Los autores agradecen donaciones R03DC8200, R01DC9616 y R01DC5788 del Instituto Nacional de la Sordera y Otros Desórdenes de la Comunicación para el soporte del desarrollo del modelo sintético.

La secuencia de fabricación (ver Fig. 1.) Consiste en hacer moldes de las capas del modelo vocal veces, de forma secuencial de fundición capas de silicona, y el montaje de los modelos para la prueba. El modelo tiene cuatro capas distintas: el cuerpo, el ligamento, la lámina propia superficial, y el epitelio, además de una única fibra. Una capa de refuerzo se agrega para facilitar la colocación precisa de las capas individuales para el modelo de las cuerdas vocales. Las definiciones de modelo geométrico de parámetros se muestran en la figura. 2, con valores de los parámetros del modelo actual en la tabla 1. En las siguientes secciones, diferentes proporciones de mezcla de silicona se especifican para las diferentes capas, las cuales producen propiedades de los materiales que son similares a los reportados para el tejido humano de las cuerdas vocales en el régimen de pequeñas deformaciones 13 (ver Tabla 2). 1. Molde de fabricación y la preparación <ol><li> Crear modelos sólidos de tres capas de las cuerdas vocales: Supelámina propia rficial, ligamentos, y las capas del cuerpo. Esto se suele hacer mediante la creación de 3D diseño asistido por ordenador (CAD) con las geometrías de los modelos que desee, la exportación de los modelos CAD como la estereolitografía (STL), y el envío de los archivos de STL para un taller de maquinaria a medida para la creación rápida de prototipos. </li><li> Crear una forma del molde en forma de caja con finas piezas de material acrílico. Las dimensiones aproximadas (no crítico) son 2,54 cm de alto x 5,72 cm de ancho x 6,35 cm de profundidad. Que la parte inferior de la forma mediante la adhesión a una placa plana de acrílico. Selle todos los bordes interiores con grasa de vacío. </li><li> Coloque una pequeña cantidad de grasa de vacío en la parte lateral del modelo sólido de la geometría deseada (es decir, el cuerpo, el ligamento, o la lámina propia superficial). Presione modelo en el fondo de la cavidad del molde, lado vacío de grasa hacia abajo, de modo que la grasa de vacío se mantiene la pieza en su lugar. Liberalmente capa forma del molde y modelo sólido con el agente de liberación. Usando una brocha de pintura, asegúrese de agente de liberación alcanza a todos los rincones dela cavidad del molde de la forma. </li><li> Mezcla de 10 partes A y B una parte de Smooth-Sil 950 de goma de silicona platino (partes medido por peso) en un recipiente que tiene espacio suficiente para la expansión. Para eliminar el aire que se formen burbujas lugar molde con caucho de silicona curado en una cámara de vacío y reducir la presión (por ejemplo, a alrededor de 26 pulgadas de Hg por debajo de la presión atmosférica) durante aproximadamente tres minutos (o más o menos según sea necesario). Quitar silicona desgasificado de la cámara y se vierte en la cavidad del molde forma. Coloque el molde de silicona curado en cámara de vacío y desgasificación de nuevo. Eliminar de la cámara de vacío y el lugar en una superficie nivelada. Deje que cure durante 24 horas y eliminar el moho de la forma del molde. </li><li> Repita los pasos 1.1 a 1.4 para crear moldes para cada una de la lámina propia superficial, ligamento, y las capas del cuerpo. </li><li> Cortar el molde del ligamento capa en el centro de la cara medial en la dirección antero-posterior con una navaja de afeitar para permitir la inserción de la fibra. </li></ol> 2. De fundición of cada capa <ol><li> Capa de cuerpo: Aplique una capa delgada de agente de liberación de la cavidad del cuerpo del molde con el pincel. Mezcle una parte B y en una parte A del Ecoflex 00-30 Silicona Platino Supersoft (en peso). Añadir un diluyente de silicona parte (en peso) para reducir la rigidez eventual curado del material. Mezclar durante 30 segundos y lugar en la cámara de vacío durante un minuto para eliminar el aire atrapado. Retire la mezcla de vacío y se vierte en la cavidad del molde del cuerpo, pero no se llene hasta la parte superior de la cavidad del molde entero. Coloque en el horno a 250 ° F durante 30 minutos. Retire del horno y dejar enfriar. </li><li> Copia de seguridad: Mezcle una parte B y en una parte A de la piel del dragón y añadir un diluyente de silicona parte (en peso). Mezclar enérgicamente durante 30 segundos, el lugar en el vacío durante 1 minuto, y se vierte en la cavidad del