Gli autori ringraziano Grants R03DC8200, R01DC9616 e R01DC5788 dal National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione per sostenere lo sviluppo del modello sintetico.

La sequenza di fabbricazione (vedi fig. 1) consiste nella realizzazione di stampi per vocale strati modello pieghevole, in modo sequenziale fusione strati di silicone, e il montaggio dei modelli per il test. Il modello dispone di quattro strati distinti: corpo, legamento, lamina propria superficiale, e l&#39;epitelio, oltre ad una singola fibra. Uno strato di rinforzo è, per facilitarne il posizionamento preciso dei singoli strati del modello vocale piega. Le definizioni dei parametri geometrici del modello sono mostrati in fig. 2, con i valori dei parametri per il modello corrente indicate nella tabella 1. Nelle sezioni che seguono, i rapporti di silicone diversi di miscelazione sono specificati per i diversi strati, questi producono proprietà dei materiali che sono simili a quelli riportati per i tessuti umani vocale piega al regime di piccole deformazioni 13 (vedi tabella 2). 1. Stampo di fabbricazione e preparazione <ol><li> Creare modelli solidi di tre strati vocali volte: Supelamina propria rficial, legamenti e strati del corpo. Questo è in genere fatto con la creazione di immagini 3D computer-aided design (CAD) i modelli con le geometrie desiderato, esportando i modelli CAD come stereolitografia (STL) i file e l&#39;invio del file STL ad un negozio di macchine su misura per la prototipazione rapida. </li><li> Creare una finestra di forma a stampo con sottili pezzi di materiale acrilico. Dimensioni approssimative (non critici) sono 2,54 centimetri di altezza × 5,72 centimetri di larghezza × 6,35 centimetri di profondità. Rendere il fondo del modulo aderendo ad una piastra in acrilico piatto. Sigillare tutti i bordi interni con grasso per vuoto. </li><li> Mettete una piccola quantità di grasso vuoto sulla parte laterale del modello solido della geometria desiderata (ad es, il corpo, il legamento, o lamina propria superficiale). Stampa modello in fondo della cavità dello stampo forma, grasso lato in depressione verso il basso, in modo che il grasso vuoto detiene la parte in posizione. Liberamente stampo forma cappotto e modello solido con distaccante. Utilizzando un pennello, garantire distaccante tocca tutti gli angoli dila cavità dello stampo forma. </li><li> Miscelare 10 parti A e una parte B del Liscio-Sil 950 platino in gomma siliconica (parti misurate in peso) in un contenitore che ha spazio sufficiente per l&#39;espansione. Per rimuovere le bolle d&#39;aria posto con la forma dello stampo in gomma siliconica non polimerizzato in una camera a vuoto e ridurre la pressione (ad esempio, a circa 26 mm Hg al di sotto della pressione atmosferica) per circa tre minuti (o più o meno, se necessario). Rimuovere silicone degasato da camera e versare nella cavità dello stampo forma. Luogo stampo in silicone non polimerizzato sotto vuoto in camera e degassare di nuovo. Rimuovi dalla camera a vuoto e posto su una superficie piana. Lasciare cura per 24 ore e togliere la muffa dalla forma dello stampo. </li><li> Ripetere i passi da 1,1 a 1.4 per creare stampi per ciascuna della lamina propria superficiale, legamenti e strati del corpo. </li><li> Tagliare strato stampo legamento al centro della faccia mediale della direzione antero-posteriore con un rasoio per consentire l&#39;inserimento di fibre. </li></ol> 2. Casting of ogni strato <ol><li> Corpo Layer: Applicare uno strato sottile di distaccante a cavità del corpo dello stampo con pennello. Mescolare una parte B e una parte di un Ecoflex 00-30 Silicone Platinum Supersoft (in peso). Aggiungere una parte più sottile di silicone (in peso) per ridurre la rigidità eventuale curato del materiale. Mescolare per 30 secondi e posto in camera da vuoto per un minuto per rimuovere l&#39;aria intrappolata. Rimuovere miscela dal vuoto e versare nella cavità dello stampo del corpo, ma non per riempire la parte superiore della cavità dello stampo intero. Mettere in forno a 250 ° C per 30 minuti. Togliere dal forno e lasciar raffreddare. </li><li> Supporto: Mescolare una parte B e una parte A di pelle di drago e aggiungere una parte più sottile di silicone (in peso). Mescolate energicamente per 30 secondi, posto nel vuoto per 1 minuto, e versare nella cavità dello stampo corpo fino a completo. Mettere in forno a 250 ° C per 30 minuti. Togliere muffa dal