La investigación en Kaloshian laboratorio está financiado por una donación de Estados Unidos Instituto Nacional de la Agricultura y la Alimentación (2007-35607-17765). La investigación en laboratorio de Roberts es un proyecto financiado por subvenciones de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional (GDG-G-00-02-00012-00 y A-EDH-00-07-00005) y la de California en seco de la Junta Consultiva frijol.

1. Crecimiento de las plántulas de tomate en macetas y bandejas <ol><li> Para los ensayos de marihuana, semillas de plantas de tomate en una sola olla en un suelo rico en materia orgánica, como mezcla de sol. Mantener en un invernadero a 22-28 º C. Después de la germinación, fertilizar una vez a la semana con Miracle-Gro. </li><li> Unas dos semanas después de la germinación, en los dos verdadera hoja de etapa, el trasplante de forma individual las plantas de semillero en macetas (10 cm de diámetro y 17 cm de profundidad) con suelo de arena estéril que contiene un 90% de arena y 10% mezcla orgánica. Añadir Osmocote fertilizante de liberación lenta y mantener en un invernadero a 22-28 ° C durante dos semanas. Continuar para fertilizar las plantas una vez por semana con Miracle-Gro. </li><li> Para pantallas de alto rendimiento, las semillas de las plantas directamente en las bandejas en el suelo arenoso, cubrir la bandeja con papel plástico hasta la germinación y mantener que el anterior. Después de la germinación, agregar fertilizante de liberación lenta Osmocote y fertilizar una vez a la semana con Miracle-Gro. </li></ol> 2. Caupí crecimiento de las plántulas en bolsas <ol><li> SEEDS son o bien germinaron en una placa de Petri, revestida con varias capas de papel Kimwipe, y se transfieren individualmente a bolsas o coloca directamente en la ranura de papel de la bolsa y se germinaron. </li><li> Coloque las bolsas en una carpeta de plástico colgando, dos por cada carpeta, y organizar las carpetas en un bastidor en posición vertical. Coloque el bastidor en una cámara controlada entorno mantenido a una temperatura de 25-28 ° C y 16 h luz / 8 h oscuridad ciclo. Bastidores también se puede mantener en un invernadero, pero requieren una lámina o cubierta de papel rígido colocado sobre el bastidor en ambos lados de los tallos de las plantas, para reducir el potencial de contaminación por hongos. </li><li> Las bolsas de agua una o dos veces por día con agua de ósmosis inversa. Alrededor de 10 a 14 días después de la siembra, cuando un sistema radicular adecuado, con puntas de las raíces terciarias ha desarrollado (Figura 1), las plántulas están listas para la inoculación. </li></ol> 3. La extracción de huevos de nematodos Extracción de correoSGG de las raíces infectadas se modifica a partir de un protocolo desarrollado por Hussey y Barker (1973). <ol><li> Tres o cuatro días antes de la inoculación de nematodos, extraer nódulo de la raíz huevos de nematodos de las raíces de tomate infectadas. Antes de iniciar la extracción de huevos, lave el área de trabajo a fondo con agua caliente para evitar la contaminación. También lave en agua caliente una. Licuadora, dos cubos, un soporte de malla de alambre, un mazo de goma, tres tamices de 425, 90 y 25 m de apertura, una probeta graduada y unas tijeras </li><li> Apilar los tamices de arriba a abajo en el siguiente orden: 425, 90 y 25 m de apertura. Los huevos se recogerán en el tamiz 25 micras en la parte inferior. Coloque los tamices sobre una rejilla metálica apoyada en el fregadero. Coloque una cubeta debajo de la malla de alambre para recoger la solución de ejecución a través. </li><li> Cortar la parte superior de la planta infectada (s), utilizados como la fuente del inóculo, y desechar. Retire con cuidado la planta de la maceta. Lavar las raíces por inmersión en un cubo de plástico lleno de agua. Aclarar las raíces más en ejecutarseNing agua hasta que las partículas del suelo son arrastradas desde las raíces. </li><li> Cortar las raíces con tijeras en trozos pequeños. Deshágase de la raíz principal. </li><li> Coloque las raíces cortadas de una sola planta en un frasco grande de plástico con tapa, agregar