1. Preparación de las muestras <ol><li> Diluir la suspensión de células con ORFLO diluyente o un diluyente adecuado para que la concentración de células se encuentra dentro del rango de operación del instrumento (3.000 a 500.000 células / ml para Tipo casete M, o de 3.000 a 2.500.000 células / ml para casete Tipo S). </li><li> Una dilución de 1:5 a 1:20 (tipo cassette M) o ninguna dilución a 1:05 de dilución (cassette de tipo S) se recomienda para la mayoría de las líneas celulares de mamíferos, pero la dilución adecuada dependerá del tipo de célula y la densidad de siembra. El volumen requerido para un conteo exacto es de aproximadamente 75 l. </li></ol> 2. Las muestras de manejo de <ol><li> Gire a la Z Moxi pulsando el botón de encendido y la pantalla de inicio se mostrará. </li><li> Presione la bandeja hacia abajo e inserte un videocasete en la Z. Moxi La muestra con una pipeta 75μL ... Se mostrará la pantalla. </li><li> Pipetear una muestra de 75 l en el puerto de llenado de la cinta (óvalo azulmarcado 1 o 2, dependiendo de qué extremo del casete se inserta en el instrumento). Estas son las casetes desechables, que pueden ser utilizados para las pruebas 2. Nota: Coloque la punta de la pipeta directamente en la carga así a ~ 45 ° ángulo de modo que la punta está atrapado bajo el labio delantero del pozo. Cuando la dispensación, es importante que el vacío no &quot;salir adelante&quot; de la dispensación del líquido como podría causar bolsillos de aire entre en la cassette. Se recomienda tener una pequeña gota (el tamaño de entrada así) de forma fluida sobre el pozo durante la dispensación. </li><li> Para el recuento de células de mamíferos más, toque la pantalla en cualquier lugar para empezar. Para la cuantificación de partículas muy pequeñas (de 4 a 8 micras de diámetro promedio de tipo M y 3-8 micras de diámetro promedio de tipo S), el Z Moxi se puede ejecutar en modo de pequeñas partículas. Nota: el tipo de casete está indicado en la barra de negro en la parte superior de la pantalla. En este modo, Moxi Z establece la escala diámetro de 2 a 10 micras como el valor predeterminado y que realiza el recuento ucantar parámetros optimizados para la detección de células pequeñas. Pulse el botón de CONTACTO AQUÍ Pequeña modo de partículas (el cuadrado negro) para iniciar la prueba y se ejecutan en este modo. </li><li> El Z Moxi comenzará la prueba y los resultados del conteo de células se completará en aproximadamente 8 segundos (tipo casete M) o 15 segundos (cassette de tipo S). </li><li> El ajuste de curvas y cálculos MVI comenzará de forma automática y requiere sólo unos segundos adicionales. Cuando un ajuste adecuado se encuentra, los resultados entonces automáticamente se visualiza en la pantalla. </li><li> Para que el modo de adquisición de apertura de puerta por defecto, presione la curva de ajuste para activar el botón Cuenta en el modo de apertura de puerta. </li><li> En este punto la casete puede ser retirado de la unidad. </li></ol> 3. Gestión de datos <ol><li> Si la escala sección AutoMode está apagado, los resultados se muestran inicialmente para un recuento de ajuste de la curva en una escala de 2-34 micras de diámetro (tipo cassette M) o 2-26 μm (cassette de tipo S). Si el escalado Automode está activado, entonces el Z Moxi automáticamente la escala del eje horizontal (eje x) para el rango que está más cerca de la anchura de la población curva de ajuste asegurando al mismo tiempo todos los datos de ajuste de curva se muestra. </li><li> Si la escala sección AutoMode está apagado, para mostrar de forma manual los resultados en una resolución más alta, toque el icono de 2.26 micras (tipo M) o el icono de 2.18 micras (tipo S). Nota: El tipo de casete se indica en el cuadro azul en la parte superior izquierda de la pantalla. Esto se recomienda cuando contando células más pequeñas o partículas para mejorar tanto las capacidades de ajuste de curvas, así como la capacidad del usuario para discriminar visualmente matices de los datos. </li><li> Al aumentar