forno e lasciar raffreddare. Rimuovere il modello dallo stampo, lasciare raffreddare a temperatura ambiente, e rimuovere eventuali distaccante sulla superficie dello strato corpo con un tovagliolo di carta. </li><li> Strato legamento: Applicare uno strato sottile di distaccante sulla superficie della cavità dello stampo legamento con pennello. Mettere un filo di 30 cm di stampo spingendolo nel taglio del rasoio. Mescolare un B parte e una parte A del Ecoflex 00-30 e quattro parti di diluente in silicone (in peso). Posto in camera da vuoto per eliminare le bolle d&#39;aria e versare miscela nella cavità dello stampo legamento. </li><li> Legamento Layer (continua): Premere corpo-supporto del modello (da Piazza 2.1.1 e 2.1.2) nella cavità dello stampo legamento. Iniziare l&#39;inserimento da un lato e delicatamente passare agli altri in modo che il modello spinge il silicone in eccesso non polimerizzato e bolle d&#39;aria dalla cavità dello stampo. Se bolle d&#39;aria sono presenti, rimuovere il modello dalla cavità dello stampo, riempire con silicone non indurito, e ripetere premendo modello nello stampo. Stampo mettere in forno per 30 minuti, togliere e raffreddare a temperatura ambiente. Rimuovere modello da muffe. Rimuovere l&#39;eccesso di rilascio agente con un tovagliolo di carta. </li><li> Strato superficiale lamina propria: Applicare uno strato sottile di agente distaccante a superifical lamina propria (SLP) superficie della cavità dello stampo con il pennello. Mescolare una parte B, una parte A di Ecoflex 00-30, e 8 parti di silicone più sottile in peso. Vuoto come fatto in precedenza e versare nella cavità dello stampo SLP. Utilizzare lo stesso processo descritto al punto 2.1.4 per inserire il legamento-corpo-appoggio modello nella cavità dello stampo superficiale della lamina propria. Mettere in forno a 250 ° F e cura per un&#39;ora. Togliere dal forno e lasciare raffreddare. Rimuovere modello lentamente e con estrema cura in modo che la lamina propria superficiale rimane intatto. </li><li> Strato epitelio: Luogo modello vocale piega su una superficie piana con la marcia indietro. Rimuovere il materiale di supporto con un rasoio. Sospendere le discussioni in aria allegando ad un oggetto di maggiore altezza rispetto al modello. Mescolare una parte B e una parte A di pelle di drago con una parte di silicone più sottile, mescolare, vuoto, poi versatevi sopra il modello e lasciare cura per ile ora. Ripetere la procedura per creare uno strato più spesso. Rimuovere il materiale in eccesso con un rasoio. </li><li> Facoltativo: se ogni strato è voluto essere un colore diverso (per l&#39;ispezione visibile di diversi strati), aggiungere colorante a parte B o la Ecoflex o pelle di drago durante il processo di miscelazione. </li><li> Opzionale: Se i dati sulle proprietà dei materiali saranno raccolti, creare esemplari di trazione e reologiche in contemporanea con la fabbricazione di ogni strato del modello. Per farlo, versando in più materiale non polimerizzato in distaccante trattati con stampi di forma desiderato campione beni materiali e dimensioni. </li><li> Opzionale: Se le misurazioni dello spessore degli strati sono desiderati, tagliare una sezione trasversale del modello con un rasoio e controllare con il microscopio. </li></ol> 3. Preparazione del modello finale per i test <ol><li> Montare ognuno completato modello vocale piega in una piastra in acrilico di montaggio in primo luogo applicando un sottile strato di colla al silicone sul retro (laterale) e orizzontale (anterior-posteriore) le superfici del modello. Inserire il modello in taglio incasso della piastra di montaggio. Allineare la superficie mediale del modello con la parte superiore della piastra in acrilico. Togliere la colla in eccesso. Lasciare la colla cura per un&#39;ora. </li><li> Applicare polvere di talco sulla superficie del modello per ridurre appiccicosità superficie. </li><li> Per il monitoraggio della superficie mediale usare una bella penna a pennarello per segnare i punti del modello. I migliori risultati si verifica se la marcatura è fatta dopo l&#39;applicazione di polvere di talco. </li><li> Luogo bulloni lungo attraverso i fori della piastra di montaggio con le estremità filettate che puntano verso il modello a cui il modello esistente verrà abbinato. Posare le discussioni sui bulloni. Mettere in schiuma a cellule chiuse sopra i bulloni per colmare le eventuali lacune aria. </li><li> Coppia