Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de Comunicación. El apoyo adicional fue proporcionada por NIDCD 5R01 DC007613.

1. Utrículo Disección y Cultura <ol><li> La eutanasia de un adulto (de 4 semanas de edad o más) del ratón mediante un protocolo aprobado y decapitar. </li><li> Corta el conducto auditivo externo en ambos lados de la cabeza y tire de la piel hacia adelante hacia la nariz. Dividir en dos la cabeza de atrás hacia delante y quitar el cerebro de ambos lados para revelar el laberinto óseo. </li><li> Recortar el cráneo lejos de la cóclea ósea y transferir el laberinto óseo (incluyendo la ampolla) a una campana de cultivo de tejidos equipado con un microscopio de disección (Nota: el trabajo adenovirus se debe realizar en un armario de Clase II de seguridad biológica). </li><li> En la campana, transferir cada cóclea a un plato de cultivo de tejidos de 35 mm que contiene estériles medios de disección (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Figura 1A). </li><li> Si la bulla auditiva sigue intacta (es posible eliminar la bulla durante la disección bruta mediante la inserción de la uña del pulgar entre la bulla y el ápice dela cóclea), utilice dos pinzas (una # 3 y un n º 5) para romper la ampolla (fig. 1B). </li><li> Identificar los hitos de la cóclea ósea de preparación: huesecillos ápice, la base, y las ventanas redonda y oval, la raíz del nervio VIII, los canales semicirculares (Figura 1 C, D). </li><li> Coloque el oído interno en el plato con el lado medial hacia arriba, de tal manera que el óvalo y ventanas redondas y el ápice son en la parte inferior del plato y la raíz del nervio VIII está orientada hacia arriba. Mantenga la preparación utilizando una pinza de # 3 en la región de los canales semicirculares (Figura 1D). </li><li> Con un bisturí equipada con una cuchilla # 11, cortar el vértice de la cóclea sólo apical de la raíz nerviosa (Figura 1D). </li><li> Girar la preparación de modo que la porción cortada hacia arriba. Utilizar el canal semicircular anterior como asa para estabilizar la preparación (Figura 1E). </li><li> Utilizando # 5 pinzas, retire la cóclea en el modiolo abajoa la base. En el punto donde la región gancho de la cóclea gira hacia abajo, utiliza una sonda fina (media de unos rotos # 55 fórceps) para levantar la plataforma último ósea de la lámina espiral ósea (Figura 1F), revelando el sáculo. Justo debajo de la sáculo es la base del estribo, que es un hito importante. El utrículo es inmediatamente adyacente a la base del estribo (Figura 1G), y está rodeado por hueso. Utilice la sonda para astillar el hueso de distancia suficiente como para revelar aproximadamente 1/3 del utrículo. Retire con cuidado el utrículo con # 55 con fórceps (Figura 1H). Este procedimiento generalmente se traducirá en la eliminación del epitelio pigmentado del techo como el utrículo se extrae de la preparación ósea. Sin embargo, si el utrículo se elimina con el epitelio del techo intacto, el techo se puede quitar utilizando # 55 pinzas. </li><li> Utrículos para la infección por adenovirus (o experimentos en vivo de imágenes) debe tener el otoconia eliminado durante la disección (antes de la infección).En este caso, utilice una jeringa luer que se llena con los medios de disección y equipado con una aguja de pequeño calibre (generalmente 26-28 manométrica). Sostenga el utrículo en el borde usando pinzas de # 55 (Figura 1i). Llevar la punta de la aguja cerca del utrículo con el bisel de la aguja apuntando hacia abajo. Utilice un chorro de la disección de los medios de comunicación para hacer estallar fuera de la otoconia (Figura 1J). Alternativamente, otoconia se puede eliminar por cepillado a retirarse utilizando una herramienta de pestañas (Ted Pella, Inc. # 113). Utrículos que no van a someterse a la infección viral suelen ser cultivadas de libre flotación, en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos con la intacta otoconia (ver más abajo para la eliminación después de la corrección otoconia, que es más fácil). </li><li> Una vez que todos utrículos se disecan, cambiar los medios de comunicación a la cultura de disección estériles los medios de comunicación: DMEM F12 (Gibco # 11320) suplementado con FBS al 5% y 50 U / ml de penicilina G (Sigma). </li><li> Utrículos se cultivan a 37 ° C y 5% de CO 2. Si los cultivos son para ser maintained por más de 48 horas, la mitad de los medios de cultivo se debe cambiar cada dos días. Los cultivos se puede mantener durante una semana o más. </li></ol> 2. Adenovirus infección de las células de apoyo Importante: Trabajo con adenovirus requiere de Bioseguridad Nivel 2 (BSL2) procedimientos y la certificación. Consulte