Name: a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
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Este estudio fue apoyado por la prevención del cáncer y el Research Institute of Texas (CPRIT) Premio RR150044, Welch Fundación investigación beca C-1930 y por el nacional institutos de salud K22 AI110552 otorgado a NVK. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

PRECAUCIÓN: P. aeruginosa y E. faecalis son patógenos de nivel 2 de bioseguridad, y deben tomarse precauciones de seguridad adecuado para evitar el contagio accidental y para minimizar la contaminación de las superficies. Todos los medios y materiales que entran en contacto con agentes patógenos deben ser esterilizados o descarta. Nuevas directrices están disponibles desde la publicación del CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), 5ª edición.
1. preparación y mantenimiento de p. aeruginosa
<ol><li>Racha de p. aeruginosa de un stock congelado en una placa de agar LB (caldo de lisogenia). Incubar de 16 a 24 h a 37 ° C Nota: Realizar experimentos de p. aeruginosa dentro de un gabinete para garantizar la esterilidad biológica de seguridad BSL-2. Utilizar las precauciones de seguridad apropiadas para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación o infección de patógena.</li>
	<li>Transferir esta placa a 4 ° C. Esta placa puede conservada a 4 ° C y utilizada para inocular cultivos de hasta una semana. Después de una semana, descontaminar y deseche la placa y hacer una nueva placa de racha LB. Nota: Disminuye la virulencia de p. aeruginosa después de almacenamiento prolongado.</li>
	<li>Dos días antes de la creación de las placas de ensayo, inocular 3-5 mL de caldo LB estéril con una sola Colonia de p. aeruginosa de la placa hecha en 1.1. Incubar a 37 ° C por 12 a 16 h. Nota: No incubar más de 16 h. En ricas culturas líquidas, p. aeruginosa PA14 comienza a lisar.</li>
	<li>Preparar platos para 10 cm estéril con medios matar lenta (3 g NaCl, peptona de 3.5 g, 1 mM CaCl2, 1 mM de MgSO4, 25 mL de tampón fosfato (cantidad por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) y 868 mL de KH2PO4 (1 M)) y agar 18 g/L). Nota: Preparar las placas antes de tiempo. Puede almacenarse hasta por 3 semanas en un recipiente hermético a 4 º C.</li>
	<li>De semillas cada 10 cm matar lenta placa (SK) con 350 μL de p. aeruginosa de cultivo LB fresco durante la noche. Utilizando un esparcidor bacteriano estéril, esparcir bacterias uniformemente en toda la superficie de los medios de comunicación y deje que se seque en el gabinete de seguridad biológico un BSL-2.</li>
	<li>Incube las placas a 37 ° C durante 24 h.</li>
</ol>2. preparación de las bacterias de ARNi
<ol><li>Raya hacia fuera o pin-transferencia deseadas cepas de bacterias que contiene el ARNi en placas con agar LB con antibióticos apropiados (carbenicilina 100 μg/ml) y la tetraciclina en 15 μg/mL para las bibliotecas Ahringer y Vidal de un stock congelado. Nota: Cuando se trabaja con bacterias no patógenas, utilice cualquiera de los dos un BSL-2 / gabinete de seguridad biológico B o un flujo laminar de BSL-1 campana para asegurar la esterilidad de las culturas y minimizar la posibilidad de contaminación cruzada de la biblioteca.</li>
	<li>Incubar las placas durante 24 h a 37 ° C.</li>
	<li>Almacenar las placas a 4 ° C hasta por dos semanas.<ol>
<li>Después de dos semanas, deseche las placas y reemplácelos con platos recién hechos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prueba de múltiples cepas de ARNi en paralelo inoculando individualmente una sola Colonia de cada clon en 4 mL de LB carbenicilina complementado en un único pozo de una placa de 24 pozos pozos profundos o en un tubo de ensayo estéril. Nota: Tetraciclina se ha divulgado para reducir la eficacia de RNAi. No utilice en este medio.</li>
	<li>Coloque las placas de 24 pozos profundos en un incubador de agitación optimizado para placas de pocillos e incubar a 37 ° C por 16 h agitando a 950 rpm. Nota: Es difícil de obtener crecimiento bacteriano uniforme en placas de pocillos con un incubador de agitación convencional. La incubadora de agitación debe ser capaz de estremecer a un mínimo de 750 rpm a fin de las culturas crecer correctamente. En la ausencia de una coctelera especializada, es posible crecer cada cultura en un tubo individual. Culturas se pueden transferir en la placa de 24 pocillos para la centrifugación después, si lo desea.</li>
	<li>Recoger las bacterias por centrifugación durante 5 minutos a 2.000 x g.</li>
	<li>Decantar el sobrenadante invirtiendo la placa y agitándolo vigorosamente. Resuspender las bacterias ARNi en 100 μl de S Basal (5,85 g NaCl, 1 g de K2HPO4, 6 g KH2PO4 disuelto en 1 L de agua ultrapura y esterilizado por autoclave).</li>
	<li>Pipetear las bacterias resuspendidas en un número adecuado de pozos de una placa NGM pocillos (nematodo de medios del crecimiento, 3 g NaCl, peptona 2,5 g, 1 mM CaCl2, 1 mM de MgSO4, 25 mL de tampón fosfato (cantidad por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) y 868 mL de KH2PO4 (1 M)) y 18 g agar por litro de agua) suplementado con IPTG (concentración final de 1 mM) y carbenicilina (concentración final de 100 μg/mL).<ol>