questo modello preparato con un altro modello vocale volte che è stato montato in modo simile a un titolare di acrilico con punti 3.1 e 3.2. Serrare le viti per comprimere la schiuma e portare le superfici mediale insieme fino alla pre-vibratorio divario desiderio è raggiunto. Garantire entrambe le serie di discussioni sono posti over i bulloni e le estendono verso l&#39;esterno dalle piastre in acrilico nella direzione antero-posteriore. </li><li> Monte coppia vocale piega sul tubo di alimentazione dell&#39;aria. </li><li> Legare i fili anteriore insieme per formare un anello. Ripetere l&#39;operazione per i fili posteriore. Appendere peso desiderato sugli anelli contemporaneamente. </li><li> I modelli sono ora pronti per il collaudo e raccolta dei dati. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Dati sulla risposta vibratoria da un modello creato con questo processo di fabbricazione sono i seguenti: questi risultati sono tipici. Con tensione di circa 31 g applicata alle fibre, la pressione insorgenza era di 400 Pa. Con una pressione subglottal del 10% l&#39;insorgenza di sopra della pressione (440 Pa), il modello vibrato a 115 Hz con una portata glottide di 210 ml / s. Questi valori sono in buon accordo con i valori riportati per quelle degli esseri umani (Tabella 3). Utilizzando ad alta velocità videokymography per analizzare il movimento modello ha mostrato evidenza di una differenza di fase tra il superioremargini ° inferiore, cioè, il margine superiore nascosto il margine inferiore durante la fase di apertura del periodo di vibrazione (Fig. 3). Traiettorie estratti da immagini stereo dei punti applicati alle superfici mediale e inferiore del modello vocale volte ha dimostrato che il modello esposto uno alternato convergente-divergente profilo che è tipico della fonazione umana, una mucosa movimento ondulatorio, e un minore inferiore- movimento superiore rispetto ai modelli precedenti (Fig. 4). <img alt="Tabella 1." src="/files/ftp_upload/3498/3498table1.jpg" /> Tabella 1. Modello di valori dei parametri geometrici. <img alt="Tabella2." src="/files/ftp_upload/3498/3498table2.jpg" /> Tabella 2. Rapporti di miscela in peso e conseguente modulo di Young delle singole sezioni del modello vocale piega. EF e DS designare silicone a base di Ecoflex e pelle di drago, Rispettivamente 14. <img alt="Tabella 3." src="/files/ftp_upload/3498/3498table3.jpg" /> Tabella 3. Confronto tra umani e sintetici vocale risposte volte vibratorio. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3498/3498fig1.jpg" /> Figura 1. Sintetico vocal fold processo di fabbricazione del modello. CAD-derivati ​​modelli solidi (pannello a sinistra) sono utilizzati per creare gli stampi (centrale) per ogni strato. Ogni strato viene poi gettato, a cominciare con il livello di corpo e terminando con lo strato di epitelio (pannello di destra, ad ogni livello &quot;pelati back&quot; per visibilità). Dopo la fabbricazione, i modelli sono montati su lastre acriliche per il test. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3498/3498fig2.jpg" /> Figura 2. Sintetico vocal fold sezione trasversale del modello. Corpo distinte, lamina propria superficiale, Ligstrati Ament, e l&#39;epitelio sono mostrati. Parametri definiscono vocal fold geometria del modello. Questa cifra è in scala di rappresentazione chiara delle definizioni geometriche. Applicazione dei valori dei parametri riportati nella tabella 1 si tradurrà in una forma leggermente diversa rispetto a quanto mostrato qui. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3498/3498fig3.jpg" /> Figura 3. Kymogram ad alta velocità di vibrazione modello. Le stime per la posizione dei margini superiori e inferiori sono mostrati in colori linee tratteggiate. Differenze di fase tra i margini inferiore e superiore sono evidenti. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3498/3498fig4.jpg" /> Figura 4. Profilo di superficie mediale del modello di sintesi vocale piega in una disposizione hemilarynx, catturato in due istanze diverse di tempo mentre vibrante. Marcatori inchiostro sono stati collocati sulla superficie mediale (come shproprio l&#39;immagine a destra), ripreso con due sincronizzato telecamere ad alta velocità, e monitorati nel corso del ciclo vibratorio. Il diagramma a sinistra mostra una glottide convergente durante la fase di apertura e la trama destra mostra una glottide divergente durante la fase di chiusura.

