Este estudio fue apoyado por la prevención del cáncer y el Research Institute of Texas (CPRIT) Premio RR150044, Welch Fundación investigación beca C-1930 y por el nacional institutos de salud K22 AI110552 otorgado a NVK. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

PRECAUCIÓN: P. aeruginosa y E. faecalis son patógenos de nivel 2 de bioseguridad, y deben tomarse precauciones de seguridad adecuado para evitar el contagio accidental y para minimizar la contaminación de las superficies. Todos los medios y materiales que entran en contacto con agentes patógenos deben ser esterilizados o descarta. Nuevas directrices están disponibles desde la publicación del CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), 5ª edición.
1. preparación y mantenimiento de p. aeruginosa
<ol><li>Racha de p. aeruginosa de un stock congelado en una placa de agar LB (caldo de lisogenia). Incubar de 16 a 24 h a 37 ° C Nota: Realizar experimentos de p. aeruginosa dentro de un gabinete para garantizar la esterilidad biológica de seguridad BSL-2. Utilizar las precauciones de seguridad apropiadas para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación o infección de patógena.</li>
	<li>Transferir esta placa a 4 ° C. Esta placa puede conservada a 4 ° C y utilizada para inocular cultivos de hasta una semana. Después de una semana, descontaminar y deseche la placa y hacer una nueva placa de racha LB. Nota: Disminuye la virulencia de p. aeruginosa después de almacenamiento prolongado.</li>
	<li>Dos días antes de la creación de las placas de ensayo, inocular 3-5 mL de caldo LB estéril con una sola Colonia de p. aeruginosa de la placa hecha en 1.1. Incubar a 37 ° C por 12 a 16 h. Nota: No incubar más de 16 h. En ricas culturas líquidas, p. aeruginosa PA14 comienza a lisar.</li>
	<li>Preparar platos para 10 cm estéril con medios matar lenta (3 g NaCl, peptona de 3.5 g, 1 mM CaCl2, 1 mM de MgSO4, 25 mL de tampón fosfato (cantidad por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) y 868 mL de KH2PO4 (1 M)) y agar 18 g/L). Nota: Preparar las placas antes de tiempo. Puede almacenarse hasta por 3 semanas en un recipiente hermético a 4 º C.</li>
	<li>De semillas cada 10 cm matar lenta placa (SK) con 350 μL de p. aeruginosa de cultivo LB fresco durante la noche. Utilizando un esparcidor bacteriano estéril, esparcir bacterias uniformemente en toda la superficie de los medios de comunicación y deje que se seque en el gabinete de seguridad biológico un BSL-2.</li>
	<li>Incube las placas a 37 ° C durante 24 h.</li>
</ol>2. preparación de las bacterias de ARNi
<ol><li>Raya hacia fuera o pin-transferencia deseadas cepas de bacterias que contiene el ARNi en placas con agar LB con antibióticos apropiados (carbenicilina 100 μg/ml) y la tetraciclina en 15 μg/mL para las bibliotecas Ahringer y Vidal de un stock congelado. Nota: Cuando se trabaja con bacterias no patógenas, utilice cualquiera de los dos un BSL-2 / gabinete de seguridad biológico B o un flujo laminar de BSL-1 campana para asegurar la esterilidad de las culturas y minimizar la posibilidad de contaminación cruzada de la biblioteca.</li>
	<li>Incubar las placas durante 24 h a 37 ° C.</li>
	<li>Almacenar las placas a 4 ° C hasta por dos semanas.<ol>
<li>Después de dos semanas, deseche las placas y reemplácelos con platos recién hechos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prueba de múltiples cepas de ARNi en paralelo inoculando individualmente una sola Colonia de cada clon en 4 mL de LB carbenicilina complementado en un único pozo de una placa de 24 pozos pozos profundos o en un tubo de ensayo estéril. Nota: Tetraciclina se ha divulgado para reducir la eficacia de RNAi. No utilice en este medio.</li>
	<li>Coloque las placas de 24 pozos profundos en un incubador de agitación optimizado para placas de pocillos e incubar a 37 ° C por 16 h agitando a 950 rpm. Nota: Es difícil de obtener crecimiento bacteriano uniforme en placas de pocillos con un incubador de agitación convencional. La incubadora de agitación debe ser capaz de estremecer a un mínimo de 750 rpm a fin de las culturas crecer correctamente. En la ausencia de una coctelera especializada, es posible crecer cada cultura en un tubo individual. Culturas se pueden transferir en la placa de 24 pocillos para la centrifugación después, si lo desea.</li>
	<li>Recoger las bacterias por centrifugación durante 5 minutos a 2.000 x g.</li>
	<li>Decantar el sobrenadante invirtiendo la placa y agitándolo vigorosamente. Resuspender las bacterias ARNi en 100 μl de S Basal (5,85 g NaCl, 1 g de K2HPO4, 6 g KH2PO4 disuelto en 1 L de agua ultrapura y esterilizado por autoclave).</li>
	<li>Pipetear las bacterias resuspendidas en un número adecuado de pozos de una placa NGM pocillos (nematodo de medios del crecimiento, 3 g NaCl, peptona 2,5 g, 1 mM CaCl2, 1 mM de MgSO4, 25 mL de tampón fosfato (cantidad por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) y 868 mL de KH2PO4 (1 M)) y 18 g agar por litro de agua) suplementado con IPTG (concentración final de 1 mM) y carbenicilina (concentración final de 100 μg/mL).<ol>