<li>Uso de 3,5 mL de medio de NGM por pozo de placa de 6 pozos, 1 mL por pocillo de una placa de 24 pocillos o 150 μL por pozo de placa de 96 pocillos.</li>
		<li>Uso 100 μL/pocillo de bacterias de la placa de 6 pozos; 50 μL/pocillo de 24 pocillos; o 20 μL/pocillo de la placa de 96 pocillos. Deje que se seque. Nota: De secado se realiza normalmente en una campana de flujo estéril para promover el secado rápido y uniforme. Es muy importante el secado uniforme. Evitar que se sequen demasiado, como grietas en el agar promoción madriguera de gusanos. Esto lleva a pérdidas y obstrucciones potenciales de sistemas de manejo de líquido del gusano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice las placas preparadas inmediatamente o almacenarlos a 4 ° C hasta por dos semanas para su uso posterior. Nota: Para evitar que las placas de secado, pueden ser selladas con film plástico de parafina o coloca en un recipiente herméticamente sellado con toallas de papel húmedo.</li>
</ol>3. mantenimiento y preparación de C. elegans
Nota: Antes de iniciar los experimentos, generan una población sincronizada de grávida, adulto gusanos hermafroditas como sigue.
<ol><li>Lave grávidos adultos (es decir, con múltiples embriones visibles dentro de la gónada) 4-6 placas de NGM de 10 cm en un tubo cónico de 15 mL añadir 4 mL de S Basal placa, girando suavemente, y luego verter en un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Pelotilla de gusanos mediante centrifugación a 1.000 x g durante 30 segundos.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de gusano.</li>
	<li>Añadir 3,5 mL de solución de lejía al gusano (concentración final de 0.5M de NaOH, 1% hipoclorito de sodio, en agua estéril) y el pellets de lombriz, mezclar por inversión del tubo durante 1 minuto.</li>
	<li>Brevemente vortex y centrifugar a 1.000 x g durante 30 segundos.</li>
	<li>Aspirar o decantar el sobrenadante, teniendo cuidado de no para perturbar el pellet de gusano.</li>
	<li>Añadir 3,5 mL de solución de lejía al gusano fresco a la pelotilla de gusano.</li>
	<li>Mezcle vigorosamente gusanos en solución de lejía. Periódicamente (aproximadamente cada diez segundos) Inspeccione visualmente los gusanos debajo de un microscopio de disección. Reloj para que cutículas de gusano para romperse, liberando huevos. La mayoría de los gusanos adultos que se han disuelto (~ 95%), Diluya el blanqueador 15 ml con S Basal para detener la digestión. Nota: Cáscaras de huevo son más resistentes al cloro que los tejidos adultos, pero puede ser disuelto durante una exposición prolongada. Para evitar la disolución de huevo, no exponga los huevos para gusano solución de blanqueador por más de 7 minutos. Si las cáscaras de huevo están excesivamente dañados, los embriones morirán.</li>
	<li>Pelotilla de embriones a 1.000 x g durante 30 segundos y aspirar o decantar el sobrenadante sin remover el sedimento de los embriones.</li>
	<li>Resuspender gusanos en S basal hasta un volumen final de 15 mL para diluir la solución de lejía al resto.</li>
	<li>Repita los pasos de lavado (3.9-3.10) tres veces más para un total de 4 lavados consecutivos.</li>
	<li>Después del cuarto lavado, aspirar el sobrenadante y se suman a los 5 o 6 mL de S estériles basales en el tubo cónico de 15 mL. El objetivo es suspender los embriones a una concentración de ~ 50 lombrices por μl. Nota: La cantidad de S Basal depende del tamaño de la pelotilla de huevo; cuanto mayor sea el pellet, el más básico de S es necesario.</li>
	<li>Incubar el tubo cónico la noche en un agitador de la mesa a temperatura ambiente o 48 h a 15 ° C. Las larvas eclosionan, pero arrestará a desarrollo larval en la fase L1 (L1 diapausa) debido a la privación de nutrientes.</li>
	<li>Examinar los embriones con un microscopio de disección para verificar que la mayoría de ellos ha tramado y detenido en la fase L1 del desarrollo.</li>
	<li>Determinar el número de gusano por tomar 20 μl de la preparación de gusano y diluir con 80 μl de S Basal. Pipetear 10 μl de solución de gusano diluido directamente en un plato blanco de NGM. Repetir 2 veces más.<ol>
<li>Contar las larvas en cada lugar y determinar el promedio. Este promedio se dividen por 2 para obtener un conteo aproximado de lombrices por μL en la preparación de gusano. Preparaciones de gusano pueden utilizarse para las placas de propagación o para experimentos. Nota: Después de 4-5 días, las larvas hambrientos comenzará a morir; desechar la preparación en este momento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la propagación de la cepa, pipeta salpicado de un número adecuado de gusanos L1 (5.000-6.000) en placas de 3-4 cm 10 NGM concentrado OP50 e. coli – "superfood" (e. coli OP50 vistos en concentración de 25 X (es decir, 1 L de noche OP50 cultura en LB rinde 40 mL de 25 X OP50 súper); 2 mL de esta suspensión bacteriana concentrada son vistos en cada placa NGM de 10 cm).</li>
	<li>Para preparar las placas para los experimentos, hacer uno de los siguientes (para configuración de uso 3.17.1 "Protocolo básico", para los pasos de uso "ARNi pantalla configurar" 3.17.2 - 3.17.4 según corresponda):<ol>