molde del cuerpo hasta la saciedad. Coloque en el horno a 250 ° F durante 30 minutos. Retire el molde del horno y dejar enfriar. Retire el modelo del molde, se deja enfriar a temperatura ambiente, y eliminar todo agente de liberación de la superficie dela capa del cuerpo con una toalla de papel. </li><li> Capa de ligamento: Aplique una capa delgada de agente de liberación en la superficie de la cavidad del molde con el ligamento pincel. Coloque un hilo de 30 cm en el molde, presionando en el corte de la navaja de afeitar. Mezclar bien una parte B y en una parte A del Ecoflex 00-30 y cuatro partes de diluyente de silicona (en peso). Lugar en la cámara de vacío para eliminar las burbujas de aire y verter la mezcla en la cavidad del molde de los ligamentos. </li><li> Ligamento Layer (continuación): Pulse el cuerpo de respaldo de modelo (de los pasos 2.1.1 y 2.1.2) en la cavidad del molde ligamento. Comenzar la inserción de un lado y suavemente pasar a la otra para que el modelo lleva el exceso de silicona curado y las burbujas de aire de la cavidad del molde. Si hay burbujas de aire, retire el modelo de la cavidad del molde, rellenar con silicona no curada, y repita el modelo de presión en el molde. Ponen el molde en el horno durante 30 minutos, retirar y enfriar a temperatura ambiente. Retire el modelo del molde. Eliminar los agentes liberan el exceso con una toalla de papel. </li><li> Lámina superficial de capa Propia: Aplique una capa delgada de agente de liberación en la lámina propia superifical (SLP) la superficie de la cavidad del molde con el pincel. Mezcle una parte B, una parte A del Ecoflex 00-30, y 8 partes más finas de silicona en peso. Vacío como se hizo anteriormente y se vierte en la cavidad del molde SLP. Utilice el mismo proceso descrito en el paso 2.1.4 para insertar el modelo de los ligamentos, el cuerpo y el apoyo en la cavidad del molde lámina superficial propia. Coloque en un horno a 250 ° F y la cura de una hora. Retirar del horno y dejar enfriar. Retire el modelo lentamente y con mucho cuidado para que la lámina propia superficial se mantiene intacta. </li><li> Capa de epitelio: Coloca el vocal modelo de veces sobre una superficie plana con el retroceso. Retire el material de apoyo con una navaja de afeitar. Suspender las discusiones en el aire conectando a un objeto de mayor altura que el modelo. Mezcle una parte B y una parte una piel de dragón con una parte de diluyente de silicona, mezcla, de vacío, y luego verter sobre el modelo y deje curar por ele horas. Repita el proceso para crear una capa más gruesa. Retire el exceso de material con una navaja de afeitar. </li><li> Opcional: si cada capa se desea un color diferente (por inspección visual de las diferentes capas), añadir colorante a la parte B de cualquiera de los Ecoflex o la piel del dragón durante el proceso de mezcla. </li><li> Opcional: Si los datos de las propiedades del material será recogido, crear muestras de tracción y reológicas de forma simultánea con la fabricación de cada capa del modelo. Para ello, vertiendo el material no curado adicional en los moldes de liberación del agente tratados de la forma deseada material de muestra y el tamaño de la propiedad. </li><li> Opcional: Si las mediciones de espesor de la capa se desea, cortar una sección transversal de la modelo con una navaja de afeitar y examinar con el microscopio. </li></ol> 3. La preparación del modelo final de las pruebas <ol><li> Monte cada completado el modelo de las cuerdas vocales en una placa de acrílico de montaje aplicando primero una capa fina de pegamento de silicona en la parte posterior (lateral) y secundarios (anterior-posterior) las superficies del modelo. Inserte el modelo en el corte de la placa de montaje empotrado. Alinear a la superficie del modelo medial con la parte superior de la placa de acrílico. Limpie el exceso de pegamento. Permitir pegamento para secar durante una hora. </li><li> Aplique polvo de talco a la superficie del modelo para reducir la pegajosidad de la superficie. </li><li> Para el seguimiento de la superficie medial utilizar un rotulador de punta fina para marcar puntos en el modelo. Mejores resultados se obtienen si el marcado se lleva a cabo después de la aplicación de polvo de talco. </li><li> Coloque tornillos largos a través de los agujeros de la placa de montaje con los extremos roscados apuntando hacia el modelo al que será el modelo existente pares. Sentar las discusiones sobre los pernos. Poner espuma de celda cerrada sobre los pernos