suficiente solución de lejía al 10% para cubrir las raíces y cierre la tapa. </li><li> Agite bien el frasco que contiene las raíces de 2 min. </li><li> Abra el frasco y vierte las raíces en el tamiz superior y lavar con una manguera conectada a una boquilla de nebulización. Lavar bien hasta que todo el olor a lejía se ha ido. Utilice un martillo para insertar las caras de los tamices para evitar la obstrucción de los poros del tamiz. </li><li> Retire el tamiz superior y enjuagar los restos en el segundo tamiz. </li><li> Eliminar el segundo tamiz y recoger la basura fina, que incluye los huevos, desde el tamiz pasado. Con una corriente suave de una botella de agua, mover los escombros a un lado del tamiz. Recoger la basura y los huevos en un recipiente limpio con una cantidad mínima de agua. </li><li> Tamizar una vez más el agua recogida en elcubeta a través del tamiz 25 micras para recoger los huevos que pueden haber escapado. Enjuague bien con agua y se acumulan en el mismo vaso. </li><li> Desechar los restos de la planta desde el tamiz superior y lavar a fondo los tres tamices con agua a presión. No toque la parte de malla de los tamices, ya que puede distorsionar el tamaño de los poros. </li></ol> 4. Los huevos para incubar de nematodos <ol><li> Línea de una canasta de metal limpio, con unas pocas capas de papel Kimwipe y cabe en un plato de Petri de vidrio. Permitir una distancia de 1 cm entre la parte inferior de la cesta y el plato. </li><li> Verter los huevos de nematodos extraídos en el papel en el cesto de alambre. Añadir suficiente líquido de modo que la parte inferior de la cesta de alambre toca la superficie del agua, pero no está sumergido en agua. Cubra la parte superior con una tapa de plástico. </li><li> Cada día visita para la evaporación de agua y añadir algo de agua en la placa de Petri de modo que el fondo de la cesta toca el agua. Esto evitará que los huevos de la desecación. </li><li> Cada dos días, recogerá el water que contiene los J2S de las placas de Petri en un vaso de precipitados. Si no se utiliza inmediatamente, airear el inóculo recogido a temperatura ambiente usando un suministro de aire o de laboratorio de aire generada por una bomba de acuario. Utilizar el inóculo celular dentro de 2 días. J2S se puede recoger de la eclosión establecido durante un período de 6-8 días. </li></ol> 5. Infección de las raíces de tomate en macetas o bandejas y evaluación de la infección <ol><li> Utilizar tres alícuotas de los nematodos recogidos para contar el número de J2S en una diapositiva o plato contando, calcular el promedio y determinar el volumen deseado para la inoculación. Normalmente se utilizan J2S 3000 por planta en macetas y 500 J2S para las plantas cultivadas en bandejas de plántulas. </li><li> Agitar el inóculo en una placa de agitación magnética a baja velocidad. </li><li> Antes de inocular las plantas, asegúrese de que el suelo está húmedo pero no mojado también. Para la inoculación olla, hacer tres agujeros alrededor de la mitad de la olla de profundidad en la arena alrededor de cada sistema de raíces de tomate con un lápiz (Figura 2 </strong&gt;). Inocular cada planta mediante la entrega de los J2S en los tres agujeros usando una pipeta. Después, cubrir los agujeros. </li><li> Para las pantallas de alto rendimiento en las bandejas, utilice una aguja modificada punta sellada con agujeros en los lados pegados a una punta de pipeta de 5 ml a lo largo de un pipeteador (Figura 3) para entregar los J2S en el suelo. Alternativamente, los nematodos se puede enviar como en el paso 5,3. </li><li> Mantener las plantas en un invernadero a 24-27 ° C durante seis a ocho semanas. Continuar para fertilizar dos veces al mes con Miracle-Gro. </li><li> Para la evaluación de la infección, retirar con cuidado las plantas de las macetas y lavar las raíces (como se describe en el paso 3,3). </li><li> Mancha de las masas de huevos azules, sumergiendo las raíces en 1 mg / L erioglaucine, durante 15 minutos. </li><li> Lavar las raíces en agua y evaluar contando las masas de huevos manchados en el sistema de raíz individual. Una lupa de mesa de iluminación