Bienvenido al Instituto de Biología Celular y Patología, Nicolae Simionescu de Bucarest, Rumania. Aquí en el Laboratorio de Transducción Viral, mostramos una parte de la producción de partículas adenovirales utilizando una metodología optimizada basada en el sistema AdEasy desarrollado por el profesor Vogelstein. Los principales pasos de la tecnología para producir estos adenovirus son, uno, una recombinación de pAdTrack que contiene GFP con el plásmido pAdEasy-1 en bacterias BJ5183.
Dos, empaquetar las partículas adenovirales. Tres, amplificación del adenovirus en las células AD293. Cuatro, purificación de las partículas adenovirales del lisato celular y del medio de cultivo.
Cinco, titulación viral y prueba funcional del adenovirus. Aquí, presentaremos un paso importante de la metodología. La purificación de las partículas adenovirales del lysate de la célula y del medio de cultivo.
La purificación del adenovirus comienza con la recolección de las células productoras de virus y el medio. Las células AD293 fueron transfectadas con el plásmido recombinante y como el adenovirus fue empaquetado. Entonces el adenovirus fue amplificado por culturas más grandes sucesivas.
Aquí, obtuvimos 25 placas T175, y comenzamos la purificación del adenovirus del lysate celular y del medio de cultivo. En primer lugar, comprobamos la fluorescencia verde de la GFP expresada por las células transducidas. Si las células todavía están unidas, las separaremos tocando el plato de cultivo o usando un raspador largo.
Se recogen las células y el medio. Los frascos se lavan con PBS, que también se recoge en tubos Falcon. Las células son peletadas por centrifugación.
Mantenga el pellet de la célula, así como el medio para una mayor purificación del adenovirus. En este paso, la ayuda de un colega es muy apreciada para acelerar el proceso de cosecha. El pellet celular es verde debido a la expresión de GFP.
El pellet se resuspensó en tampón Tris hipertónico, lo que facilitaría la interrupción de las células. Para la lisis celular, utilizamos nitrógeno líquido y el gas seco se calentó hasta 37 grados. No realice más de tres ciclos ya que el virus se dañaría.
Para aumentar la eficiencia de la interrupción celular, pase cuidadosamente la célula homogeneizar a través de una aguja de jeringa de calibre 23. Centrifugar la célula se lise a 9, 600 x g durante 12 minutos. Pase el sobrenadante en tubos nuevos y deseche los pellets.
Mantenga el sobrenadante en el hielo para su posterior procesamiento por ultracentrífuga. Ahora, procesamos el medio de cultivo para aislar el adenovirus liberado de las células. Para ello, en primer lugar, pesamos la cantidad necesaria de sulfato de amonio y lo añadimos a la botella en la que se recogió el medio de cultivo.
La botella se agita vigorosamente hasta que los cristales se disuelven por completo. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante dos horas y media. A continuación, la suspensión del precipitado se divide en tubos Falcon.
Centrífuga durante 15 minutos a 1, 600 x g. Después de la centrifugación, el sobrenadante se desecha y el pellet se resuspende en tampón Tris de 10 milimolares. Si uno no puede continuar la purificación del adenovirus con el paso de ultracentrifugación, el precipitado se puede mantener durante unos días a cuatro grados, pero solo después de la diálisis para eliminar el sulfato de amonio.
Aquí, presentamos el paso de diálisis. Utilizamos una jeringa para introducir la suspensión en un cassette previamente humedeado. Las muestras se dializa contra el tampón Tris de 10 milimolares durante la noche a cuatro grados.
El paso final de la purificación está representado por el paso de ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de cloruro de cesio. Para formar el gradiente, primero, pipeteamos tres mililitros de la solución de alta densidad de cloruro de cesio. En la parte superior de esta capa, vierta suavemente tres mililitros de cloruro de cesio de baja densidad.
La suspensión de partículas adenovirales del lisato celular o del medio de cultivo se superpuesta en la parte superior del gradiente. Los tubos se llenan de aceite mineral y se introducen en los cubos SW41. Después del equilibrio, los tubos se cargan simétricamente en el rotor, que se introduce en la ultracentrífuga.
La centrífuga funciona a 35.000 RPM y cuatro grados durante 18 horas sin descanso. Después de la ultracentrifugación, los tubos se colocan en un soporte con un papel negro detrás para cosechar las bandas. La fase superior clara y los restos de la célula se desechan en un contenedor de residuos con una solución de blanqueo.
La banda más baja que contiene el adenovirus completo se cosecha con una punta de pipeta y se recoge en un tubo estéril de Eppendorf. Después de la diálisis, la sacarosa se añade a la suspensión viral a una concentración final del 4% y la alícuota viral se mantiene congelada a menos 80 grados. En el apartado de resultados, mostramos la expresión de GFP en células transducidas con la obtención de adenovirus.
48 horas después de la transducción, la GFP es expresada por las células transducidas como se muestra por microscopía de fluorescencia. El porcentaje de las células que expresan GFP está determinado por citometría de flujo. Alrededor del 50% de las células endoteliales humanas y bovinas transducidas con 25 unidades de transducción por célula son positivas para la PFG.
El mismo rendimiento de transducción se obtuvo para los hepatocitos murinos cuando sólo se utilizaron cinco unidades de transducción por célula, pero esto se asocia con una mayor mortalidad debido a la sensibilidad celular. Reducido a la expresión de GFP fue obtenido por la transducción de las células stromal mesenquimales debido a la expresión baja de los receptores específicos. Observaciones finales.
Optimizamos esta laboriosa tecnología para reducir el tiempo, los costos y el esfuerzo necesario para obtener las partículas adenovirales. El adenovirus preparado es capaz de infectar varios tipos celulares e inducir la expresión del gen de interés.