<li>Pipeta ~ 5.000 lombrices/10 placa de cm sembrado con ARNi o OP50 superfood.</li>
		<li>Pipeta de ~ 500 gusanos/pozo de una placa de 6 pozos sembrados con ARNi.</li>
		<li>Pipeta de ~ 300 gusanos/pozo de una placa de 24 pocillos sembrados con ARNi.</li>
		<li>Pipeta de ~ 100 gusanos/pozo de una placa de 96 pocillos sembrados con ARNi. Nota: Para obtener instrucciones sobre cómo fue sembrada ARNi consulte pasos 2.7-2.9 en preparación de bacterias ARNi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si se utiliza una cepa fértil de gusanos, incubar gusanos a 25 ° C ~ 44-48 h. uso estos gusanos tan rápidamente como sea posible después de que la población ha llegado a la edad apropiada. Esto minimiza el impacto del huevo para incubar dentro de los gusanos durante el ensayo.</li>
	<li>Si se utiliza la cepa es estéril a la temperatura (por ejemplo, fer-15(b26); FEM-1(hc17) o glp-4(bn2)), incubar gusanos a 15 ° C para h ~ 16 y luego se transfieren a 25 ° C durante 44 h para completar el desarrollo y prevenir la embriogénesis.</li>
</ol>4. líquido matando a configuración de análisis (protocolo básico)
Nota: Este es un protocolo para una cepa bacteriana y una fuente de gusanos.
<ol><li>Con un raspador celular, quitar la p. aeruginosa de una placa de SK y resuspender en ~ 5 mL de S Basal. Aumentar si es necesario. Medir la densidad óptica de la suspensión bacteriana mediante un espectrofotómetro (OD600)</li>
	<li>Preparar 24 mL de caldo diluido de p. aeruginosa en el Basal de S en OD600 ≈ 0,09 (concentración final de 3 X). Ver 4.6.2 para contenido final por pozo y escala por consiguiente volumen de dilución bacteriana.</li>
	<li>Agregar 21 mL de medio líquido para matar lenta (3 g de NaCl, 3,5 g de peptona/L con CaCl2 y MgSO4 a una concentración final de 1 mM). Usando una pipeta multicanal, traslado 45 μl de bacterias y de los medios de comunicación en cada pocillo de una placa de 384 pozos.</li>
	<li>Lavar gusanos de su fuente (es decir, paso 3.17.1) en un tubo cónico de 50 mL y permitir gusanos para instalarse bajo fuerza de la gravedad. Aspirar sobrenadante hasta 5 mL. Resuspender en un total de 50 mL S basal.</li>
	<li>Repita el paso 4.4 dos veces.</li>
	<li>Utilizando un clasificador de gusano, ordenar aproximadamente 22 gusanos en cada pocillo de la placa de 384 pozos. Nota: La configuración de gotas cada gusano ~1.1 μl de líquido. 22 gusanos ascenderá a 25 μl, volumen total de la prueba a 70 μL/pocillo.<ol>
<li>La composición final de cada pozo se compone de 70 μl. 45 μl de este volumen se añade como medio bacteriano (0,03 bacterias OD600 μl 24 S μl basales y 21 SK complementado con CaCl2 y MgSO4). Los otros 25 μl se agrega con los 22 gusanos.</li>
		<li>Si el clasificador utilizado aquí (véase Tabla de materiales) está disponible, gusanos pueden ser diluidos a una concentración final de 1 μl de gusano en S Basal y pipeteado 25 μL/pocillo con una pipeta multicanal. Sin embargo, los resultados pueden presentar aumento de la variabilidad. Alternativamente, es posible utilizar un dispensador líquido peristáltico, descrito por Leung y colaboradores19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de gusanos han sido ordenados en la placa de 384 pozos, sellar la placa con una película permeable al gas e Incube las placas a 25 ° C durante 24-48 h.</li>
	<li>En el tiempo deseado, usar una lavadora de microplacas para lavar la placa de 384 pozos con S Basal un total de 5 veces.<ol>
<li>Después del segundo lavado, aspirar la mayoría de los medios de comunicación, dejando unos 20 μl. vigorosamente sacude placas mediante un Vortex de microplacas durante al menos 30 segundos para aflojar cualquier suciedad desde el fondo de los pozos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después del último lavado, aspirar sobrenadante hasta 20 μl. Añadir 50 μl de 0.98 μm de ácido nucleico de la mancha (véase Tabla de materiales) o bien la placa de 384 pocillos, para una concentración final de 0,7 μm.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 12-16 h. Este colorante solo mancha gusanos muertos. Después de la incubación deseada, lavado de placas utilizando la lavadora de microplacas para quitar cualquier exceso manchan (un mínimo de 3 lavados).</li>
	<li>Para adquisición de datos, utilice un espectrofotómetro o un microscopio automatizado luz transmitida y fluorescencia (531 de nm de excitación y emisión 593).<ol>
<li>Utilice un objetivo de bajo aumento para permitir una imagen del todo bien para ser capturado.</li>
		<li>Como alternativa, utilice vermimetry de flujo. Esta técnica utiliza un citómetro de flujo de objeto grande como un Fluorímetro de gusano, miden el tamaño y la fluorescencia del organismo entero (es decir, C. elegans) de manera que es muy similar a la citometría de flujo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar software de análisis de imagen automatizado (como CellProfiler, un estudio de análisis de imágenes basado en MatLab <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>) para calcular las áreas de gusano fluorescente y total por pozo de una manera imparcial. Nota: El cociente de estos números representa la muerte de fracción para cada pozo. Si bien había 7 había manchado hacia fuera 20 total, entonces la muerte de fracción compone de 0.35 o 35%.<ol>