<li>Uso de 3,5 mL de medio de NGM por pozo de placa de 6 pozos, 1 mL por pocillo de una placa de 24 pocillos o 150 μL por pozo de placa de 96 pocillos.</li>
		<li>Uso 100 μL/pocillo de bacterias de la placa de 6 pozos; 50 μL/pocillo de 24 pocillos; o 20 μL/pocillo de la placa de 96 pocillos. Deje que se seque. Nota: De secado se realiza normalmente en una campana de flujo estéril para promover el secado rápido y uniforme. Es muy importante el secado uniforme. Evitar que se sequen demasiado, como grietas en el agar promoción madriguera de gusanos. Esto lleva a pérdidas y obstrucciones potenciales de sistemas de manejo de líquido del gusano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice las placas preparadas inmediatamente o almacenarlos a 4 ° C hasta por dos semanas para su uso posterior. Nota: Para evitar que las placas de secado, pueden ser selladas con film plástico de parafina o coloca en un recipiente herméticamente sellado con toallas de papel húmedo.</li>
</ol>3. mantenimiento y preparación de C. elegans
Nota: Antes de iniciar los experimentos, generan una población sincronizada de grávida, adulto gusanos hermafroditas como sigue.
<ol><li>Lave grávidos adultos (es decir, con múltiples embriones visibles dentro de la gónada) 4-6 placas de NGM de 10 cm en un tubo cónico de 15 mL añadir 4 mL de S Basal placa, girando suavemente, y luego verter en un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Pelotilla de gusanos mediante centrifugación a 1.000 x g durante 30 segundos.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de gusano.</li>
	<li>Añadir 3,5 mL de solución de lejía al gusano (concentración final de 0.5M de NaOH, 1% hipoclorito de sodio, en agua estéril) y el pellets de lombriz, mezclar por inversión del tubo durante 1 minuto.</li>
	<li>Brevemente vortex y centrifugar a 1.000 x g durante 30 segundos.</li>
	<li>Aspirar o decantar el sobrenadante, teniendo cuidado de no para perturbar el pellet de gusano.</li>
	<li>Añadir 3,5 mL de solución de lejía al gusano fresco a la pelotilla de gusano.</li>
	<li>Mezcle vigorosamente gusanos en solución de lejía. Periódicamente (aproximadamente cada diez segundos) Inspeccione visualmente los gusanos debajo de un microscopio de disección. Reloj para que cutículas de gusano para romperse, liberando huevos. La mayoría de los gusanos adultos que se han disuelto (~ 95%), Diluya el blanqueador 15 ml con S Basal para detener la digestión. Nota: Cáscaras de huevo son más resistentes al cloro que los tejidos adultos, pero puede ser disuelto durante una exposición prolongada. Para evitar la disolución de huevo, no exponga los huevos para gusano solución de blanqueador por más de 7 minutos. Si las cáscaras de huevo están excesivamente dañados, los embriones morirán.</li>
	<li>Pelotilla de embriones a 1.000 x g durante 30 segundos y aspirar o decantar el sobrenadante sin remover el sedimento de los embriones.</li>
	<li>Resuspender gusanos en S basal hasta un volumen final de 15 mL para diluir la solución de lejía al resto.</li>
	<li>Repita los pasos de lavado (3.9-3.10) tres veces más para un total de 4 lavados consecutivos.</li>
	<li>Después del cuarto lavado, aspirar el sobrenadante y se suman a los 5 o 6 mL de S estériles basales en el tubo cónico de 15 mL. El objetivo es suspender los embriones a una concentración de ~ 50 lombrices por μl. Nota: La cantidad de S Basal depende del tamaño de la pelotilla de huevo; cuanto mayor sea el pellet, el más básico de S es necesario.</li>
	<li>Incubar el tubo cónico la noche en un agitador de la mesa a temperatura ambiente o 48 h a 15 ° C. Las larvas eclosionan, pero arrestará a desarrollo larval en la fase L1 (L1 diapausa) debido a la privación de nutrientes.</li>
	<li>Examinar los embriones con un microscopio de disección para verificar que la mayoría de ellos ha tramado y detenido en la fase L1 del desarrollo.</li>
	<li>Determinar el número de gusano por tomar 20 μl de la preparación de gusano y diluir con 80 μl de S Basal. Pipetear 10 μl de solución de gusano diluido directamente en un plato blanco de NGM. Repetir 2 veces más.<ol>
<li>Contar las larvas en cada lugar y determinar el promedio. Este promedio se dividen por 2 para obtener un conteo aproximado de lombrices por μL en la preparación de gusano. Preparaciones de gusano pueden utilizarse para las placas de propagación o para experimentos. Nota: Después de 4-5 días, las larvas hambrientos comenzará a morir; desechar la preparación en este momento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la propagación de la cepa, pipeta salpicado de un número adecuado de gusanos L1 (5.000-6.000) en placas de 3-4 cm 10 NGM concentrado OP50 e. coli – "superfood" (e. coli OP50 vistos en concentración de 25 X (es decir, 1 L de noche OP50 cultura en LB rinde 40 mL de 25 X OP50 súper); 2 mL de esta suspensión bacteriana concentrada son vistos en cada placa NGM de 10 cm).</li>
	<li>Para preparar las placas para los experimentos, hacer uno de los siguientes (para configuración de uso 3.17.1 "Protocolo básico", para los pasos de uso "ARNi pantalla configurar" 3.17.2 - 3.17.4 según corresponda):<ol>
<li>Pipeta ~ 5.000 lombrices/10 placa de cm sembrado con ARNi o OP50 superfood.</li>