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Myoelastic Aerodynamic Theory of Phonation. , 82-101 (2006).</li><li>Murray, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow-Induced Responses of Normal, Bowed, and Augmented Synthetic Vocal Fold Models. , (2011).</li><li>Baken, R. J., Orlikoff, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Clinical Measurement of Speech and Voice. , (2000).</li><li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Voice Production. , (2000).</li><li>Pickup, B. A., Thomson, S. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo metodo di fabbricazione di sintesi vocale volte produce modelli modelli che mostrano un comportamento vibratorio simile a quella dei diritti umani corde vocali. Il multistrato risultati concetto in vantaggi significativi rispetto a quello precedente e due strati design modello 3,6,8,15, in termini di pressione e di movimento ridotta insorgenza modello migliorato (convergente-divergente profilo durante l&#39;oscillazione, delle mucose movimento ondulatorio , e ridotto inferiore cilindrata superiore). Il...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nome del reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commenti</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Grasso alto vuoto</td&gt;<td&gt; Dow Corning</td&gt;<td&gt; 01018817</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pol-Ease 2300</td&gt;<td&gt; Polytek</td&gt;<td&gt; Pol-Ease2300-1</td&gt;<td&gt; Distaccante</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Smooth-Sil 950</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Smooth-Sil 950</td&gt;<td&gt; Stampi di materiale</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pompa a vuoto</td&gt;<td&gt; Edwards</td&gt;<td&gt; E2M2</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vuoto Camera</td&gt;<td&gt; Kartell</td&gt;<td&gt; 230</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pressione Gage</td&gt;<td&gt; Marsh Bellofram</td&gt;<td&gt; 11308252A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Rasoio</td&gt;<td&gt; Husky</td&gt;<td&gt; 008-045-HKY</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ecoflex 00-30</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Ecoflex 00-30</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Silicone Diluente</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Silicone Diluente</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dragon Pelle</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Dragon Pelle 10 VELOCE</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thread</td&gt;<td&gt; Omega</td&gt;<td&gt; OmegaCrys</td&gt;<td&gt; Usare solo fibre chiaro</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Silicone Dye</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Silc Maiale Nero</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Colla in silicone</td&gt;<td&gt; Smooth-On</td&gt;<td&gt; Sil-Poxy</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Talco Polvere</td&gt;<td&gt; Famiglia occidentale</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

