Este protocolo describe un sistema de genética inversa fiable y eficiente para la fabricación de rotavirus recombinantes. También explica cómo hacer rotavirus recombinantes que expresan proteínas marcadoras fluorescentes. Este método es simple que requiere un número mínimo de plásmidos y puede generar rotavirus recombinantes que expresan proteínas de flúor separadas, así como proteínas virales.
Comience por sembrar células BHKT7 en placas de 12 pozos. Enjuague una monocapa recién confluente de células con PBS. A continuación, interrumpa la monocapa con la solución de trippsina-EDTA y resuspenda las células en cinco mililitros de GMEM medio completo.
Determinar la concentración de células BHKT7 viables utilizando el azul tripano y un contador de células automatizado. Luego sembra dos veces 10 a las quintas células en un mililitro de GMEM en cada pozo de una placa de cultivo celular de 12 pozos. Incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante la noche.
Al día siguiente, preparar la mezcla de plásmido para la transfección de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. A continuación, agregue 110 microlitros de medio sérico reducido precalentó a cada mezcla de plásmido y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Añadir 32 microlitros de reactivo de transfección a la mezcla.
Haga una breve centrifugación después del vórtice e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Mientras tanto, enjuague las células BHKT7 con dos mililitros de GMEM medio incompleto. Añadir un mililitro de SMEM medio incompleto a cada pozo y devolver la placa a la incubadora.
Después de la incubación de 20 minutos, utilice un pipeteador de 200 microlitrotro para agregar la mezcla de transfección gota a gota a cada pocero. Mece suavemente el plato y devuélvalo a la incubadora. Dos días después de la transfección, enjuague una monocapa recién confluente de células MA104 con PBS.
Interrumpir la monocapa con solución trypsin-EDTA y resuspend las células en cinco mililitros de DMEM medio completo. Cuente las células y ajuste la concentración a ocho veces 10 a las quintas células por mililitro de DMEM medio incompleto. Añadir 0,25 mililitros de células MA104 por gota a los pozos con las células BHKT7 transfectados.
Ajuste la concentración de tripsina a 0,5 microgramos por mililitro añadiendo 0,8 microlitros a una solución de stock de mg miligramos por mililitro de trippsina a cada pozo. Diluir las células MA104 restantes a una concentración de 1,5 veces 10 a las quintas células por mililitro en DMEM completo medio y colocar dos mililitros en cada pozo de una placa de seis pozos. Seis días después de la transfección, recuperar el virus recombinante de las células trans infectadas.
Somete las células BHKT7 MA104 a tres ciclos de congelación/deshielo en condiciones estériles, moviendo las placas entre un congelador negativo de 20 grados Celsius y temperatura ambiente. Transfiera los lysates a tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 500 veces g y cuatro grados Celsius para peletizar los desechos celulares.
Recoger el sobrenadante y almacenarlo en cuatro grados Celsius. Añadir tripina a 100 microlitros de anate celular clarificado a una concentración final de 10 microgramos por mililitro e incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, prepare una serie de dilución en serie de 10 veces que va de 10 a la negativa a 10 a la siete negativa en el medio incompleto DMEM.
Enjuague las monocapas MA104 dos veces con dos mililitros de PBS y una vez con un medio incompleto DMEM. Añadir 400 microlitros de diluciones de izado por duplicado a las placas e incubarlas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, balanceándose cada 10 a 15 minutos para redistribuir las diluciones a través de la monocapa. Prepare una solución de recubrimiento MEM de agarosa combinando volúmenes iguales de EMEM 2X precalegado con una agarosa fundida y enfriada al 1,5%.
Mantener esta solución a 42 grados celsius en un baño de agua y ajustar la concentración de trippsina a 0,5 microgramos por mililitro inmediatamente antes de colocarlo en las células. Aspirar diluciones de lesato de la placa de seis pocillos. Luego enjuague las células una vez con dos mililitros de medio incompleto.
Agregue suavemente tres mililitros de la solución de superposición MEM de agarosa a la monocapa de celda en cada pozo. Deje que la agarosa se endurezca a temperatura ambiente. A continuación, devuelva las placas a la incubadora.