la resolución horizontal, el botón de escala dinámicamente ajustar para permitir el ciclismo entre los rangos de escala disponibles eje x: 2-34, 2-26, 2-18 y 2-10 micras para el cassette de tipo M, o 2 -26, 2-18, y 2-10 micras de casete Tipo S. Esta función sólo está disponicable bifilar inmediatamente después de un recuento de células. </li><li> Contar información (células / ml) para el ajuste de curva cerrada o región se muestra en un recuadro negro bajo el lado izquierdo del histograma. El tamaño medio de información de la célula se muestra en el recuadro negro bajo el lado derecho del histograma. </li><li> El valor monetario se muestra un cuadro azul en la parte superior derecha del histograma. Si la prueba se ejecute en modo de pequeña partícula, el MVI no se aplica y se mostrará como &quot;MVI = SPM&quot;. Además, si la concentración de células se encuentra fuera del rango de operación MVI, un mensaje de &quot;MVI = Fuera de rango&quot; en la pantalla. </li><li> Para guardar el histograma actual, toque en el icono de Hecho. Esto guarda los datos con el nombre de &quot;Prueba de XXX&quot; donde XXX es el número de prueba correspondiente. </li><li> Para manualmente la puerta del histograma, toque para cambiar el ajuste de curva recuento de los resultados de botón. Esto hace que el modo de adquisición de apertura de puerta por defecto. A continuación, deslice cada marcador de puerta azul para configurar las puertas o toque ºflechas e izquierdo y derecho (aparecen al tocar el marcador de puerta azul) para los ajustes finos de puerta Sólo las células entre los marcadores se cuentan. La escala vertical del histograma se escala automáticamente sobre la base de la amplitud de la población de la curva de ajuste. Para ajustar la escala vertical, deslizar la pantalla hacia arriba o hacia abajo en la región del histograma. </li><li> Pulse el botón de Cuenta cerrada resultados para devolver la pantalla al modo de ajuste de la curva y que el modo de ajuste de la curva por defecto el modo de adquisición. </li><li> A continuación, pulse el icono de Listo para guardar los resultados y volver a la pantalla de inicio. Para eliminar los resultados, presione el icono de eliminar en cualquier momento para eliminar permanentemente los resultados de la prueba. </li></ol> 4. Análisis de los datos adquiridos con anterioridad <ol><li> Para abrir una prueba de guardado, pulse el icono de histograma en la pantalla de inicio. </li><li> Los iconos de hasta nueve histogramas guardados se mostrarán en la pantalla.Pulse el icono apropiado para la prueba de interés o presione la página o hacia abajo los iconos para ver más resultados de la prueba. </li><li> Cada histograma se abrió, ya sea en el modo de curva de ajuste o el modo de Conde Conde cerrada, dependiendo de cómo se salvó. En el modo de Conde cerrada, los marcadores de activación periódica se puede colocar como desee deslizando cada marcador de puerta azul de forma independiente. Puerta automática al tocar en la cima deseada. Toque para alternar entre el conde cerrada y los modos de ajuste de la curva Conde. </li><li> Pulse los iconos de zoom y Unzoom para ajustar la escala vertical del histograma. La escala vertical también se puede cambiar verticalmente deslizando un dedo sobre la pantalla de arriba (para aumentar) o hacia abajo (para disminuir). </li><li> Pulse el icono Eliminar para eliminar permanentemente los resultados de la prueba. </li><li> Pulse el icono de Listo paracerca de los resultados de la prueba y volver a la pantalla de inicio. (Nota: La vista ampliada no se guardarán.) </li></ol> 5. Transferencia de datos a un PC <ol><li> Los datos pueden transferirse a un PC utilizando la aplicación Moxichart Orflo oa través de transferencia USB conectando el Moxi Z cable USB a un PC o Mac. Para la transferencia de Bluetooth (MoxiChart), en primer lugar determinar el ID de la unidad Bluetooth pulsando en el icono de Bluetooth en la pantalla de inicio de la unidad de Moxi Z. </li><li> En el ordenador, abra la aplicación