und Reagenzien mit dem Mix-Port innerhalb des Gefäßes (ii) den Transport von Multi-Kolben bei 45 °-Winkel nach Partitionierung Flüssigkeit in jeder der Schichten (iii) zur Multi-Flask flachen post Aufteilung in Uhrzeigersinn Inkubator. Der richtige Einsatz von Multi-Flask führt zur Produktion eines homogenen Zellpopulation innerhalb jedes Schiff, das in einer Umgebung, die kongruent zu T-175 Flaschen (5) ist kultiviert wird. Diese Schiffe verfügen über 3 und 5 mal mehr Zellen in einem ähnlichen Abmessungen wie der T-175 Kolben. Die 3 und 5-Schicht-Schiff bietet 525 und 875cm 2 von Wachstum-, respektive und bieten sowohl Platz als auch Arbeits-savings für die Nutzer. Tissue Culture Oberflächenbehandlung ist vergleichbar mit Standard-Flaschen so dass Scale-up, ohne die Notwendigkeit einer erneuten Optimierung der bestehenden Kultur Bedingungen oder Kompromisse bei der Qualität, Homogenität oder die Leistung der Zellen (6, 7). Dies bietet auch für die Vergleichbarkeit mit den zuvor gesammelten Daten. Diese Schiffe können auch mit Reagenzien wie Kollagen beschichtet werden, Fibronectin, Poly-D-Lysin an einen spezialisierten Substrat für den Anbau, Wachstum und Differenzierung von bestimmten Zelltypen wie Leberzellen 8, kertainocytes 9, Stammzellen in serum-freiem Medium gezüchtet bieten Formulierungen. Coating-Lösungen können mit minimal residual Flüssigkeitsretention entfernt werden, um Verschwendung von wertvollen Reagenzien sowie eine effektive Entfernung der Beschichtung Lösung vor der Kultivierung von Zellen zu reduzieren. Die empfohlene optimale Datenträger zur Kultivierung von Zellen in Multi-Kolben Bereich von 0,142 bis 0,287 ml / cm 2, die mit 25-50 ml pro Schicht zu übersetzen. Im Gegensatz zu anderen vielschichtigen Kolben, tseinem Produkt bietet eine Mischung-Port in das Gefäß, das eine schnelle in-vessel Mischen sowie eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Reagenzien innerhalb und zwischen den Schichten der einzelnen Schiffe ermöglicht. Diverse Zelllinien, primären Kulturen und Stammzellen wurden bis effizient skaliert mit Multi-Flaschen. Diese Schiffe sind besonders vorteilhaft für Anwendungen, die eine große Zahl von Zellen, wie im High-Throughput-Screening, zur Herstellung von Impfstoffen, viraler Vektor Transfektionen und Zelltherapie zu verlangen. Einsparungen in Zeit, Raum, Arbeit und verringert das Abfallaufkommen sind der Schlüssel Gewinne der Multi-Flask im Vergleich zu herkömmlichen Kulturen in einschichtigen Behältern. Wir können Kultur etwa das Dreifache der Zahl der Zellen ab 5 geerntet, T-175 Flaschen im gleichen Raum mit 3, 5-Schicht-Multi-Flaschen. Dieser Vorteil in platzsparender ist nicht nur auf T-175 beschränkt, sondern kann auch auf andere Schiffe ausgedehnt werden: ein Standard Rollflasche Apparat, der in gemeinsamen Labor Inkubatoren Häusern passt ~ 4 roller Flaschen (2200 ml), die jeweils 850cm 2-Oberfläche zur Verfügung stellt. In der gleichen Gegend, kann ~ 20, 5-Schicht-Multi-Flaschen untergebracht wodurch fünfmal das Wachstum Oberfläche zur Kultivierung von Zellen sein. Darüber hinaus mit einem Anstieg in der &quot;Go-Green&quot; Bewusstsein ist Optionen, um das Abfallaufkommen zu reduzieren höchst wünschenswert. In dieser Hinsicht gibt es einen 38% (5, T-175 Flaschen wiegen ~ 640g, während einer, 5-Schicht-Multi-Flask wiegt ~ 400g) Rückgang des Abfallaufkommens mit Multi-Flaschen im Vergleich zu T-175 Flaschen und diese Vorteile führen in Abfällen Lager-und Entsorgungskosten und führen zu wirtschaftlichen Einsparungen für den Benutzer zu verringern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagens / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 3-Schicht-Tissue Culture-behandelten 525cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BD Biosciences Cell Culture - BD Falcon Multi-Flaschen</a> </td></tr><tr><td> 5-Schicht-Tissue Culture-behandelten 875cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353144 </td></tr><tr><td> 100ml Pipette </td><td> BD Biosciences </td><td> 357600 </td></tr><tr><td> 10 ml Pipette </td><td> BD Biosciences </td><td> 357551 </td></tr><tr><td> 5 ml Pipette abgesaugt </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357501 </td></tr><tr><td> 50 ml Polypropylen-konischen Rohr </td><td> BD Biosciences </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> T-175 Kolben Tissue Culture-behandelten </td><td> BD Biosciences </td><td> 353028 </td></tr><tr><td> Gram Kristallviolett </td><td> BD </td><td> 212525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> Sigma </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Tryptose Phosphat-Bouillon </td><td> Sigma </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> BHK-21 Zellen </td><td> Sigma </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> Hep-G2, LNCaP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Polystyrolkugel </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> Bio-Flex Profile Analyzer </td><td> Nova Biomedical </td><td></td></tr></tbody></table>