para evitar posibles agujeros de aire. </li><li> Par este modelo preparado con otro modelo de las cuerdas vocales que ha sido igualmente montado en un soporte de acrílico con los pasos 3.1 y 3.2. Apriete los tornillos para comprimir la espuma y traer las superficies medial juntos hasta que el deseo de pre-vibratoria brecha se alcanza. Asegúrese de que los dos conjuntos de hilos se colocan over los pernos y se extienden hacia afuera de las placas de acrílico en la dirección antero-posterior. </li><li> Montaje vocal par de veces en el tubo de suministro de aire. </li><li> Ate los hilos anteriores para formar un bucle. Repita el procedimiento para la rosca posterior. Cuelgue el peso deseado en los circuitos de forma simultánea. </li><li> Modelos ya están listos para las pruebas y la recogida de datos. </li></ol> 4. Resultados representante Los datos de la respuesta vibratoria de un modelo creado con este proceso de fabricación son los siguientes; estos resultados son típicos. Con una tensión de aproximadamente 31 g aplica a las fibras, la presión de inicio fue de 400 Pa. A una presión subglótica del 10% por encima de la presión de inicio (440 Pa), el modelo vibra a 115 Hz con una velocidad de flujo glotal de 210 ml / s. Estos valores están en buen acuerdo con los valores reportados para los humanos (Tabla 3). Uso de alta velocidad para analizar el movimiento videoquimografia modelo mostró evidencia de una diferencia de fase entre el superior demárgenes ª inferior, es decir, el margen superior oculta el margen inferior durante la fase abierta del período de vibración (Fig. 3). Trayectorias extraída de las imágenes en estéreo de los puntos se aplica a las superficies medial e inferior del modelo de las cuerdas vocales mostraron que el modelo exhibió una alternancia convergente-divergente perfil típico de la fonación humana, un movimiento de la mucosa como una ola, y una baja inferior- movimiento superior a los modelos anteriores (Fig. 4). <img alt="Tabla 1." src="/files/ftp_upload/3498/3498table1.jpg" /> Tabla 1. Los valores del modelo de parámetros geométricos. <img alt="Tabla 2." src="/files/ftp_upload/3498/3498table2.jpg" /> Tabla 2. Proporciones de mezcla en peso y como resultado el módulo de Young de las secciones individuales del modelo de las cuerdas vocales. EF y DS designar de silicona a partir de Ecoflex y la piel del dragón, Respectivamente 14. <img alt="Tabla 3." src="/files/ftp_upload/3498/3498table3.jpg" /> Tabla 3. Comparación entre el humano y sintético vocal respuestas vibratorias veces. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3498/3498fig1.jpg" /> Figura 1. Sintético vocal proceso de fabricación de doble modelo. CAD-derivados de modelos sólidos (panel izquierdo) se utilizan para crear los moldes (panel central) para cada capa. Cada capa es entonces fundido, comenzando con la capa del cuerpo y terminando con la capa de epitelio (panel de la derecha, con cada capa de &quot;pelar&quot; para la visibilidad). Después de la fabricación, los modelos están montados en placas de acrílico para la prueba. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3498/3498fig2.jpg" /> Figura 2. Sintético vocal sección transversal doble modelo. Distintas del cuerpo, la lámina propia superficial, ligcapas Ament y el epitelio se muestran. Parámetros definen la geometría de modelo vocal veces. Esta cifra se escala para la representación clara de las definiciones geométricas. Aplicación de los valores de parámetros en la Tabla 1 se traducirá en una forma ligeramente diferente a lo que se muestra aquí. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3498/3498fig3.jpg" /> Figura 3. Kymogram de alta velocidad de la vibración del modelo. Las estimaciones para la ubicación de los márgenes superior e inferior se muestran en color las líneas punteadas. Diferencias de fase entre los márgenes superior e inferior son evidentes. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3498/3498fig4.jpg" /> Figura 4. Perfil de la superficie medial del modelo sintético cuerdas vocales en un acuerdo de hemilaringe, capturado en dos instancias diferentes de tiempo, mientras que vibra. Marcadores de tinta se colocaron en la superficie medial (como shpropia en la imagen derecha), utilizando imágenes sincronizadas dos cámaras de alta velocidad, y el seguimiento a lo largo del ciclo vibratorio. La parcela izquierda muestra la glotis convergentes durante la fase de apertura y de la parcela derecha muestra la glotis divergentes durante la fase de cierre.