MoxiChart y haga clic en el icono Bluetooth en la esquina superior derecha. A continuación, seleccione el dispositivo que corresponde a la identificación de Bluetooth de la Z Moxi y seleccione una carpeta de destino para los archivos subidos. </li><li> Moxichart se transferirá automáticamente todos los archivos en el directorio especificado a través de la conexión Bluetooth. </li><li> Los archivos transferidos a través de Bluetooth (MoxiChart) o USB se puede abrir y análisiszado directamente con la aplicación MoxiChart o, debido a que tienen el formato. csv, se pueden abrir directamente en Microsoft Excel u otros programas de análisis de datos para el análisis, además, / personalizado. </li></ol> 6. Los resultados representativos Para evaluar la precisión y la exactitud de la Z Moxi, los conteos de células HEK-293, células HeLa, CHO-K1, levadura, Jurkat E6-1 células, las células PC12, y de precisión calibrados suspensiones de cuentas, con concentraciones que van desde las células 0-500,000 / ml (Tipo casete M) y 0-2-2.5e 6 células / ml (casete Tipo S) se contaron y se compararon mediante un Z2 Coulter y la Z. Moxi Todas las células de mamífero se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivó como se ha descrito anteriormente 7-11. Brevemente, las células fueron cultivadas en suspensión en 75 mm 2 frascos de cultivo de tejidos con medios de base de medio RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), las células del MEM (HEK-293, HeLa), o F12K (CHO-K1) células. Todos los medios se complementó con10% de suero fetal bovino y 100 U penicillin/100 estreptomicina g. Los matraces se mantuvieron en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. Las células se pasaron cada 3 días. Las células de levadura (X5, C. albicans, Vin 13) fueron donados y utilizados de inmediato conforme a lo dispuesto. Las concentraciones iniciales de muestra de ~ 500.000 células / ml para los datos de casetes Tipo M y ~ 2-2.5E 6 células / ml para el cassette del Type S se establecieron mediante el Z2 Coulter. Posteriores niveles de concentración teóricos se prepararon mediante diluciones seriadas con tampones fisiológicos (Isoton II o solución salina equilibrada de Hank). En cada concentración, muestras idénticas se midieron por ambos sistemas y se traza una contra la otra. Como se observa en la Figura 2, se produjo una fuerte correlación lineal (Tipo M r 2&gt; 0,9886, tipo S r 2&gt; 0,9781) entre los recuentos de todas las muestras. Las concentraciones también se compararon con las concentraciones de células esperados / teórica tanto con la Z y Z2 de la Moxi ( <strong&gt; Figura 3) y volvió a demostrar correlaciones lineales fuertes (tipo M r 2&gt; 0,9758, tipo S r 2&gt; 0,9774). Para evaluar la precisión, HEK-293 y el recuento de células HeLa se realizaron con el Z2 Coulter, Moxi Z, y un hemocitómetro. El coeficiente de variación (CV, n = 19) de los recuentos de células utilizando el Moxi Z (tipo cassette M), Z2 Coulter y un hemocitómetro se calcularon con la CV se mide a partir de 5 cuentas separadas en las 200.000-300.000 células por ml de rango. El pequeño CV medio (Figura 4) de la Z Moxi es comparable a la de la Z2 y es representativa de la alto nivel de precisión sólo alcanzable con Coulter tecnologías basadas en recuento. Dimensionamiento de la precisión del instrumento Moxi Z se evaluó la siguiente a través de la medición de los comprados, esferas de poliestireno de precisión calibrados. Valores medios de tamaño de partícula (n = 5) de Moxi Z se representaron frente tamaños fabricante reportados. Como puede verse in la figura 5, las medidas de Moxi Z siempre coincide con los valores del fabricante con una alta correlación lineal (r 2 = 0,9989). Más allá del tamaño y la información recuento, Moxi Z proporciona un reactivo libre, la evaluación general de salud cultivo celular de mamífero con un índice de viabilidad informó Moxi (MVI) valor. Este índice se genera a partir de una relación entre el número de células en la población de interés con respecto a