		<li>Pipeta de ~ 500 gusanos/pozo de una placa de 6 pozos sembrados con ARNi.</li>
		<li>Pipeta de ~ 300 gusanos/pozo de una placa de 24 pocillos sembrados con ARNi.</li>
		<li>Pipeta de ~ 100 gusanos/pozo de una placa de 96 pocillos sembrados con ARNi. Nota: Para obtener instrucciones sobre cómo fue sembrada ARNi consulte pasos 2.7-2.9 en preparación de bacterias ARNi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si se utiliza una cepa fértil de gusanos, incubar gusanos a 25 ° C ~ 44-48 h. uso estos gusanos tan rápidamente como sea posible después de que la población ha llegado a la edad apropiada. Esto minimiza el impacto del huevo para incubar dentro de los gusanos durante el ensayo.</li>
	<li>Si se utiliza la cepa es estéril a la temperatura (por ejemplo, fer-15(b26); FEM-1(hc17) o glp-4(bn2)), incubar gusanos a 15 ° C para h ~ 16 y luego se transfieren a 25 ° C durante 44 h para completar el desarrollo y prevenir la embriogénesis.</li>
</ol>4. líquido matando a configuración de análisis (protocolo básico)
Nota: Este es un protocolo para una cepa bacteriana y una fuente de gusanos.
<ol><li>Con un raspador celular, quitar la p. aeruginosa de una placa de SK y resuspender en ~ 5 mL de S Basal. Aumentar si es necesario. Medir la densidad óptica de la suspensión bacteriana mediante un espectrofotómetro (OD600)</li>
	<li>Preparar 24 mL de caldo diluido de p. aeruginosa en el Basal de S en OD600 ≈ 0,09 (concentración final de 3 X). Ver 4.6.2 para contenido final por pozo y escala por consiguiente volumen de dilución bacteriana.</li>
	<li>Agregar 21 mL de medio líquido para matar lenta (3 g de NaCl, 3,5 g de peptona/L con CaCl2 y MgSO4 a una concentración final de 1 mM). Usando una pipeta multicanal, traslado 45 μl de bacterias y de los medios de comunicación en cada pocillo de una placa de 384 pozos.</li>
	<li>Lavar gusanos de su fuente (es decir, paso 3.17.1) en un tubo cónico de 50 mL y permitir gusanos para instalarse bajo fuerza de la gravedad. Aspirar sobrenadante hasta 5 mL. Resuspender en un total de 50 mL S basal.</li>
	<li>Repita el paso 4.4 dos veces.</li>
	<li>Utilizando un clasificador de gusano, ordenar aproximadamente 22 gusanos en cada pocillo de la placa de 384 pozos. Nota: La configuración de gotas cada gusano ~1.1 μl de líquido. 22 gusanos ascenderá a 25 μl, volumen total de la prueba a 70 μL/pocillo.<ol>
<li>La composición final de cada pozo se compone de 70 μl. 45 μl de este volumen se añade como medio bacteriano (0,03 bacterias OD600 μl 24 S μl basales y 21 SK complementado con CaCl2 y MgSO4). Los otros 25 μl se agrega con los 22 gusanos.</li>
		<li>Si el clasificador utilizado aquí (véase Tabla de materiales) está disponible, gusanos pueden ser diluidos a una concentración final de 1 μl de gusano en S Basal y pipeteado 25 μL/pocillo con una pipeta multicanal. Sin embargo, los resultados pueden presentar aumento de la variabilidad. Alternativamente, es posible utilizar un dispensador líquido peristáltico, descrito por Leung y colaboradores19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de gusanos han sido ordenados en la placa de 384 pozos, sellar la placa con una película permeable al gas e Incube las placas a 25 ° C durante 24-48 h.</li>
	<li>En el tiempo deseado, usar una lavadora de microplacas para lavar la placa de 384 pozos con S Basal un total de 5 veces.<ol>
<li>Después del segundo lavado, aspirar la mayoría de los medios de comunicación, dejando unos 20 μl. vigorosamente sacude placas mediante un Vortex de microplacas durante al menos 30 segundos para aflojar cualquier suciedad desde el fondo de los pozos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después del último lavado, aspirar sobrenadante hasta 20 μl. Añadir 50 μl de 0.98 μm de ácido nucleico de la mancha (véase Tabla de materiales) o bien la placa de 384 pocillos, para una concentración final de 0,7 μm.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 12-16 h. Este colorante solo mancha gusanos muertos. Después de la incubación deseada, lavado de placas utilizando la lavadora de microplacas para quitar cualquier exceso manchan (un mínimo de 3 lavados).</li>
	<li>Para adquisición de datos, utilice un espectrofotómetro o un microscopio automatizado luz transmitida y fluorescencia (531 de nm de excitación y emisión 593).<ol>
<li>Utilice un objetivo de bajo aumento para permitir una imagen del todo bien para ser capturado.</li>
		<li>Como alternativa, utilice vermimetry de flujo. Esta técnica utiliza un citómetro de flujo de objeto grande como un Fluorímetro de gusano, miden el tamaño y la fluorescencia del organismo entero (es decir, C. elegans) de manera que es muy similar a la citometría de flujo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar software de análisis de imagen automatizado (como CellProfiler, un estudio de análisis de imágenes basado en MatLab <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>) para calcular las áreas de gusano fluorescente y total por pozo de una manera imparcial. Nota: El cociente de estos números representa la muerte de fracción para cada pozo. Si bien había 7 había manchado hacia fuera 20 total, entonces la muerte de fracción compone de 0.35 o 35%.<ol>