con su Oficial de Seguridad de la Biotecnología Institucional para la orientación y capacitación sobre los procedimientos de BSL2. <ol><li> Dissect utrículos como anteriormente en los medios de disección (sin suero). Quitar otoconia como anteriormente. </li><li> Cuando esté listo para infectar, transmitir un utrículo (células ciliadas hacia arriba) en cada pocillo de una bandeja de mini-Nunc (Fisher # 12-565-68) que contiene 15 l de suero libre de DMEM F12 (esto es importante porque el suero se puede inactivar el virus) . Esta transferencia es más fácil con un microcurette 1,5 mm (# 10082-15 de las herramientas de la ciencia Artes). </li><li> Nuestro Ad-GFP es el serotipo 5 con los genes virales E1 y E3 eliminadas y el promotor CMV humano impulsando la transgeno (GFP). Este virus se obtuvo de Vector BioLabs (Filadelfia, PA <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Virus de archivo se proporcionan en los títulos de 1.0-4.0 x 10 10 PFU / ml. Añadir 0.5-2 l de virus de acciones a cada pocillo que contiene un utrículo (Figura 1 l). La cantidad real utilizado varía dependiendo del título del virus y de existencias. Por lo general, infectar con el utrículo 1.0-4.0 × 10 7 UFP. </li><li> Cultura en los utrículos de virus que contiene los medios de comunicación a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 2 horas. Después de 2 horas, transferir los utrículos de nuevo a la placa de tejido de 24 pocillos de cultivo que contiene los medios de cultivo con suero. Cultura de los utrículos noche a la mañana a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Utrículos puede ser utilizado al día siguiente para experimentos de imagen en vivo, o pueden ser fijados para inmunoquímica de las células ciliadas (ver más abajo). Viral aumenta la expresión de transgenes en el tiempo, así que si la expresión del transgen es baja a las 24 horas post-infección que puedebeneficioso para células de cultivo de 24 horas adicionales en el suero que contienen medios de comunicación. Si usted ve la toxicidad de las células ciliadas, reducir la cantidad de virus que se utiliza. </li></ol> 3. Fijación utrículo, eliminación otoconia y Inmunoquímica <ol><li> Al final del período de cultivo, fijar utrículos en paraformaldehído al 4%, ya sea para 3 horas a temperatura ambiente (en una plataforma oscilante) o durante la noche a 4 ° C. Lavar utrículos (3 veces, 15 min cada uno) en 0,1 M (1X) de Sorensen tampón fosfato pH 7,4. Estos pasos se llevan a cabo en una placa de tejido 24-pocillos. </li><li> La eliminación otoconia: Nota: otoconia debe ser removido antes de la infección por adenovirus (vea el paso por encima de 1,11). Sin embargo, utrículos que no son para ser infectados pueden ser cultivadas y se fija con el otoconia todavía intacto. En este caso, siga los pasos descritos aquí para sacar el otoconia después de la fijación. Inspeccione utrículos para cualquier epitelio de cubierta pigmentada que queda. Retire con cuidado el epitelio restante con techo de dos # 55 forceps. Para quitar el otoconia, reemplace tampón de Sorensen fosfato con l 750-1000 Cal-Ex descalcificador (Fisher # CS510-1D). Deja Cal-Ex en utrículos durante 1 minuto y 40 segundos (no exceder de 2 minutos). Vuelva a Cal-Ex con 0,1 M tampón fosfato de Sorensen y el lavado (5 veces, 5 minutos cada uno). </li><li> Incubar utrículos en borohidruro de sodio (Sigma # 452882, 1% en agua desionizada) durante 10 minutos. Lave utrículos en tampón fosfato 0,1 M de Sorensen (5 veces, a 5 minutos cada uno). </li><li> Utrículos Colocar en solución de bloqueo (PBS + 2% de albúmina de suero bovino + 0,8% de suero de cabra normal de + 0,4% de Triton X-100) durante 3 horas a temperatura ambiente sobre una plataforma oscilante. </li><li> Añadir anticuerpos primarios y se incuba durante la noche a 4 ° C. Anti-miosina 7a (ya sea Proteus Biosciences # 25-6790 o # 138-1 MYO7A del Banco de Desarrollo de Estudios de hibridoma) a 1:100 en el bloqueo de las etiquetas de todas las soluciones de las células ciliadas. Para etiquetar por separado las células ciliadas y no striolar striolar-, hemos utilizado un PROTOCOLO DE doble etiquetal con anticuerpo monoclonal anti-calmodulina (Sigma C # 3545; 1:150) y policlonal anti-calbindina (Chemicon # AB1778, Temecula, California, EE.UU., 1:200). Los anticuerpos secundarios (por lo general Alexa Fluor anticuerpos secundarios conjugados de Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) se diluyen 1:500 en solución de bloqueo y se incubó durante 4 horas en la oscuridad a temperatura ambiente en una plataforma oscilante. </li><li> Mount utrículos en portaobjetos de cristal utilizando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, EE.UU.). </li></ol> 