<li>Antes del primer uso, la canalización de procesamiento de imagen automatizado debe ser validada por puntuación manual. Esto se hace comparando resultados de la tubería automatizada en los puntajes obtenidos por visualmente inspeccionar imágenes y grabación de fracciones de gusanos muertos para cada uno de ellos. El proceso de validación asegura que los parámetros para el procesamiento automatizado de la proyección de imagen son precisos y representan los datos correctamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. adaptación de cepas múltiples de detección de C. elegans o caídas (ARNi Screen Setup)
Nota: Esta es una pantalla de RNAi para una configuración de placa de 24 pozos.
<ol><li>Añadir 1 mL de S Basal por pozo de una placa de 24 pocillos (ver paso 3.17.3). Suavemente agite gusanos agitando la placa, luego transferencia de gusanos a una placa de pozo profundo 24 vacía y estéril. Permiten gusanos a gravitacionalmente (~ 5 minutos).</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 mL. Agregar 7 mL de S Basal a cada pocillo.</li>
	<li>Repita los pasos 5.1-5.2 un mínimo de 2 veces más. Después del último lavado, aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 400 μl.</li>
	<li>Utilizando la función remuestreador de la clasificadora de gusano, tipo 22 gusanos de la suspensión de gusano de la placa de 24 pozos en cada pocillo de una placa de 384 pozos (cada pocillo de una placa de 24 pozos rendimientos de 8-12 pocillos de una placa de 384 pocillos).<ol>
<li>Para evitar la inanición, pipetear las bacterias en placas de 384 pocillos (una cepa que sirve únicamente como alimento, como OP50, o una cepa patógena) antes de la clasificación. Nota: Pueden añadirse agentes patógenos por pasos 2.3-2.5 o 6.4-6.5 y fuente de alimentación las bacterias pueden ser diluidas y ha añadido siguiendo el mismo esquema en cuanto a p. aeruginosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de gusanos han sido ordenados en la placa de 384 pocillos, agregar pequeñas moléculas u otros materiales específicos del experimento.</li>
</ol>6. adaptación de E. faecalis
Nota: Sólo las diferencias de p. aeruginosa ensayo se describen.
<ol><li>Preparar una fuente fresca de E. faecalis rayas bacterias de un stock congelado en un plato de agar BHI (infusión de cerebro corazón) y la incubación por 16 a 24 h a 37 ° C. Nota: Realizar experimentos de E. faecalis dentro de un gabinete para garantizar la esterilidad biológica de seguridad BSL-2. Utilizar las precauciones de seguridad apropiadas para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación o infección de patógena.</li>
	<li>Las placas pueden almacenarse a 4 ° C hasta una semana. Después de este período, reemplace con una nueva placa.</li>
	<li>La noche antes de la clasificación de gusanos, inocular 3-5 mL BHI estéril con una sola Colonia de E. faecalis. Incubar 12-16 h a 37 ° C con agitación.</li>
	<li>Añadir las bacterias a los pozos en cuanto a p. aeruginosa (3 bacterias x en S Basal, OD600≈0.09). Nota: Para E. faecalis, el final bien la composición es: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, con el volumen restante de S basal. Recuerda que se entregarán 25 μl de S basal con gusanos. Nota: E. faecalis produce biopelículas gruesas que absorben la mancha fluorescente, causar imágenes borrosas. Lavado extenso puede ser insuficiente para eliminar este biofilm. En este caso, los gusanos se pueden transferir a un plato vacío con una pipeta multicanal. Para facilitar la transferencia, puede se agregó Tween 20 a S Basal a una concentración final de 0,1% (v/v) Tween 20 en S Basal. Esto ayuda en la eliminación de los gusanos de la biopelícula.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae,+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections:+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients.">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li><li>Hsueh, P. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li><li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus.">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).</li><li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay.">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).</li><li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence.">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).</li><li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans.">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li><li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li><li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li><li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine,+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa,+translocates+into+C.+elegans,+removes+iron,+and+activates+a+distinct+host+response.">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa.">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li><li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation.">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li><li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans.">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li></ol>