<li>Antes del primer uso, la canalización de procesamiento de imagen automatizado debe ser validada por puntuación manual. Esto se hace comparando resultados de la tubería automatizada en los puntajes obtenidos por visualmente inspeccionar imágenes y grabación de fracciones de gusanos muertos para cada uno de ellos. El proceso de validación asegura que los parámetros para el procesamiento automatizado de la proyección de imagen son precisos y representan los datos correctamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. adaptación de cepas múltiples de detección de C. elegans o caídas (ARNi Screen Setup)
Nota: Esta es una pantalla de RNAi para una configuración de placa de 24 pozos.
<ol><li>Añadir 1 mL de S Basal por pozo de una placa de 24 pocillos (ver paso 3.17.3). Suavemente agite gusanos agitando la placa, luego transferencia de gusanos a una placa de pozo profundo 24 vacía y estéril. Permiten gusanos a gravitacionalmente (~ 5 minutos).</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 mL. Agregar 7 mL de S Basal a cada pocillo.</li>
	<li>Repita los pasos 5.1-5.2 un mínimo de 2 veces más. Después del último lavado, aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 400 μl.</li>
	<li>Utilizando la función remuestreador de la clasificadora de gusano, tipo 22 gusanos de la suspensión de gusano de la placa de 24 pozos en cada pocillo de una placa de 384 pozos (cada pocillo de una placa de 24 pozos rendimientos de 8-12 pocillos de una placa de 384 pocillos).<ol>
<li>Para evitar la inanición, pipetear las bacterias en placas de 384 pocillos (una cepa que sirve únicamente como alimento, como OP50, o una cepa patógena) antes de la clasificación. Nota: Pueden añadirse agentes patógenos por pasos 2.3-2.5 o 6.4-6.5 y fuente de alimentación las bacterias pueden ser diluidas y ha añadido siguiendo el mismo esquema en cuanto a p. aeruginosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de gusanos han sido ordenados en la placa de 384 pocillos, agregar pequeñas moléculas u otros materiales específicos del experimento.</li>
</ol>6. adaptación de E. faecalis
Nota: Sólo las diferencias de p. aeruginosa ensayo se describen.
<ol><li>Preparar una fuente fresca de E. faecalis rayas bacterias de un stock congelado en un plato de agar BHI (infusión de cerebro corazón) y la incubación por 16 a 24 h a 37 ° C. Nota: Realizar experimentos de E. faecalis dentro de un gabinete para garantizar la esterilidad biológica de seguridad BSL-2. Utilizar las precauciones de seguridad apropiadas para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación o infección de patógena.</li>
	<li>Las placas pueden almacenarse a 4 ° C hasta una semana. Después de este período, reemplace con una nueva placa.</li>
	<li>La noche antes de la clasificación de gusanos, inocular 3-5 mL BHI estéril con una sola Colonia de E. faecalis. Incubar 12-16 h a 37 ° C con agitación.</li>
	<li>Añadir las bacterias a los pozos en cuanto a p. aeruginosa (3 bacterias x en S Basal, OD600≈0.09). Nota: Para E. faecalis, el final bien la composición es: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, con el volumen restante de S basal. Recuerda que se entregarán 25 μl de S basal con gusanos. Nota: E. faecalis produce biopelículas gruesas que absorben la mancha fluorescente, causar imágenes borrosas. Lavado extenso puede ser insuficiente para eliminar este biofilm. En este caso, los gusanos se pueden transferir a un plato vacío con una pipeta multicanal. Para facilitar la transferencia, puede se agregó Tween 20 a S Basal a una concentración final de 0,1% (v/v) Tween 20 en S Basal. Esto ayuda en la eliminación de los gusanos de la biopelícula.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae,+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections:+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients.">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li><li>Hsueh, P. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li><li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus.">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).</li><li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay.">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).</li><li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence.">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).</li><li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans.">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li><li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li><li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li><li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine,+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa,+translocates+into+C.+elegans,+removes+iron,+and+activates+a+distinct+host+response.">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa.">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li><li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation.">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li><li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans.">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li></ol>