se puede utilizar para ayudar a visualizar las masas de huevos. </li><li> Si las plantas apantallados son necesarios para g másLos estudios enetic, no corte la parte superior antes de lavar las raíces para su evaluación. Después de la tinción y recuento de las masas de huevos, trasplantar las plántulas en suelo orgánico, podar las copas en gran medida a reducir la transpiración, y mantener en un invernadero. </li></ol> 6. Caupí infección de las raíces en bolsas y evaluación de la infección <ol><li> Contar el inóculo de nematodos y se agita en una placa de agitación magnética como se describió anteriormente. </li><li> Eliminar las bolsas de las carpetas colgantes y colocar en una superficie horizontal. Inocular cada bolsa con 1500 J2S en 5 ml. Levante la cubierta de plástico de la bolsa y distribuir los nematodos uniformemente sobre la superficie de las raíces. </li><li> Mantenga las bolsas en posición horizontal durante 24 horas después de la inoculación, cubierto con papel oscuro para evitar la luz, a continuación, volver a las carpetas que cuelgan en la cámara de crecimiento. </li><li> Riegue las plantas cuando sea necesario, una o dos veces al día, con Hoagland medio-concentración de la solución (Hoagland y Arnon, 1950, Tabla 1 </&gt; fuerte) hasta una respuesta al fertilizante se observa, reverdecimiento follaje típicamente mejorada y crecimiento de los brotes más vigorosa. Por lo general, las plantas se riegan con Hoagland de fuerza media de 3 días seguidos. Después, mantenga las bolsas húmedo con agua. </li><li> Aproximadamente 30 días (rango 28-35 días) después de la inoculación, infusión de cada bolsa con alrededor de 10-20 ml de 75 mg / L erioglaucine. Mantener las bolsas inundadas con el colorante en una posición horizontal durante la noche. </li><li> Vacíe las bolsas y evaluar los sistemas de raíces, contando las masas de huevos en una lupa mesa iluminada. </li><li> Si las plantas examinadas son necesarios para posteriores estudios genéticos o el trabajo de reproducción, tire con cuidado las raíces del papel, el trasplante en suelo orgánico en macetas y mantener en un invernadero. </li></ol> 7. Los resultados representativos Las etapas apropiadas de las plantas de tomate y caupi para inoculaciones de nematodos de los dos sistemas descritos se muestra en las figuras1 y 2. Además, los ejemplos de bien infectadas raíces de tomate y caupi se muestran en las figuras 4 y 5. Como en la mayoría de las pantallas de resistencia a enfermedades, es aconsejable utilizar al menos 6-10 plantas por genotipo para la inoculación de nematodos para calcular el promedio de la tasa de infección. La variación en la infección por nematodos entre las plantas, del mismo genotipo, se puede reducir mediante el uso de tamaño de la planta uniforme y la cantidad exacta y la entrega de inóculo. El uso de bandejas y bolsas de crecimiento permite el cribado de los cientos de miles de plantas en un espacio pequeño crecimiento. Bolsas de crecimiento también permiten rápida y eficiente evaluación no destructiva de infecciones por nematodos agalladores sin necesidad de raíces de lavado (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> Figura 1. Un dos semanas de edad planta caupi crecido en una bolsa y listo para agallador NEMATode la inoculación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> Figura 2. A tres semanas de edad, planta de tomate preparada para la inoculación nematodo agallador. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> Figura 3. Una aguja modificado y punta de la pipeta utilizada para la inoculación de alto rendimiento de los nematodos. La parte inferior de una aguja se selló y tres conjuntos de agujeros se perforaron en la aguja utilizando un rayo láser. Entonces, la aguja modificado fue pegado a una punta de pipeta de 5 ml. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> Figura 4. Un sistema de raíces de tomate infectadas con el nematodo agallador. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> Figura 5. Un sistema de raíces de caupí, con masas de huevos teñidos con erioglaucine 30 días después de la inoculación crecido a28 ° C.