4. Los resultados representativos Utrículos cultivadas con este método mantener completa era de las células ciliadas y las células de soporte (Figura 2). Las células ciliadas en los cultivos sanos muestran perfiles redondos nucleares rodeados de finas regiones citoplasmáticas que son la miosina 7a-positivo (Figura 2, panel superior). Células de soporte (marcadas con anti-Sox2) son más pequeños y más densamente poblado de células ciliadas (Figura 2, panel inferior). Adeadenovirus infecta a 25-50% de las células de apoyo en el utrículo, y no se infectan las células ciliadas (Figura 2, Ad-GFP paneles). Cabe señalar que el título de trabajo óptima de cada adenovirus se debe determinar empíricamente, desde la muerte de la célula de pelo es posible si el título viral es demasiado alto. Además, las regiones de daños mecánicos (causados ​​durante la disección) se llevará a grandes cantidades de virus. Estas regiones de los daños mecánicos son fácilmente distinguibles por una línea continua de células con niveles muy elevados de expresión de las buenas prácticas agrarias y que faltan las células ciliadas. Esto está en contraste con la expresión de GFP dispersa en el apoyo de las células de un cultivo sin daños (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Utrículo disección. R: C La ampolla se rompe utilizando dos pinzas fuertes::. Bulla auditiva (AB) B. Bony cóclea (OR = ventana redonda, S =. la arteria estapedial, C = cóclea, ST = estribo) D: Una hoja de bisturí (SB) se utiliza para cortar el vértice de la cóclea apical del nervio craneal VIII (8 º N) = ASC canal semicircular anterior E..: La preparación se mantiene firmemente con una pinza # 3 con un tenedor insertado en el canal semicircular anterior (ASC) y la otra en el hueso más externa (flechas). El laberinto membranoso se elimina el uso de fórceps. F: Con el laberinto membranoso eliminado, la vuelta basal de la lámina espiral ósea es visible cerca de la zona de ganchos. Una sonda fina se inserta debajo de esta plataforma ósea para levantar la plataforma y retírela (flecha) G:. Después de la eliminación del sáculo, utrículo (U) es visible inmediatamente adyacente a la base del estribo (SF) H:. Utrículo (U ) se retira con una pinza # 55 (flecha) SF = base del estribo I:.. utrículo con otoconia (O) elimina parcialmente unad sensoriales epitelio (SE) debajo visibles J:. otoconia (O) se elimina de la utrículo con una corriente de medio entregado por una jeringa provista de una aguja de calibre 26. La sombra de la aguja (S) es visible en la parte inferior de la imagen K:. Utrículo con otoconia eliminado y el epitelio sensorial (SE), visibles L:. Infección viral: cada utrículo (U) se coloca en un individuo bien de una mini bandeja de entrada. Las células de apoyo están infectadas con el adenovirus al vaso del virus en el pozo (P = punta de la pipeta). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Infección mediada por adenovirus de células de soporte. Utrículos estaban infectados con adenovirus expresión motriz de la proteína verde fluorescente (Ad-GFP). Se muestran imágenes confocal de la capa de células del cabello y la capa de células de apoyo en la misma área de un utrículo. Las células ciliadas se marcan con un anticuerpo contra la miosina 7a(Magenta). Las células de apoyo están etiquetados con un anticuerpo contra Sox2 (rojo). Esquema muestra la estructura del epitelio sensorial utrículo y las ubicaciones de las células ciliadas (HC) y células de soporte (SC). Lugares de confocal (óptico) secciones mostradas en la parte superior (U) y baja (L) paneles se indican mediante líneas de trazos en el esquema. Paneles superiores: En confocal de imágenes tomadas en el nivel de los núcleos de las células ciliadas, Ad-GFP señal aparece en los espacios entre las células ciliadas y no se solapa con la 7a células ciliadas miosina marcador. Reducción de los paneles: En las secciones confocal en el ámbito de los núcleos de células de apoyo, Ad-GFP señal de co-localiza con el marcador de células de apoyo Sox-2. Ad-GFP infección da lugar a la expresión de GFP en las células de sostén solamente, y no las células ciliadas están infectadas. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. La infección viral no se traduce en la muerte de las células ciliadas o células de apoyo. Utricles fueron infectadas con Ad-GFP a 4 x 10 8 PFU / ml. Utrículos fueron marcadas con anticuerpos contra la miosina 7a (marcador de células de cabello) y Sox2 (compatible con marcador de células). Células del pelo y el apoyo a los recuentos de células eran iguales para utrículos de control y las buenas prácticas agrarias Ad-utrículos infectados.