los recuentos totales de partículas. Para demostrar las capacidades de medición de MVI, las lecturas de MVI (tipo cassette M) en comparación con el manual de normas y de citometría de flujo en vivo / muerto técnicas de medición. Las poblaciones de los muertos (&lt;10% viable) HEK-293 y las células HeLa fueron creados a través de las incubaciones durante la noche de las células vivas en un fluoruro de sodio en nutrientes libre, que contiene el diluyente (Isoton II, Beckman Coulter) a 37 ° C. Controlar los niveles de viabilidad teórica fueron preparados por ratiometrically concentraciones conocidas de la mezcla de células vivas y muertas. Res.ulting soluciones fueron analizadas para niveles de viabilidad por duplicado con los recuentos de ambos hemocitómetro y las mediciones del citómetro de flujo. Mediciones hemocitómetro se hicieron usando una tradicional mezcla 50/50 de 0,1% de solución azul de tripano y las células. Mediciones de citometría de flujo se hicieron usando un citómetro de Guayaba PCA (Merck) utilizando el reactivo Viacount y el fabricante especifica-protocolo (Merck). Como se muestra en la Figura 6, los valores de correlación de Pearson (R 2) &quot;del ajuste lineal de los datos MVI a análogos porcentajes hemocitómetro viabilidad para&quot; células HEK y células HeLa fueron de r 2 = 0,9937 y 2 r = 0,9728, respectivamente. Estos resultados demuestran que este enfoque proporciona información de referencia cultural de la salud a través de una amplia gama de viabilidades celulares que se comparan favorablemente con las mediciones en vivo / muerto obtenidos mediante un citómetro de flujo o un hemocitómetro. Tablas y Figuras (De Dittami et al, 2011). 15: Figura 1. De película delgada Conteo Coulter: La corriente eléctrica pasa a través de la Zona de la célula de detección de la casete de película delgada. Como las células fluir único archivo a través de la CSZ, los aumentos momentáneos de voltaje se miden por el Z. Moxi <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig2.jpg" /> Figura 2. Moxi recuentos Z son comparables a Coulter Z2 recuentos. Recuentos idénticas de suspensiones de células y el talón se contaron usando tanto un Z2 Coulter y la Z. Moxi Promediado valores de recuento (n = 3-4) de los recuentos de Moxi Z se representan con respecto a la Coulter Z2 correspondientes cuentas y valores de r 2 del ajuste lineal se determinaron. A) Tipo M casete - intervalo de concentración de 0 - 500.000 células / ml. B) Tipo de cassette S - rango de concentración de 0 - 2-2.5E 6 / Bares ml.Error indican ± 1 desviación estándar. Figura 3. Moxi mediciones de concentración de Z vs concentraciones teóricas de células. A) Tipo de cassette M - Los valores teóricos de concentración fueron preparados a partir de diluciones seriadas de una cantidad inicial de 500.000 células / ml de muestra B) Tipo S de cassette -. Los valores teóricos de concentración fueron preparados a partir de diluciones seriadas de un inicial 2 - 2.5E 6 células / ml de muestra. Barras de error indican ± 1 desviación estándar. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig4.jpg" /> Figura 4. Coeficiente de variación para el Z2 Coulter, Moxi Z (tipo cassette M), y el hemocitómetro. El coeficiente de variación (CV, n = 19) de HEK-293 y el recuento de células HeLa para cada método se calcularon con CV medidos a partir de 5 por separado cargos de HEK-293 y las células HeLa en el 200.000 - 300.000 células por ml de rango. Barras de error indican ± 1 desviación estándar. Figura 5. La precisión de las mediciones de tamaño de partícula usando Moxi Z-Moxi Z mide el tamaño de grano (tipo cassette M) vs fabricante informó de tamaño de las perlas. Barras de error indican ± 1 desviación estándar. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig6.jpg" /> Figura 6. Cultura Evaluación de la Salud con MVI - Comparación de las mediciones de MVI (tipo cassette M) y la viabilidad de Guayaba PCA Viacount frente visuales, del azul tripán cuenta la viabilidad teñidas utilizando un hemocitómetro.