Tres días más tarde, preparar una solución de recubrimiento MEM de agarosa como se describió anteriormente y añadir rojo neutro a una concentración final de 50 microgramos por mililitro inmediatamente antes de su uso. Añadir dos mililitros de la solución de recubrimiento en la parte superior de la agarosa existente en las placas de seis pozos. Deje que la agarosa se endurezca y devuelva la placa a la incubadora, asegurándose de proteger las placas con rojo neutro de la luz.
Durante las próximas seis horas, identifique las placas de rotavirus con la ayuda de una caja de luz. Utilice pipetas de transferencia desechables para recoger placas claramente definidas, recuperando tapones de agarosa que se extienden completamente a la capa celular. Expulse el enchufe a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 0,5 mililitros de DMEM medio incompleto y vórtice la muestra durante 30 segundos.
Amplificar el virus aislado de placa eluido en el medio por propagación en monocapas MA104 o matraz AT25 con medio incompleto DMEM y 0,5 microgramos por mililitro de trippsina. Añadir 600 microlitros de licatos de células infectadas clarificadas y 400 microlitros de tiocianato de guanidinio en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Vórquelos durante 30 segundos e incubarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, agregue 200 microlitros de cloroformo. Vórtice la solución durante 30 segundos e incubar durante tres minutos. Después de una microcentrifugación de cinco minutos a 13.000 veces g y cuatro grados Celsius, transfiera 550 microlitros de la fase acuosa superior a un tubo fresco.
Añadir dos volúmenes de alcohol isopropílico frío e invertir el tubo de cuatro a seis veces. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego centrifugarlo durante 10 minutos a 13.000 veces g y cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante dejando el pellet de ARN. Lave el ARN añadiendo un mililitro de 75% de etanol al tubo invirtiéndolo una vez y centrifugando durante cinco minutos a 7.500 veces g y cuatro grados Celsius. Después de retirar cuidadosamente el etanol, deje que el ARN se seque al aire durante cinco a 10 minutos.
A continuación, disolver el pellet en 15 microlitros de agua libre de nucleasas. Agregue dos microlitros de tampón de carga de ADN 6X a 10 microlitros de la muestra de ARN disuelto. Cárgalo en un mini gel de poliacrilamida 10% pre-fundido.
Resuelva los ARN por electroforesis en tampón de tris-glicina durante dos horas bajo una corriente constante de 16 miliamperios. Una vez completada la prueba del gel, remoje el gel durante cinco a 10 minutos en agua que contenga un microgramo por mililitro de bromuro de etidio y detecte los segmentos del genoma del rotavirus con un transilluminador UV. Este protocolo de genética inversa se utilizó para generar virus SA11 recombinantes que se pueden identificar fácilmente con un ensayo de placa en las células MA104 permitiendo el aislamiento de la placa.
Los genomas de dsRNA de la placa purificada de tipo silvestre rSA11 y los virus SA11-UnaG se extrajeron con una solución que contiene fenol y tiocianato de guanidinio, resuelto por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 10% y detectado por tinción con bromuro de etidio. Como era de esperar, el segmento siete o NSP3 dsRNA de rSA11-UnaG migró mucho más lento que el del tipo salvaje rSA11 debido a la presencia de secuencias 2A-3xFLUnaG. Para comprobar la expresión de la proteína fluorescente UnaG, las células MA104 se infectaron con el tipo salvaje y el virus recombinante y se examinaron con un imager de células vivas.
El análisis mostró que rSA11-UnaG producía fluorescencia verde mientras que no se detectó fluorescencia en células infectadas con el tipo silvestre rSA11. Se realizó un análisis de inmunoblot para investigar si el elemento 2A de rSA11-NSP3-2A-xflUnaG promovió la expresión de dos proteínas separadas. El análisis mostró que NSP3-2A y 3xFL-UnaG se expresaban efectivamente como proteínas separadas que indicaban un elemento 2A funcional.
Para una recuperación exitosa del rotavirus recombinante, es fundamental utilizar células BHKT7 de calidad y bien mantenidas para la transfección y células MA104 para sobresedido, así como cantidades precisas de plásmidos altamente puros. Aunque este protocolo explica cómo utilizar el sistema de genética inversa para modificar el gen del rotavirus NSP3, se puede utilizar el mismo enfoque para modificar otros genes como SP1.