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	<li>Hirano, M., Kakita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover-body+theory+of+vocal+fold+vibration.">Cover-body theory of vocal fold vibration.</a> Speech Science: Recent Advances. , 1-46 (1985).</li><li>Pickup, B. A., Thomson, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+structures+of+the+near+field+flow+in+a+self-oscillating+physical+model+of+the+vocal+folds.">Coherent structures of the near field flow in a self-oscillating physical model of the vocal folds.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 121 (2), 1102-1118 (2007).</li><li>Drechsel, J. S., Thomson, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Myoelastic Aerodynamic Theory of Phonation. , 82-101 (2006).</li><li>Murray, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow-Induced Responses of Normal, Bowed, and Augmented Synthetic Vocal Fold Models. , (2011).</li><li>Baken, R. J., Orlikoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Clinical Measurement of Speech and Voice. , (2000).</li><li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Voice Production. , (2000).</li><li>Pickup, B. A., Thomson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+vibratory+response+of+idealized+vs.+magnetic+resonance+imaging-based+synthetic+vocal+fold+models.">Flow-induced vibratory response of idealized vs. magnetic resonance imaging-based synthetic vocal fold models.</a> Journal of the Acoustical Society of America. 128 (3), EL124-EL129 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este método de fabricación sintética vocal rendimientos veces los modelos de los modelos que exhiben un comportamiento similar a la vibración de las cuerdas vocales humanas. El multi-capa de los resultados en concepto de ventajas significativas sobre los anteriores diseños de modelos de una y dos capas de 3,6,8,15, en términos de reducción de presión de inicio y de movimiento del modelo mejorado (convergente-divergente perfil durante la oscilación, la mucosa de onda como el movimiento , y la reducci?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nombre del reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentarios</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Grasa de Alto Vacío</td&gt;<td&gt; Dow Corning</td&gt;<td&gt; 01018817</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pol-Ease 2300</td&gt;<td&gt; Polytek</td&gt;<td&gt; Pol-Ease2300-1</td&gt;<td&gt; Versión agente</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Smooth-Sil 950</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Smooth-Sil 950</td&gt;<td&gt; Fabricación de moldes de material</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Bomba de vacío</td&gt;<td&gt; Edwards</td&gt;<td&gt; E2M2</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cámara de vacío</td&gt;<td&gt; Kartell</td&gt;<td&gt; 230</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Presión Gage</td&gt;<td&gt; Marsh Bellofram</td&gt;<td&gt; 11308252A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Navaja</td&gt;<td&gt; Husky</td&gt;<td&gt; 008-045-HKY</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ecoflex 00-30</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Ecoflex 00-30</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Silicona Thinner</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Silicona Thinner</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; La piel del dragón</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; La piel del dragón 10 RÁPIDO</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tema</td&gt;<td&gt; Omega</td&gt;<td&gt; OmegaCrys</td&gt;<td&gt; Utilice únicamente las fibras claras</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tinte de silicona</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Silc Cerdo Negro</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pegamento de silicona</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Sil-Poxy</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Polvo de talco</td&gt;<td&gt; Familia occidental</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