synthetic, multi-layer, self-oscillating vocal fold model fabrication

Suono per la voce umana è prodotta tramite le vibrazioni indotte nel flusso vocale piega. Le corde vocali sono costituiti da diversi strati di tessuto, ognuno con differenti caratteristiche dei materiali 1. Produzione di voce normale si basa su tessuto sano e corde vocali, e si verifica come conseguenza di accoppiamento complesse tra aerodinamica, dinamica strutturale, acustica e fenomeni fisici. Disturbi vocali interessare fino a 7,5 milioni ogni anno negli Stati Uniti da soli 2 e spesso sfociano in finanziaria significativa, sociali e altre qualità della vita di difficoltà. Comprendere la fisica della produzione di voce ha la possibilità di beneficiare in modo significativo la cura voce, compresa la prevenzione clinica, diagnosi e trattamento dei disturbi vocali. Gli attuali metodi per lo studio di produzione vocale includere nella sperimentazione in vivo utilizzando soggetti umani e animali, nella sperimentazione in vitro utilizzando laringi asportato e modelli sintetici, e il modello computazionaleing. A causa dell&#39;accesso strumento pericoloso e difficile, in esperimenti in vivo sono fortemente limitata. Esperimenti laringe escisse hanno il vantaggio del realismo anatomico e alcuni fisiologici, ma gli studi parametrici che coinvolgono le variabili delle proprietà geometriche e materiali sono limitati. Inoltre, sono in genere solo in grado di vibrare per periodi di tempo relativamente breve (in genere dell&#39;ordine di minuti). Superare alcune delle limitazioni di esperimenti asportati laringe, sintetici modelli vocali piega stanno emergendo come uno strumento complementare per lo studio di produzione vocale. Modelli sintetici possono essere fabbricati con cambi sistematici geometria e alle proprietà materiali, permettendo per lo studio dell&#39;aerodinamica umani sani e malsani fonatorio, dinamica strutturale, e l&#39;acustica. Ad esempio, essi sono stati utilizzati per studiare sinistra-destra piega vocale asimmetria 3,4, strumento di sviluppo clinico 5, l&#39;aerodinamica della laringe 6-9, vocAl duplice pressione di contatto 10, e l&#39;acustica subglottal 11 (una lista più completa si trova nel Kniesburges et al. 12) Esistenti sintetico modelli vocali volte, però, sono stati o omogenei (uno strato modelli) o sono stati fabbricati utilizzando due materiali di rigidità diverse (due strati modelli). Questo approccio non permette di rappresentazione del reale struttura multistrato delle corde vocali umane 1 che svolge un ruolo centrale nel governo vocal fold flusso indotta risposta vibratoria. Di conseguenza, uno e due strati di sintesi vocale modelli volte hanno esposto svantaggi 3,6,8 quali pressioni insorgenza superiore a quello che sono tipici di fonazione umana (pressione insorgenza è la pressione del polmone minimo necessario per avviare le vibrazioni), innaturalmente grandi dimensioni inferiori- moto superiore, e la mancanza di un &#39;&quot;onda mucosa&quot; (una verticale che viaggia onda che è caratteristica di sano vibrazione vocale volte). <pclass =&gt; &quot;jove_content&quot; In questo lavoro, realizzazione di un modello con strati multipli di diverse proprietà del materiale è descritto. Gli strati modello di simulare la struttura multi-strato delle corde vocali umane, tra cui l&#39;epitelio, lamina propria superficiale (SLP), intermedio e profondo lamina propria (cioè, legamento, una fibra è incluso per la rigidità anteriore-posteriore), e nel muscolo (cioè , corpo) livelli 1. I risultati sono inclusi che mostrano che il modello presenta migliori caratteristiche vibratorie più prima uno e due strati modelli sintetici, compresa la pressione insorgenza più vicina a pressione insorgenza umano, ridotto inferiore-superiore del movimento, e le prove di un&#39;onda mucosa.

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Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

La metodologia per la realizzazione di modelli di sintesi vocale volte viene descritta. I modelli sono a grandezza naturale e imitare la struttura multi-strato delle pieghe della voce umana. I risultati mostrano i modelli di auto-oscillare a pressioni paragonabili a pressione polmonare e dimostrare risposte vibratorio flusso indotto che sono simili a quelle di umani corde vocali.

Sintetico, Multi-Layer, Auto-oscillante Fabrication Vocal modello Fold

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

synthetic-multi-layer-self-oscillating-vocal-fold-model-fabrication

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K Views.  Brigham Young University. La metodologia per la realizzazione di modelli di sintesi vocale volte viene descritta. I modelli sono a grandezza naturale e imitare la struttura multi-strato delle pieghe della voce umana. I risultati mostrano i modelli di auto-oscillare a pressioni paragonabili a pressione polmonare e dimostrare risposte vibratorio flusso indotto che sono simili a quelle di umani corde vocali.

Video: Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Ricerca

Bioingegneria

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

Sintetico di produzione Spider Silk su scala di laboratorio

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

Generazione di Shear Adesione mappa usando SynVivo reti microvascolari sintetico

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigare la separazione tridimensionale del flusso indotta da un modello di polipo piega vocale

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Costruzione e caratterizzazione di un Fold bioreattore Novel Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Utilizzando biologia sintetica per Ingegnere cellule viventi che si interfacciano con materiali programmabili

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

Un toolkit di trascrizione-traduzione di streptomyces ad alto rendimento per la biologia sintetica e le applicazioni dei prodotti naturali

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Test dei biomarcatori delle urine sintetiche CRISPR-Cas per la diagnostica del cancro

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

Autore in primo piano: Ingegneria di strumenti molecolari per il rilevamento e l'imaging delle malattie

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.