Los autores declaran que tienen no hay conflictos de interés que revelar.

Este ensayo (o ensayos similares donde otros patógenos se sustituyen por p. aeruginosa o E. faecalis) es útiles para una variedad de propósitos, incluyendo el descubrimiento de la droga. También es útil para abordar cuestiones biológicas fundamentales, como la identificación de factores de virulencia, la aclaración de las vías de defensa del anfitrión y determinar la maquinaria regulatoria involucrados en la interacción huésped-patógeno.
Aunque el ensayo asesinat...

La identificación y desarrollo de antibióticos de amplio espectro, eficaces, ahora hace ya casi un siglo, condujeron a un momento clave en la salud pública donde había una creencia extensa que infecciosa enfermedad sería una lacra del pasado. Dentro de unas pocas décadas, este optimismo empezó a decaer, como patógeno después de patógeno desarrollado mecanismos de resistencia que estos tratamientos una vez milagrosos. Durante algún tiempo, la carrera de armamentos entre los esfuerzos de descubrimiento de drogas y los patógenos parecía equilibrada. Sin embargo, el mal uso de antimicrobianos ha culminado recientemente con la aparición de cepas resistentes a los fármacos pan de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensy p. aeruginosa1, 2,3,4.
P. aeruginosa es un oportunista, gram negativos, múltiples hosts patógeno que es una grave amenaza a los pacientes con quemaduras graves, aquellos que son inmunodeprimidos, o fibrosis quística. Es también cada vez más identificado como un agente causal en las infecciones nosocomiales severas, particularmente debido a la continua adquisición de resistencia a los antimicrobianos. Para comenzar a abordar esta amenaza, hemos utilizado el bien documentado C. elegans-p. aeruginosa infección sistema5. Nuestro laboratorio ha aprovechado este sistema para el desarrollo de una plataforma de base líquida, alto rendimiento, alto contenido de investigación para identificar nuevos compuestos que limitan la capacidad del patógeno para matar el host6. Curiosamente, estos compuestos parecen pertenecer a por lo menos tres categorías generales, incluyendo antimicrobianos7 y virulencia de los inhibidores de la8. Otros ensayos de descubrimiento de drogas de alto contenido en C. elegans se han divulgado para Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, pestis de Yersinia, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, y Enterococcus faecalis, entre otros9,10,11,12,13,14,15,16. Estos tipos de ensayos tienen varias ventajas bien reconocidos, tales como limitar falsos éxitos positivos que pueden ser tóxicos para el anfitrión y el patógeno, aumento de la probabilidad de biodisponibilidad en comparación con una pantalla química y la capacidad para identificar éxitos más allá de simplemente limitando el crecimiento microbiano, como anti-antiguamente, las moléculas estimulantes inmunes o compuestos que lo contrario inclinación el equilibrio de la interacción huésped-patógeno en favor de la ex. Además, los compuestos descubiertos en estas pantallas son a menudo eficaces en huéspedes mamíferos.
Cabe señalar que por lo menos dos otros ensayos17,18 están disponibles para llevar a cabo pantallas de alto rendimiento en C. elegans en líquido. Sin embargo, cada uno de estos ensayos es una modificación que permite el análisis prototípico de colonización intestinal, conocido como muerte lenta, a realizarse en líquido, aumentar el rendimiento y permitiendo a los compuestos que más fácilmente se proyectarán. Caracterización cuidadosa ha demostrado concluyentemente que los mecanismos de virulencia bacteriana son diferentes entre estos ensayos y nuestra pantalla basado en el líquido7. Puesto que ambos tipos de virulencia se observan en sistemas mamíferos, es importante considerar que determinante de virulencia es más relevante para los intereses del experimentador antes selección de ensayo.
Aquí se demuestra una versión optimizada de la líquido-ensayo de C. elegans-P. aeruginosa . También divulgamos la adaptación de nuestro método de análisis de base líquida para acomodar el patógeno bacteriano grampositivo Enterococcus faecalis. Como p. aeruginosa, E. faecalis se identifica cada vez más como una amenaza grave nosocomial con un armamento cada vez mayor de resistencia a los antimicrobianos vías1. Aunque existe un método anterior para la detección de alto rendimiento de E. faecalis 14, requiere Preinfección con el patógeno, lo que complica el procedimiento y aumenta la probabilidad de contaminación de equipos como el FlowSort COPAS. Nuestro protocolo elimina la necesidad de la infección, mejorar el perfil de seguridad. Por último, se reporta un medio por el cual cualquiera de estos ensayos se puede combinar con alimentación de RNAi, lo que permite al usuario buscar factores de huésped que desempeñan un papel en el establecimiento, o resistencia a la infección.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>COPAS FP BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>Large object flow cytometer/worm sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL406 Washer Dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Deep-Well RB Block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>MPG-781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Media (NGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow Killing (SK) plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow Killing (SK) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter:&#160; 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>L1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>50-488-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Bleach Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S Basal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>S5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>P3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>P5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Sodium Hypochlorite Solution</td>
			<td>BICCA</td>
			<td>7495.5-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P. aeruginosa (PA14)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. faecalis(OG1RF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli superfood (OP50)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Strains </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem

El número de medicamentos nuevos identificados por tradicionales, pantallas en vitro ha disminuido, reducir el éxito de este enfoque en la búsqueda de nuevas armas combatir la resistencia a múltiples drogas. Esto ha llevado a la conclusión de que los investigadores no sólo la necesidad de encontrar nuevos medicamentos, pero también es necesario desarrollar nuevas formas de encontrarlos. Entre los candidatos más prometedores métodos todo organismo, en vivo ensayos lecturas de alto rendimiento, fenotípica de uso y acoge esa gama de elegans de Caenorhabditis a Danio rerio. Estos hosts tienen varias ventajas de gran alcance, incluyendo reducciones dramáticas en hits positivos falsos, como compuestos que son tóxicos para el huésped o biounavailable se colocan típicamente en la pantalla inicial, antes de seguir costoso para arriba.
Aquí mostramos cómo nuestro análisis se ha utilizado para interrogar variación de host en el bien documentado C. elegans—Pseudomonas aeruginosa matanza líquido patosistema. También demostramos varias extensiones de esta técnica bien elaborada. Por ejemplo, somos capaces de llevar a cabo pantallas genéticas de alto rendimiento utilizando RNAi en 24 o 96 pocillos formatos de placa factores de host consulta en esta interacción huésped-patógeno. Usando este análisis, pantallas de todo el genoma se pueden completar en sólo unos meses, que dramáticamente pueden simplificar la tarea de identificar dianas farmacológicas, potencialmente sin la necesidad de enfoques laboriosa purificación bioquímica.
También Divulgamos aquí una variación de nuestro método que sustituye a la bacteria gram-positiva Enterococcus faecalis para el patógeno gramnegativo p. aeruginosa. Mucho como es el caso de p. aeruginosa, muerte por E. faecalis es dependiente del tiempo. A diferencia de los anteriores C. elegans, ensayos deE. faecalis , nuestro análisis de E. faecalis no exigen Preinfección, mejorando su perfil de seguridad y reducir las posibilidades de contaminación de equipos de manipulación de líquidos. El ensayo es altamente robusto, mostrando ~ 95% mortalidad 96 h post infección.

