Las preparaciones de superficies cocleares permiten la visualización de toda la lente del órgano de Corti utilizando inmunohistoquímica e imágenes confocales. Se ha utilizado ampliamente para la investigación de patologías cocleares específicas de interés. Modificaremos el método de microdisección coclear.
La principal ventaja de esta técnica es la adherencia de un pedazo de epitelio coclear a los cubreobjetos redondos de 10 milímetros para el procedimiento de inmunoetiquetado evitando la pérdida de tejido durante los múltiples pasos de lavado. Además de patologías cocleares, la preparación de la superficie coclear también se puede utilizar para la expresión de evaluación y la regeneración de células pilosas. Se requieren habilidades básicas de microscopio para esta técnica y la demostración visual del método puede ayudar a garantizar que cada paso se realiza correctamente.
Demostrando el procedimiento estará Qiaojun Fang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para la extracción ósea temporal, inmediatamente post-mortem tirar de la piel antes para exponer el hueso del cráneo y utilizar tijeras para cortar el hueso desde el aspecto posterior hacia adelante a lo largo de la línea central del cráneo. Usa fórceps para extirpar el tejido cerebral antes de usar el pulgar y el dedo índice para extraer manualmente los huesos temporales de ratones de tres meses de edad o más.
Coloque los huesos en un plato Petri de 30 milímetros de diámetro que contenga hielo fresco 4%PFA y PBS bajo un microscopio de disección y retire las estapas de la ventana ovalada. Perfore la membrana de la ventana redonda con el número cinco fórceps y utilice una aguja de calibre 27 unida a una jeringa de un mililitro que contenga 4%PFA fresco para hacer un pequeño agujero en el ápice de la cóclea. Perfume suavemente y lentamente la cóclea con una solución fijadora a través de las ventanas redondas y ovaladas hasta que la solución se lave fuera del pequeño orificio en el ápice.
A continuación, transfiera hasta dos cócleas perfundidas en viales individuales de centelleo de 20 mililitros que contengan 10 mililitros de 4%PFA por vial y agitar suavemente las muestras durante dos horas a temperatura ambiente, seguido de un almacenamiento nocturno a cuatro grados Celsius en un rotador. A la mañana siguiente, lave la cóclea con tres lavados de cinco minutos con PBS fresco por lavado. Después del último lavado, añadir 20 mililitros de 4%EDTA a cada vial y rotar las muestras durante 48 horas a cuatro grados Centígrados con agitación suave.
Al final de la incubación, toque la porción vestibular ósea de cada cóclea con fórceps para evaluar la elasticidad de las muestras. Si los huesos son elásticos en lugar de firmes, la cóclea se ha descalcificado. Sustituya el EDTA para cada muestra por PBS fresco.
Para la microdisección del epitelio coclear, agarre la porción vestibular del hueso temporal con fórceps y use un bisturí para cortar el giro apical en un ángulo de 45 grados. Corte verticalmente a lo largo de la línea débil entre la ventana redonda y la ventana ovalada para separar la cóclea de la parte vestibular y orientar la porción coclear con el giro basal hacia la parte inferior y media gira hacia la parte superior de la placa Petri. Desde esta posición, corte la cápsula ósea y la pared lateral del giro medio hacia el extremo del cual se quitó la sección apical y continúe cortando para separar completamente la parte media de las regiones basales y de gancho.
Colocación de la porción basal y de gancho con el sitio de membrana basilar orientado hacia la parte inferior de la placa, corte verticalmente los medialis de la región de gancho para eliminar los medialis y corte las regiones basales y de gancho para separar la porción del gancho. Para evitar la distorsión del tejido, corte los medialis de la región de gancho antes de separar la región basal de giro y gancho. Cortar las porciones relativamente grandes de la cápsula ósea y el tejido de pared lateral de la vuelta media y sosteniendo la pared lateral con fórceps para alinear la cápsula ósea y la pared lateral con la parte inferior de la placa Petri, cortar estos tejidos del lado de la membrana basilar.