synthetic, multi-layer, self-oscillating vocal fold model fabrication

El sonido de la voz humana se produce a través de la vibración inducida por el flujo de las cuerdas vocales. Las cuerdas vocales constan de varias capas de tejido, cada una con diferentes propiedades de los materiales 1. Producción normal de voz se basa en los tejidos sanos y los pliegues vocales, y se produce como resultado del acoplamiento entre la dinámica compleja aerodinámica, estructurales y acústicas fenómenos físicos. Trastornos de la voz afectan a hasta 7,5 millones de dólares anuales en los Estados Unidos solamente dos ya menudo resultan en los mercados financieros significativos, sociales, y otros de la calidad de vida de dificultades. Entender la física de producción de la voz tiene el potencial de beneficiar significativamente cuidado de la voz, incluida la prevención clínica, diagnóstico y tratamiento de trastornos de la voz. Los métodos existentes para el estudio de producción de la voz incluyen la experimentación in vivo con seres humanos y animales, la experimentación in vitro utilizando la laringe extirpada y modelos sintéticos, y el modelo computacionalING. Debido al acceso de instrumentos peligrosos y difíciles, en los experimentos in vivo son muy limitadas en su alcance. Extirpado la laringe experimentos tienen el beneficio de la anatomía y algo de realismo fisiológico, pero los estudios paramétricos involucran variables de las propiedades geométricas y materiales son limitados. Además, son por lo general sólo es capaz de hacer vibrar durante períodos relativamente cortos de tiempo (típicamente del orden de minutos). Para superar algunas de las limitaciones de los experimentos de la laringe extirpada, modelos sintéticos de las cuerdas vocales están emergiendo como una herramienta complementaria para el estudio de producción de la voz. Modelos sintéticos se pueden fabricar con cambios sistemáticos a las propiedades de la geometría y el material, lo que permite el estudio de la aerodinámica saludables y no saludables humanos fonatorio, dinámica estructural, y la acústica. Por ejemplo, se han utilizado para estudiar izquierda-derecha de las cuerdas vocales asimetría 3,4, el desarrollo de instrumentos clínicos 5, la aerodinámica de laringe 6-9, vocal doblar la presión de contacto 10, y la acústica subglótica 11 (una lista más completa se puede encontrar en Kniesburges et al. 12) Actuales modelos de síntesis de las cuerdas vocales, sin embargo, o bien han sido homogéneas (una sola capa los modelos) o han sido fabricados utilizando dos materiales de rigidez diferentes (dos capas de los modelos). Este enfoque no permite la representación de la actual estructura de múltiples capas de las cuerdas vocales humanas que uno juega un papel central en el gobierno de las cuerdas vocales inducida por el flujo de respuesta vibratoria. Por lo tanto, de una y dos capas sintéticas modelos de las cuerdas vocales han mostrado desventajas 3,6,8 como las presiones inicio superior a lo que son típicos de la fonación humana (presión de inicio es la presión pulmonar mínima requerida para iniciar la vibración), extrañamente grande-inferior movimiento superior, y la falta de una &quot;onda mucosa&quot; (una onda que viaja verticalmente que es característico de la salud humana a las vibraciones de las cuerdas vocales). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; En este trabajo, la fabricación de un modelo con múltiples capas de diferentes propiedades de los materiales se describe. Las capas del modelo simula la estructura de múltiples capas de las cuerdas vocales humanas, incluyendo epitelio, lámina propia superficial (SLP), intermedias y profundas de la lámina propia (es decir, el ligamento, la fibra se incluye la rigidez anterior-posterior), y el músculo, es decir ( , el cuerpo) en las capas 1. Los resultados se incluye que muestran que el modelo presenta características mejoradas de vibración más antes de una y dos capas de modelos sintéticos, incluyendo la presión de inicio más cercano a la presión de inicio humanos, limitación de movimiento inferior-superior, y la evidencia de una onda mucosa.