scale-up of mammalian cell culture using a new multilayered flask

Eine wachsende Zahl von Zell-basierte Anwendungen erfordern eine große Anzahl von Zellen. Verwendung von Single Layer T-Flaschen, die ausreichend sind während der kleinen Erweiterung kann schwerfällig, umständlich und zeitaufwendig, wenn eine große Anzahl von Zellen notwendig sind. Um diesen Bedarf, die Leistung eines neuen mehrschichtigen Zellkulturgefäß eine einfache Skala Erleichterung der Gründung von Zellen aus einschichtigen T-Flaschen werden diskutiert. Die Kolben getestet werden in 3 - und 5-Schicht-Format und damit Kultur und vollständige Wiederherstellung der drei-bis fünfmal die Anzahl der Zellen im Vergleich zur T-175 Flaschen. Ein wesentliches Merkmal der BD Multi-Flask ist eine Mischung / Equilibrierung Port, schneller ermöglicht in-vessel Mischen sowie eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Reagenzien innerhalb und zwischen den Schichten der einzelnen Schiffe und konsequent zu produzieren Zellen, die in einer Umgebung, die kultiviert werden können ist kongruent zu T-175 Flaschen. Das Design dieser Multi-Flaschen ermöglicht auch convenient Pipette Zugang zur Zugabe von Reagenzien und Zellen direkt in den Kolben sowie eine effiziente Rückgewinnung von wertvollen Zellen und Reagenzien und reduziert das Risiko der Kontamination durch Gießen. Für Anwendungen, bei denen Gießen über Pipettieren bevorzugt wird, kann das Design für minimal residual Flüssigkeitsretention, um Verschwendung von wertvollen Zellen und Reagenzien zu reduzieren.

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Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Zellen spielen eine instrumentale und wachsende Rolle in der Forschung und der Entdeckung und Entwicklung neuer Therapeutika. Mit diesem steigenden Bedarf an größeren Anzahl von Zellen brauchen wir effizientere und effektivere Wege für den Anbau und die Ernte Anlage abhängigen Zellen. Eine mehrschichtige Kolben mit den richtigen Features können diesem Zweck dienen.

Scale-Up von Mammalian Cell Culture mit einem New Mehrschichtige Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

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Biology

37.5K Aufrufe.  BD Biosciences. Zellen spielen eine instrumentale und wachsende Rolle in der Forschung und der Entdeckung und Entwicklung neuer Therapeutika. Mit diesem steigenden Bedarf an größeren Anzahl von Zellen brauchen wir effizientere und effektivere Wege für den Anbau und die Ernte Anlage abhängigen Zellen. Eine mehrschichtige Kolben mit den richtigen Features können diesem Zweck dienen.

Serie: Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

Ole Isacson: Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung der Parkinson-Krankheit

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Entwicklung neuer therapeutischer Anwendungen mit Hilfe von Mikrofluidik

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Bestimmen Zellzahl während der Zellkultur mit dem Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Bestimmung der Säugetier-Zellzahlen, Größe der Zellen und Zell Gesundheit Mit dem Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Herstellung von Ratten Serum Geeignet für Säugetier Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-Finger-Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...