A continuación, aplanar la muestra para orientar la superficie de la célula del cabello sensorial hacia arriba y recortar el resto de la cápsula ósea y la pared lateral. A continuación, utilice fórceps para eliminar la membrana tectorial para separar completamente la región media y eliminar la cápsula ósea, el tejido de pared lateral y las regiones tectoriales de los giros restantes como se acaba de demostrar. Cuando todos los giros cocleares hayan sido diseccionados, esparza 0,5 microlitros de adhesivo celular y tisular en el centro de un cubreobjetos redondo de 10 milímetros y deja que el adhesivo se seque durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente.
Coloque los cubreobjetos secos en la placa de Petri y pegue las cuatro piezas de cada muestra de epitelio sensorial en un cubreobjetos. A continuación, utilice fórceps para agarrar un borde de cada cubreobjetos para transferir los especímenes a pozos individuales de un plato de cultivo celular de cuatro pocús para el etiquetado inmunológico. Para el inmunoetiquetado de preparaciones de sinapsis coclear superficial, lave cada epitelio sensorial tres veces durante cinco minutos en PBS fresco por lavado, seguido del tratamiento de cada muestra con dos mililitros de 2% de tensioactivo no iónico durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rotador.
Al final de la incubación, aspirar la solución surfactante de cada pocadura y bloquear cualquier unión no específica con 100 microlitros de solución de bloqueo por pozo durante una hora en el rotador con agitación suave a temperatura ambiente. Al final de la incubación de bloqueo, lave las muestras tres veces con PBS como se demuestra bajo agitación suave antes de etiquetar cada epitelio con 100 microlitros de los anticuerpos primarios de interés durante 24 horas a 37 grados Celsius protegidos de la luz. Al día siguiente, lave las muestras tres veces con PBS fresco y agitación suave por lavado y etiquete las muestras con 100 microlitros de los anticuerpos secundarios de interés apropiados durante dos horas a 37 grados Centígrados protegidos de la luz.
Al final de la incubación, lave las muestras con tres lavados de cinco minutos en PBS fresco por lavado antes de colocar cada tapa en diapositivas individuales del microscopio de vidrio con las muestras hacia arriba. A continuación, agregue cuidadosamente ocho microlitros de un medio de montaje adecuado en el centro de cada cubreobjetos y utilice fórceps para montar otro cubreobjetos de 10 milímetros en cada muestra. A continuación, selle los lados de cada sándwich de cubreobjetos con esmalte de uñas transparente, coloque las muestras en una carpeta de diapositivas de cartón y guarde las diapositivas a cuatro grados centígrados.
Aunque la disección de cócleo de ratón adulto para preparaciones superficiales no es simple, los investigadores nuevos en la técnica deben ser capaces de aprender el método después de practicar con 10 a 15 orejas. El inmunoetiquetado de las preparaciones superficiales de ratones CBAJ de 10 a 12 semanas de edad sin tratar con CTBP2 y GluA2 demuestra que tanto las cintas presinápticas como los terminales postsinápticos se encuentran respectivamente debajo de los núcleos de células capilares internas y se yuxtaponen indicando sinapsis funcionales. El inmunoetiquetado para la miosina 7A y la contramancha con falhalloidina y DAPI revela la presencia de células pilosas sensoriales, incluidas las células externas del cabello y las células internas del cabello y sus núcleos.
El inmunoetiquetado para la miosina 7A y la contramancha con falhalloidina no muestra diferencias en inmunoreactividad o uniformidad con o sin el uso de adhesivo celular y tisular. Además, la microscopía electrónica de barrido de preparaciones superficiales de ratones C57 negros 6 de seis a ocho semanas de edad demuestran una estereocilia en forma de V bien organizada de células del cabello exteriores en tres filas de la muestra. Recuerde llenar el coclear con solución fijadora suavemente y lentamente a través de las ventanas redondas y ovaladas hasta que la solución se lave fuera del pequeño agujero en el ápice.
Antes de separar la región de gancho del giro basal, tenga cuidado de cortar los medialis de la región de gancho para facilitar la eliminación de los medialis.