Los autores declaran que tienen no hay conflictos de interés que revelar.

Este ensayo (o ensayos similares donde otros patógenos se sustituyen por p. aeruginosa o E. faecalis) es útiles para una variedad de propósitos, incluyendo el descubrimiento de la droga. También es útil para abordar cuestiones biológicas fundamentales, como la identificación de factores de virulencia, la aclaración de las vías de defensa del anfitrión y determinar la maquinaria regulatoria involucrados en la interacción huésped-patógeno.
Aunque el ensayo asesinat...

La identificación y desarrollo de antibióticos de amplio espectro, eficaces, ahora hace ya casi un siglo, condujeron a un momento clave en la salud pública donde había una creencia extensa que infecciosa enfermedad sería una lacra del pasado. Dentro de unas pocas décadas, este optimismo empezó a decaer, como patógeno después de patógeno desarrollado mecanismos de resistencia que estos tratamientos una vez milagrosos. Durante algún tiempo, la carrera de armamentos entre los esfuerzos de descubrimiento de drogas y los patógenos parecía equilibrada. Sin embargo, el mal uso de antimicrobianos ha culminado recientemente con la aparición de cepas resistentes a los fármacos pan de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensy p. aeruginosa1, 2,3,4.
P. aeruginosa es un oportunista, gram negativos, múltiples hosts patógeno que es una grave amenaza a los pacientes con quemaduras graves, aquellos que son inmunodeprimidos, o fibrosis quística. Es también cada vez más identificado como un agente causal en las infecciones nosocomiales severas, particularmente debido a la continua adquisición de resistencia a los antimicrobianos. Para comenzar a abordar esta amenaza, hemos utilizado el bien documentado C. elegans-p. aeruginosa infección sistema5. Nuestro laboratorio ha aprovechado este sistema para el desarrollo de una plataforma de base líquida, alto rendimiento, alto contenido de investigación para identificar nuevos compuestos que limitan la capacidad del patógeno para matar el host6. Curiosamente, estos compuestos parecen pertenecer a por lo menos tres categorías generales, incluyendo antimicrobianos7 y virulencia de los inhibidores de la8. Otros ensayos de descubrimiento de drogas de alto contenido en C. elegans se han divulgado para Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, pestis de Yersinia, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, y Enterococcus faecalis, entre otros9,10,11,12,13,14,15,16. Estos tipos de ensayos tienen varias ventajas bien reconocidos, tales como limitar falsos éxitos positivos que pueden ser tóxicos para el anfitrión y el patógeno, aumento de la probabilidad de biodisponibilidad en comparación con una pantalla química y la capacidad para identificar éxitos más allá de simplemente limitando el crecimiento microbiano, como anti-antiguamente, las moléculas estimulantes inmunes o compuestos que lo contrario inclinación el equilibrio de la interacción huésped-patógeno en favor de la ex. Además, los compuestos descubiertos en estas pantallas son a menudo eficaces en huéspedes mamíferos.
Cabe señalar que por lo menos dos otros ensayos17,18 están disponibles para llevar a cabo pantallas de alto rendimiento en C. elegans en líquido. Sin embargo, cada uno de estos ensayos es una modificación que permite el análisis prototípico de colonización intestinal, conocido como muerte lenta, a realizarse en líquido, aumentar el rendimiento y permitiendo a los compuestos que más fácilmente se proyectarán. Caracterización cuidadosa ha demostrado concluyentemente que los mecanismos de virulencia bacteriana son diferentes entre estos ensayos y nuestra pantalla basado en el líquido7. Puesto que ambos tipos de virulencia se observan en sistemas mamíferos, es importante considerar que determinante de virulencia es más relevante para los intereses del experimentador antes selección de ensayo.
Aquí se demuestra una versión optimizada de la líquido-ensayo de C. elegans-P. aeruginosa . También divulgamos la adaptación de nuestro método de análisis de base líquida para acomodar el patógeno bacteriano grampositivo Enterococcus faecalis. Como p. aeruginosa, E. faecalis se identifica cada vez más como una amenaza grave nosocomial con un armamento cada vez mayor de resistencia a los antimicrobianos vías1. Aunque existe un método anterior para la detección de alto rendimiento de E. faecalis 14, requiere Preinfección con el patógeno, lo que complica el procedimiento y aumenta la probabilidad de contaminación de equipos como el FlowSort COPAS. Nuestro protocolo elimina la necesidad de la infección, mejorar el perfil de seguridad. Por último, se reporta un medio por el cual cualquiera de estos ensayos se puede combinar con alimentación de RNAi, lo que permite al usuario buscar factores de huésped que desempeñan un papel en el establecimiento, o resistencia a la infección.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Large object flow cytometer/worm sorter</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Washer Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-Well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Nematode Growth Media (NGM)</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) plates</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) media</td><td></td><td></td><td>Amount per liter:&amp;nbsp; 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;(1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Worm Bleach Solution</td><td></td><td></td><td>Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water</td></tr><tr><td>S Basal</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 gram K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, and 1 Liter of milli-Q water</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffer</td><td></td><td></td><td>amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5% Sodium Hypochlorite Solution</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. aeruginosa &lt;/em&gt;(PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;RNAi expressing bacteria (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Worm Strains &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;glp-4&lt;/em&gt;(&lt;em&gt;bn2&lt;/em&gt;) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem

El número de medicamentos nuevos identificados por tradicionales, pantallas en vitro ha disminuido, reducir el éxito de este enfoque en la búsqueda de nuevas armas combatir la resistencia a múltiples drogas. Esto ha llevado a la conclusión de que los investigadores no sólo la necesidad de encontrar nuevos medicamentos, pero también es necesario desarrollar nuevas formas de encontrarlos. Entre los candidatos más prometedores métodos todo organismo, en vivo ensayos lecturas de alto rendimiento, fenotípica de uso y acoge esa gama de elegans de Caenorhabditis a Danio rerio. Estos hosts tienen varias ventajas de gran alcance, incluyendo reducciones dramáticas en hits positivos falsos, como compuestos que son tóxicos para el huésped o biounavailable se colocan típicamente en la pantalla inicial, antes de seguir costoso para arriba.
Aquí mostramos cómo nuestro análisis se ha utilizado para interrogar variación de host en el bien documentado C. elegans—Pseudomonas aeruginosa matanza líquido patosistema. También demostramos varias extensiones de esta técnica bien elaborada. Por ejemplo, somos capaces de llevar a cabo pantallas genéticas de alto rendimiento utilizando RNAi en 24 o 96 pocillos formatos de placa factores de host consulta en esta interacción huésped-patógeno. Usando este análisis, pantallas de todo el genoma se pueden completar en sólo unos meses, que dramáticamente pueden simplificar la tarea de identificar dianas farmacológicas, potencialmente sin la necesidad de enfoques laboriosa purificación bioquímica.
También Divulgamos aquí una variación de nuestro método que sustituye a la bacteria gram-positiva Enterococcus faecalis para el patógeno gramnegativo p. aeruginosa. Mucho como es el caso de p. aeruginosa, muerte por E. faecalis es dependiente del tiempo. A diferencia de los anteriores C. elegans, ensayos deE. faecalis , nuestro análisis de E. faecalis no exigen Preinfección, mejorando su perfil de seguridad y reducir las posibilidades de contaminación de equipos de manipulación de líquidos. El ensayo es altamente robusto, mostrando ~ 95% mortalidad 96 h post infección.