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Gregory M. Dittami y el Excmo Ayliffe son empleados de las Tecnologías de Orflo, la compañía que diseñó, fabrica y vende el Moxi Z. Richard D. Rabbitt ofrece a tiempo parcial, la experiencia de consultoría pagados a las Tecnologías de Orflo. La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por las tecnologías de Orflo.

La aplicación del enfoque subyacente Coulter pueden ser altamente determinista de la precisión global de las mediciones. Un área crítica es la corrección de los recuentos de células primas para &quot;eventos coincidencia&quot; donde dos o más células simultáneamente pasan a través de la abertura y se mide como un evento eléctrico único. &quot;Eventos coincidencia&quot; contribuir a un error que varía en función de un número de factores incluyendo el tamaño celular y el grado de agrupamiento (Davis et al 1967) 6. Como resultado, la corrección de coincidencia necesaria para cualquier muestra dada no se puede predecir, variando ampliamente entre tipos de células / partícula e incluso entre diferentes culturas de tipos de células idénticas. Establecido teoría, basada en las publicaciones iniciales por Coulter, consiste en aplicar un ajuste logarítmica de los recuentos primas basadas en el número de eventos observados y una determinada empíricamente, de partícula específica del factor de corrección, z. Si bien el número exacto puede ser realizado con la tel algoritmo de corrección, se limita en su aplicación práctica, debido a las grandes variaciones en los valores de z entre tipos de células y la correspondiente dificultad en predecir con exactitud su valor. Aquí, utilizando la &quot;verdadera&quot; recuento de células identificadas por el ajuste de la curva Moxi Z en conjunción con el algoritmo de corrección de coincidencia, el Z Moxi dinámicamente corrige coincidencia para alcanzar las concentraciones reales. En comparación con los resultados obtenidos con alta gama Coulter Z2, el Z Moxi cuenta comparables producidas a través de un rango de concentración de 0 a 500.000 células / ml (tipo cassette M) y 3000 - 2-2.5E 6 células / ml (cassette de tipo S) . Además, el Z Moxi logra esta precisión recuento con un coeficiente bajo similar de variación en los recuentos y una precisión en partículas de tamaño que es característico del patrón oro, Coulter-técnica en el recuento de células. Por otra parte, los datos presentados aquí indican que la Z Moxi pueden proporcionar información valiosacon respecto a la salud general de los cultivos celulares. El Z Moxi aprovecha el enfoque de ajuste de curvas con un algoritmo de software propietario para determinar esta evaluación de seguridad y salud. Los cambios morfológicos asociados con la muerte celular, como blebbing, separándose y distorsiones volumétricas (Kataoka y Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) 12-14, hacen posible que el Moxi-Z para distinguir las diferencias entre los impedimetric viven las poblaciones y las poblaciones de células muertas / escombros. El valor monetario es generado por el análisis de la distribución del tamaño de la cultura / partícula para identificar las contribuciones relativas de partículas de desechos, reducidos células necróticas, y la curva de la población equipada célula de interés. El valor MVI lo refleja un índice de población o medida radiométrica de los recuentos de población monodispersas con respecto al perfil de partícula población general. Este valor se hace mediante algoritmos ajustados en función de las estadísticas basadas en la población y las observaciones empíricas. Because la MVI mira a otros parámetros que los enfoques de tinción tradicionales, no se espera para duplicar estas técnicas sino que proporciona una vista alternativa valiosa en la salud de un cultivo de células, particularmente con respecto a los restos y contaminantes microbianos. En resumen, el contador de células Moxi-Z es un instrumento de ultra sobremesa pequeño que proporciona ensayos precisas y reproducibles de recuento de células, el tamaño de celda, y la salud de células utilizando el Principio Coulter y de ajuste de curvas algoritmos de software combinada con una tecnología de sensores patentada de película delgada . Con el cassette de tipo M es capaz de contar partículas que van desde 4 - 25 micras de diámetro (rango dinámico de 2 - 34 micras), en 8 segundos. Con el casete Tipo S es capaz de contar partículas que van desde 3 - 20 micras de diámetro (rango dinámico de 2 - 26 micras), en 15 segundos. Además, el Moxi-Z lleva a cabo evaluaciones de salud sin el uso de reactivos. Es inte mucho menos trabajonsive y subjetivos que el recuento manual. En comparación con la norma recuento Coulter, la Moxi es más rápido, significativamente menor, proporciona más información, requiere un mantenimiento considerablemente menor, es más fácil de usar, y es una fracción del coste.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> ORFLO diluyente </td><td> ORFLO </td><td> MXA006 </td><td></td></tr><tr><td> Casete dispensador </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Almacena hasta 25 casetes para una cómoda dosificación </td></tr><tr><td> Cable USB </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Conecta instrumento para PC / Mac o adaptador de corriente </td></tr><tr><td> Adaptador de corriente (modelos de Estados Unidos y la Unión Europea solamente) </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Conecta el cable USB a una toma de CA </td></tr><tr><td> USB Flash Drive </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Tiendas Moxi Z de software y manual del usuario </td></tr><tr><td> Cuentas Calibration Check </td><td> ORFLO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cassette de calibración electrónica </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Cassette de electrónica para verificar el funcionamiento correcto del sistema y de calibración </td></tr></tbody></table>

determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the moxi z mini automated cell counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

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Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

El Moxi Z contador automático de células en miniatura es un instrumento novedoso que combina el Principio Coulter con la tecnología patentada de sensor de película delgada y un algoritmo de software propietario para realizar el dimensionado y el recuento de un amplio rango de tamaño de partículas, así como para determinar el estado general de salud de monodispersas cultivos de células de mamíferos. Este protocolo se describe el uso de este instrumento para contar y evaluar la salud de los cultivos celulares.

Determinación del recuento de células de mamíferos, el tamaño celular y la salud de la célula mediante el Moxi Z Mini contador automatizado de células

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A largo plazo de imágenes usando las células de mamíferos Wide-Field Microscopía

Investigación

Biología

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Determinar el número de células durante el cultivo celular utilizando el contador de células Cetro

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the calcium-binding protein known as calmodulin (CaM)1,2. CaM is involved at multiple levels in almost all cellular processes, including apoptosis, metabolism, smooth muscle contraction, synaptic plasticity, nerve growth, inflammation and the immune response. A number of proteins help regulate these pathways through their interaction with CaM. Many of these interactions depend on the conformation of CaM, which is distinctly different when bound to Ca2+ (Ca2+-CaM) as opposed to its Ca2+-free state (ApoCaM)3.
While most target proteins bind Ca2+-CaM, certain proteins only bind to ApoCaM. Some bind CaM through their IQ-domain, including neuromodulin4, neurogranin (Ng)5, and certain myosins6. These proteins have been shown to play important roles in presynaptic function7, postsynaptic function8, and muscle contraction9, respectively. Their ability to bind and release CaM in the absence or presence of Ca2+ is pivotal in their function. In contrast, many proteins only bind Ca2+-CaM and require this binding for their activation. Examples include myosin light chain kinase10, Ca2+/CaM-dependent kinases (CaMKs)11 and phosphatases (e.g. calcineurin)12, and spectrin kinase13, which have a variety of direct and downstream effects14.
The effects of these proteins on cellular function are often dependent on their ability to bind to CaM in a Ca2+-dependent manner. For example, we tested the relevance of Ng-CaM binding in synaptic function and how different mutations affect this binding. We generated a GFP-tagged Ng construct with specific mutations in the IQ-domain that would change the ability of Ng to bind CaM in a Ca2+-dependent manner. The study of these different mutations gave us great insight into important processes involved in synaptic function8,15. However, in such studies, it is essential to demonstrate that the mutated proteins have the expected altered binding to CaM.
Here, we present a method for testing the ability of proteins to bind to CaM in the presence or absence of Ca2+, using CaMKII and Ng as examples. This method is a form of affinity chromatography referred to as a CaM pull-down assay. It uses CaM-Sepharose beads to test proteins that bind to CaM and the influence of Ca2+ on this binding. It is considerably more time efficient and requires less protein relative to column chromatography and other assays. Altogether, this provides a valuable tool to explore Ca2+/CaM signaling and proteins that interact with CaM.

Calmodulin (CaM) pull-down assay is an effective way to investigate the interaction of CaM with various proteins. This method uses CaM-sepharose beads for efficient and specific analysis of CaM-binding proteins. This provides an important tool to explore CaM signaling in cellular function.

Desplegable de proteínas de unión a calmodulina

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Generación de plásmidos vectores que expresan proteínas de la bandera de etiquetado bajo la regulación del promotor factor de elongación humano-1α Usando Asamblea Gibson

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...