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Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

La metodología para la fabricación de los modelos de síntesis de las cuerdas vocales se describe. Los modelos son de tamaño natural y de imitar la estructura de múltiples capas de las cuerdas vocales humanas. Los resultados muestran que los modelos de auto-oscilar a presiones similares a la presión pulmonar y demostrar las respuestas inducidas por el flujo de vibración que son similares a los humanos de las cuerdas vocales.

Sintético, multi-capa, auto-oscilante Fabricación Vocal Modelo Doble

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

synthetic-multi-layer-self-oscillating-vocal-fold-model-fabrication

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K vistas.  Brigham Young University. La metodología para la fabricación de los modelos de síntesis de las cuerdas vocales se describe. Los modelos son de tamaño natural y de imitar la estructura de múltiples capas de las cuerdas vocales humanas. Los resultados muestran que los modelos de auto-oscilar a presiones similares a la presión pulmonar y demostrar las respuestas inducidas por el flujo de vibración que son similares a los humanos de las cuerdas vocales.

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Investigación

Bioingeniería

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

La producción de seda sintética araña a escala de laboratorio

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

Generación de Shear Adhesión Mapa Utilizando SynVivo redes microvasculares sintético

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigación De La Separación De Flujo Tridimensional Inducida Por Un Pólipo Modelo De Pliegue Vocal

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Construcción y caracterización de un Fold biorreactor Novela Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

El uso de la biología sintética para Ingeniero células vivas que interactúan con materiales programables

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

Un kit de herramientas de transcripción y traducción de Streptomyces de alto rendimiento para aplicaciones de biología sintética y productos naturales

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Expresión libre de células de proteínas de membrana en vesículas unilamelares gigantes

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy regeneration in synthetic cells. Reconstruction of a wide range of cellular processes, however, requires successful reconstitution of membrane proteins into the membrane of synthetic cells. While the expression of soluble proteins is usually successful in common CFE systems, the reconstitution of membrane proteins in lipid bilayers of synthetic cells has proven to be challenging. Here, a method for reconstitution of a model membrane protein, bacterial glutamate receptor (GluR0), in giant unilamellar vesicles (GUVs) as model synthetic cells based on encapsulation and incubation of the CFE reaction inside synthetic cells is demonstrated. Utilizing this platform, the effect of substituting the N-terminal signal peptide of GluR0 with proteorhodopsin signal peptide on successful cotranslational translocation of GluR0 into membranes of hybrid GUVs is demonstrated. This method provides a robust procedure that will allow cell-free reconstitution of various membrane proteins in synthetic cells.

Autor destacado: Reconstitución de proteínas de membrana en células sintéticas

This protocol describes the inverted emulsion method used to encapsulate a cell-free expression (CFE) system within a giant unilamellar vesicle (GUV) for the investigation of the synthesis and incorporation of a model membrane protein into the lipid bilayer.