Parámetros importantes para el funcionamiento de ensayo
Una correcta comprensión de la biología que subyace a este análisis es necesaria para optimizar el análisis y solución de problemas. Para ello, nos referimos primero a varios papeles claves dilucidar los mecanismos de patogenia de p. aeruginosa-mediada en líquido7,20. Siempre que se siguen l...

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A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Aquí se describe un protocolo que es un host adaptable, todo, herramienta de detección de alto contenido que puede ser utilizada para estudiar las interacciones huésped-patógeno y se utiliza para el descubrimiento de medicamentos.

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

a-high-throughput-high-content-liquid-based-c-elegans-pathosystem

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

14.4K vistas.  Rice University. Aquí se describe un protocolo que es un host adaptable, todo, herramienta de detección de alto contenido que puede ser utilizada para estudiar las interacciones huésped-patógeno y se utiliza para el descubrimiento de medicamentos.

Video: A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

La separación automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Asociación Typhimurium, Invasión y replicación en macrófagos

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Sin células bioquímico análisis enzimático fluorométrico para medición de alto rendimiento de la peroxidación lipídica en lipoproteínas de alta densidad

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Análisis conductual de gran C. elegans las poblaciones utilizando un amplio campo de visión de seguimiento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

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La separación automatizada de

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

Sin células bioquímico análisis enzimático fluorométrico para medición de alto rendimiento de la peroxidación lipídica en lipoproteínas de alta densidad

Análisis conductual de gran C. elegans las poblaciones utilizando un amplio campo de visión de seguimiento plataforma automatizada

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico