Nuestro método utiliza la selección del rango de host y marcadores fluorescentes para la generación eficiente y sin problemas del virus de la vacuna recombinante en una variedad de tipos de células. Esta técnica combina la velocidad de la recombinación homóloga con la naturaleza sin cicatrices de la selección dominante transitoria. Además, alojamos la selección de rangos para eliminar la posibilidad de cambios inducidos químicamente.
Este método también se puede utilizar para modificar el virus de la vacuna u otros poxvirus para expresar genes extraños, por ejemplo, para generar vacunas. Si está realizando este protocolo solo con selección de fluorescencia, debe asegurarse de que está examinando suficientes virus para detectar recombinantes relativamente raros sin presión selectiva PKR. Este método se basa en la ganancia y pérdida de marcadores fluorescentes para seleccionar con éxito los virus que han adquirido los casetes de recombinación y para detectar virus que tienen recombinación sin cicatrices.
Para generar un vector de recombinación, primero agregue 17 microlitros de agua libre DNase, 1,2 microlitros de cada imprimación, cinco microlitros de tampón de reacción PCR 5x, ADN de plantilla y 0,5 microlitros de ADN polimerasa a un tubo pcR por amplicon. Agregue agua libre DNase adicional para llevar el volumen final de cada tubo a 50 microlitros. Y coloca los tubos en un termociclador.
Derretir el ADN a 98 grados Celsius durante 30 segundos antes de usar 25 rondas de un protocolo PCR de tres pasos como se indica. Para visualizar los productos de amplificación en un gel de 1% de agarosa, agregue 10 microlitros de cada producto de ADN y 2 microlitros de tampón de carga a cada pocólculo. Ejecute el gel durante una hora a ocho voltios por centímetro.
Al final de la carrera, utilice un kit de extracción de gel de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante para purificar en gel cada amplón. Eluda los amplicons de la columna con 50 microlitros de agua libre de DNase y centrifugación inmediata. Para linealizar un vector de clonación, primero agregue un microgramo del vector, 17 microlitros de agua libre DNase, 2 microlitros de búfer de reacción y 1 microlitro de EcoRI a un tubo durante una incubación de una hora a 37 grados Celsius.
Al final de la incubación, añadir 0,2 picomoles del vector linealizado 10 microlitros de agua libre DNase, y 10 microlitros de adn conjunto maestro mezcla a cada amplicon aislado. Incubar muestras a 50 grados Celsius durante una hora. Al final de la incubación, transformar E.coli químicamente competente con dos microlitros del producto ensamblado de acuerdo con los protocolos estándar.
Placa 100 microlitros de células transformadas en placas de agarosa LB suplementadas con 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 37 grados Celsius, seleccione colonias bien aisladas para la inoculación en el caldo de Luria complementadas con 100 microgramos por mililitro de ampicilina durante la noche a 37 grados Celsius y 225 revoluciones por minuto. A la mañana siguiente, usa un kit de miniprep plásmido para aislar los plásmidos.
Y comprobar la concentración y pureza del ADN en un espectrofotómetro. Para la generación de virus recombinantes, infectar una monocapa confluente de células adecuadas con el virus para ser recombinado en una multiplicidad de infección de uno en una placa de seis pozos. E incubar las células infectadas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante una hora.
Al final de la incubación, sustituya el sobrenadante de cada pozo por DMEM fresco y utilizando un reactivo de transfección disponible comercialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante. Añadir tres microgramos del vector de recombinación de interés a cada pozo. Coloque la placa en la incubadora durante 48 horas adicionales.
Antes de agrupar las células de cada condición de transfección en tubos individuales de 1,5 mililitros. A continuación, congelar y descongelar las celdas agrupadas tres veces antes de sonicar los lysates resultantes durante 15 segundos a una amplitud del 50%. A continuación, en serie 10 veces diluir el lisoto sonicado, cosechado de un 10 al 10 a la sexta concentración en DMEM fresco y añadir un mililitro de cada dilución a los pozos confluentes individuales de una línea celular competente de proteína quinasa R.
Coloque las células en la incubadora de cultivo celular durante una hora antes de reemplazar los sobrenadantes por un medio fresco y devolver las células a la incubadora de cultivo celular. Después de 24 a 48 horas, identifique los virus recombinantes por microscopía de fluorescencia. Las placas de virus recombinantes expresan fluorescencia roja debido a la integración del gen de fusión mCherry-E3L.
La placa purifica los virus recombinantes tres veces en células RK13 de tipo salvaje. Después de tres rondas de purificación de placa, infectar las células RK13+E3L+K3L con diluciones seriales de la placa de izado. Para identificar los virus colapsados, mediante microscopía de fluorescencia utilizando un sistema de imágenes adecuado equipado con cubos de filtro GFP y RFP.
A continuación, la placa purificar sólo el verde VC-R4, o placas E3L incoloras tres veces en las células RK13+E3L+K3L. Asegurar que no haya placas de color rojo. Infecta las células con al menos 100 unidades formadoras de placa para aumentar tus posibilidades de identificar una placa incolora.
En raras ocasiones, es posible que se requieran varias rondas de infección. Las placas fluorescentes rojas en las células RK13 competentes de la proteína quinasa R son indicativas de la expresión viral de mCherry-E3L. Y las placas o placas incoloras que expresan sólo eGFP en las células RK13+E3L+K3L confirman el colapso del marcador de selección mCherry-E3L.
El virus recombinante VC-R4, que carece de ambos antagonistas de la proteína quinasa R, no puede replicarse en células RK13 competentes con proteína quinasa R, mientras que el virus aparente VP872, que expresa E3L, es competente para la replicación. Para confirmar que esta incapacidad para replicar en las células RK13 fue solamente debido a la pérdida de E3L, el GFP mejorado fue substituido con el E3L en el virus VC-R4. Generó un virus relevante utilizando el mismo protocolo de selección.
Curiosamente, al hacer este virus, se identificaron placas incoloras consistentes con el colapso del marcador de selección mCherry-E3L antes de la selección en las células RK13+E3L+K3L que generalmente se requieren para seleccionar recombinantes sin cicatrices. Probablemente debido a la identidad de secuencia extendida entre el casete de recombinación mCherry-E3L y el gen E3L que se inserta en VC-R4. En promedio, el 12,6% de los viriones de progenie se sometieron a recombinación con el plásmido trans infectado, similar a las frecuencias notificadas anteriormente.
Aquí, se muestra la frecuencia de las placas incoloras en relación con las placas totales RK13+E3L+K3L, lo que demuestra que la tasa de colapso y la pérdida del marcador de selección mCherry-E3L se produjeron a una frecuencia de aproximadamente 1,8%. En la primera etapa utilizando células competentes PKR asegura que todas las placas con el virus recombinante contenido. En la segunda etapa utilizando células deficientes PKR permite la detección de virus recombinantes con un locus mCherry-E3L colapso.
Este enfoque nos permite generar rápidamente virus que contienen genes exógenos, por ejemplo, para la producción de vacunas, ofrecer la expresión de diferentes antagonistas virales de PKR. para facilitar el análisis de interacciones específicas de especies con PKR de varios huéspedes.