Parámetros importantes para el funcionamiento de ensayo
Una correcta comprensión de la biología que subyace a este análisis es necesaria para optimizar el análisis y solución de problemas. Para ello, nos referimos primero a varios papeles claves dilucidar los mecanismos de patogenia de p. aeruginosa-mediada en líquido7,20. Siempre que se siguen l...

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A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Aquí se describe un protocolo que es un host adaptable, todo, herramienta de detección de alto contenido que puede ser utilizada para estudiar las interacciones huésped-patógeno y se utiliza para el descubrimiento de medicamentos.

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

14.4K vistas.  Rice University. Aquí se describe un protocolo que es un host adaptable, todo, herramienta de detección de alto contenido que puede ser utilizada para estudiar las interacciones huésped-patógeno y se utiliza para el descubrimiento de medicamentos.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Investigación

Bioquímica

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Análisis Automatizado de un Ensayo de Preferencia Chemosensorial Basada en Población de Nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamiento

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Medio ambiente

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Cultivo Y Ensayo De Las Poblaciones De Caenorhabditis elegans De Etapa Mixta A Gran Escala

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genética

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Neurociencias

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biología

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Cuantitativos y automatizada de alto rendimiento del genoma completo de RNAi pantallas en C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Análisis conductual de gran C. elegans las poblaciones utilizando un amplio campo de visión de seguimiento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Inmunología e Infección

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

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