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No hay conflictos de interés declarado.

Las células sensoriales del cabello son susceptibles a la muerte causada por una variedad de tensiones, incluyendo el envejecimiento, el trauma del ruido, y la exposición a fármacos ototóxicos, incluyendo los antibióticos aminoglicósidos y el cisplatino agente antineoplásico. En los resultados de los mamíferos de pelo de muerte celular en la pérdida permanente de la audición y / o alteración de equilibrio. En los sistemas de modelos in vitro son instrumentos esenciales para los estudios dest...

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Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medio 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Bella pinza (# 55)</td&gt;<td&gt; Herramientas de Ciencias Bellas</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Bella pinza (# 5)</td&gt;<td&gt; Herramientas de Ciencias Bellas</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzas (# 3)</td&gt;<td&gt; Herramientas de Ciencias Bellas</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicilina G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Suero bovino fetal</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini bandeja de</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirus-GFP</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex descalcificador</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Borohidruro sódico</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-miosina 7a (policlonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biociencias</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-miosina 7a (monoclonal)</td&gt;<td&gt; Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calmodulina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotechnology Asociados</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Cuadro 1</strong&gt;. Los reactivos y los instrumentos utilizados en la cultura utrículo y la infección por adenovirus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Nota: Ad-GFP es proporcionada normalmente por Vector Biolabs a un título de valores de 1x10<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Se solicitó una amplificación personalizado con el fin de proporcionar el virus de stock a un título de 1,2 x 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection

La pérdida de audición y trastornos del equilibrio son a menudo causados ​​por la muerte de las células ciliadas mechanosensory, que son las células receptoras del oído interno. Puesto que no hay una línea celular que representa satisfactoriamente células de mamíferos para el cabello, la investigación sobre las células del cabello se basa en cultivos de órganos primarios. El mejor caracterizado en el sistema modelo in vitro de células maduras de pelo de mamífero utiliza cultivos de órganos de utrículos de ratones adultos (Figura 1) 1-6. El utrículo es un órgano vestibular, y las células ciliadas del utrículo son similares en estructura y función de las células ciliadas del órgano de la audición, el órgano de Corti. El ratón adulto preparación utrículo representa un epitelio sensorial madura para el estudio de las señales moleculares que regulan la supervivencia, la homeostasis y la muerte de estas células. Mamíferos células ciliadas cocleares están terminalmente diferenciados y no se regenera cuando se pierden. En no-Mamvertebrados de Malí, auditiva o vestibular de la muerte de las células ciliadas es seguida por una intensa regeneración que restaura las funciones de la audición y el equilibrio de 7, 8. La regeneración de las células ciliadas está mediada por las células gliales como de apoyo, que hacen contacto con las superficies basolateral de las células ciliadas del epitelio sensorial 9, 10. Las células de apoyo también son importantes mediadores de la supervivencia de las células ciliadas y la muerte 11. Recientemente hemos desarrollado una técnica para la infección de células de soporte en utrículos cultivadas utilizando adenovirus. Utilizando adenovirus tipo 5 (dE1/E3) para entregar un transgén que contiene GFP bajo el control del promotor de CMV, encontramos que el adenovirus específicamente y de manera eficiente infecta células de soporte. Apoyo a la eficiencia de infección de células es de aproximadamente 25-50%, y las células ciliadas no están infectadas (Figura 2). Es importante destacar que nos encontramos con que la infección viral de las células de sostén no da lugar a toxicidad para las células ciliadas o células de apoyo, como el recuento de células en Ad-GFP infutrículos eja son equivalentes a las de las no infectadas utrículos (Figura 3). Así, el adenovirus-mediada por la expresión de genes en células de soporte de utrículos cultivadas proporciona una poderosa herramienta para estudiar las funciones de apoyo a las células como mediadores de la supervivencia de las células ciliadas, la muerte y la regeneración.

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Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Mechanosensory células de pelo son las células receptoras del oído interno. El mejor caracterizado<em&gt; In vitro</em&gt; El sistema modelo de células maduras de pelo de mamífero utiliza cultivos de órganos de utrículos de ratones adultos. Se presenta la disección del utrículo ratón adulto, y demostramos mediada por adenovirus una infección de células de soporte en utrículos cultivadas.

La disección de utrículo ratón adulto y mediada por adenovirus infección de reparto de las células

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.6K vistas.  Medical University of South Carolina. Mechanosensory células de pelo son las células receptoras del oído interno. El mejor caracterizado In vitro El sistema modelo de células maduras de pelo de mamífero utiliza cultivos de órganos de utrículos de ratones adultos. Se presenta la disección del utrículo ratón adulto, y demostramos mediada por adenovirus una infección de células de soporte en utrículos cultivadas.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Investigación

Neurociencias

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Fundición cerebrovascular del ratón adulto de imágenes en 3D y el análisis morfológico

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Disección y Cultura de ratón dopaminérgico estriatal en explantes y tridimensionales ensayos matriz de colágeno

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone (SEZ) is a thin and distinct region exposed to the ventricles and cerebrospinal fluid. The isolation of this niche allows the analysis of a neurogenic stem cell microenvironment. However, extraction of small tissues for proteome analysis&#160;is challenging, especially for the maintenance of considerable measurement depth and the achievement of reliable robustness. A new method termed cryo-section-dissection (CSD), combining high precision with minimal tissue perturbation, was developed to address these challenges. The method is compatible with state-of-the-art mass spectrometry (MS) methods that allow the detection of low-abundant niche regulators. This study compared the CSD and its proteome data to the method and data obtained by laser-capture-microdissection (LCM) and a standard wholemount dissection. The CSD method resulted in twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to the LCM and simultaneously clearly outperformed the dissection precision of the wholemount dissection. Hence, CSD is a superior method for collecting the SEZ for proteome analysis.

Cryo-section-dissection allows fresh, frozen preparation of the largest neurogenic niche in the murine brain for deep quantitative proteome analysis. The method is precise, efficient, and causes minimal tissue perturbation. Therefore, it is ideally suited for studying the molecular microenvironment of this niche, as well as other organs, regions, and species.

Disección crioseccional de la zona subependimaria adulta para un análisis cuantitativo preciso y profundo del proteoma

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

Enriquecimiento de cultivos de neuronas de ganglios de la raíz dorsal de ratones adultos mediante inmunopanización

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...