<ol>
	<li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway.">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li><li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea.">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li><li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.,+including+a+new+technique.">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li><li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid.">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li><li>Matkin, O. A., Chandler, P. A., Baker, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U.C.-type+soil+mixes.+In:+The+U.C.+system+for+producing+healthy+container-grown+plants.">The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. 23, 68-85 (1957).</li><li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature.">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li><li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita.">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li><li>Perry, R. N., Moens, M., Starr, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root-Knot Nematodes. , (2009).</li><li>Starr, J. L., Cook, R., Bridge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Resistance to Parasitic Nematodes. , (2002).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Hay dos pasos fundamentales para una pantalla de nematodos éxito: preparación de un inóculo muy infecciosos y el uso de plantas en la etapa de desarrollo adecuado. Tasa de eclosión de huevos de nematodos nudo de la raíz es muy variable y oscila entre 5 a 50%. Por lo tanto para obtener niveles óptimos de escotilla y J2S altamente infecciosos, se debe prestar mucha atención a la extracción de huevos para incubar y de los procedimientos. Los huevos deben ser expuestos a cloro por un período mínimo de tiempo y cloro debe enjuagarse bien de la mezcla de las raíces. Cuando la eclosión de los huevos, la suspensión que contiene los huevos no deben ser sumergidas en agua. Además, evitar el derrame de los huevos en la caja de Petri subyacente, donde los juveniles nacidas son capturadas. Una forma de evitar el derrame de los huevos durante el proceso de incubación no es añadir agua directamente a la Kimwipe que el papel puede romperse. En su lugar se añade el agua directamente a la placa de Petri. Para obtener los mejores resultados, utilice J2S recién nacidos. Si el HATCtasa h es baja y más inóculo se necesita, J2S puede ser almacenado a 15 ° C durante un período más largo. Caliente el inóculo almacenado a temperatura ambiente para revivir los nematodos antes de la inoculación. Sin embargo, no guarde los J2S durante períodos prolongados, incluso a 15 ° C como J2S muertos de hambre no se infectan de manera eficiente. Las plántulas son la mejor etapa de desarrollo para la inoculación nematodo agallador. Sin embargo, esto tiene que ser equilibrada con la formación de un sistema radicular adecuado que proporcione un número suficiente de puntas de las raíces como puntos de entrada para los J2S. El mantenimiento de un estado óptimo crecimiento de las plantas también es fundamental para las pantallas. Evitar el exceso de riego las plantas especialmente los que crecen en las bolsas. El exceso de riego de las bolsas, como se indica por el agua estancada en la parte inferior de la bolsa, puede promover el crecimiento de hongos y disminuir salud de las raíces. Con los dos ensayos de evaluación adicional de la infección por nematodos y el cálculo del número de huevos por sistema radicular y los huevos / gramo de frecuenciaraíz sh se puede realizar. Para los ensayos de tomate, las raíces individuales se pesan y se extrajeron los huevos como se describe para la preparación de inóculo (sección 3). Al procesar gran número de muestras de plantas, los sistemas individuales de raíz podría ser macerado utilizando un mezclador para la extracción de huevo. El número de huevos deben ser contados por lo menos en tres partes alícuotas y se calculan los huevos / gramo de sistema de raíces fresca. Para los ensayos de bolsa, el sistema de raíces es arrancado de la inserción de papel, se pesaron, y se extrajo huevos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Compound </td>
			<td>Concentration </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2 &bull; 4 H2O</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamp-ene Fe EDTA 13.0%</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>46 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 &bull; 4H2O</td>
			<td>9 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>0.00076 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &bull; 5H2O</td>
			<td>0.00032 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24 &bull; 4H2O</td>
			<td>0.00016 &mu;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Reagents for Hoagland's solution.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent </td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalogue number </td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erioglaucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC22973-0250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro for tomato</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>18-18-21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmocote</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedling growth pouches</td>
			<td>Mega International</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 25 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3886</td>
			<td>US standard #500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 90 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3880</td>
			<td>US standard #170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 425 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3871</td>
			<td>US standard #40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine mix</td>
			<td>Sun Gro Horticulture Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 2. Table of specific reagents and equipment.

high and low throughput screens with root-knot nematodes meloidogyne spp.

Los nematodos parásitos (del género Meloidogyne) son parásitos obligados de plantas. Son extremadamente polífaga y considerado uno de los nematodos parásitos de mayor importancia económica. El microscopio de la segunda etapa juvenil (J2), muda una vez en el huevo, es la etapa infecciosa. Los J2S salen de los huevos, se mueven libremente en el suelo dentro de una película de agua, y localizar puntas de las raíces de las especies vegetales adecuadas. Después de penetrar en la raíz de la planta, que migran hacia el cilindro vascular en el que establecer un sitio de alimentación e iniciar la alimentación con sus estiletes. El sitio de alimentación pluricelular está compuesto de varias células alargadas multinucleadas llamadas &#39;células gigantes&#39; que se forman a partir de células que se sometieron a cariocinesis (se repite la mitosis) sin citocinesis. Las células vecinas periciclo dividir y ampliar de tamaño dando lugar a una agalla típica o nudo de la raíz, el síntoma característico de la infección por el nematodo agallador. Una vez que se inicia la alimentación, J2S una vida sedentaria y la ONUdergo tres mudas adicionales para convertirse en adultos. La hembra adulta pone 150-250 huevos en una matriz gelatinosa sobre o debajo de la superficie de la raíz. De los huevos eclosionan J2S nuevos infecciosos y comenzar un nuevo ciclo. El ciclo del nematodo del nudo de la vida se completa en 4-6 semanas a 26-28 ° C. Aquí les presentamos el protocolo tradicional para infectar a las plantas, cultivadas en macetas con nematodos, y dos métodos de alto rendimiento ensayos. La primera de alto rendimiento método se utiliza para las plantas con semillas pequeñas como el tomate, mientras que el segundo es para las plantas con semillas grandes, como frijol caupí y común. Las semillas grandes apoyan el crecimiento de plántulas extendida con suplemento de nutrientes mínimos. El primer ensayo de alto rendimiento utiliza plántulas crecidas en arena en bandejas, mientras que en las plantas de ensayo segundo se cultivan en bolsas en la ausencia de suelo. El crecimiento de las plántulas bolsa está hecha de una mecha 15,5 x 12,5 cm de papel, doblada en la parte superior para formar un canal 2-cm de profundidad en la cual se coloca la semilla o las plántulas. Lamecha de papel se encuentra dentro de una bolsa de plástico transparente. Estas bolsas de crecimiento permiten la observación directa de síntomas de la infección por nematodos, escoriaciones de las raíces y la producción de masa de huevo, bajo la superficie de una bolsa transparente. Ambos métodos permiten el uso de las plantas examinadas, después de fenotipado, para el cruce o la producción de semillas. Una ventaja adicional del uso de bolsas de crecimiento es la necesidad de espacio pequeño, porque las bolsas de plástico se almacenan en carpetas colgantes dispuestos en bastidores.

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High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Dos métodos distintos a las plantas de pantalla con nematodos, se describen. Los enfoques descritos son de alto rendimiento de las pantallas con los nematodos en una manera no destructiva para facilitar el uso de estas plantas en los programas de mejoramiento.

Alto y Bajo Rendimiento pantallas con nematodos- Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

27.7K vistas.  University of California, Riverside. Dos métodos distintos a las plantas de pantalla con nematodos, se describen. Los enfoques descritos son de alto rendimiento de las pantallas con los nematodos en una manera no destructiva para facilitar el uso de estas plantas en los programas de mejoramiento.

Video: High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: De Alto Rendimiento La cuantificación del crecimiento de las colonias y Lag Tiempo

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Los ensayos basados ​​en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en<em&gt; Brucella</em&gt; Infección de células Hela

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...