Agradecemos a los revisores por sus sugerencias reflexivas que ayudaron a mejorar este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas a MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) y la mensajería instantánea (AI073898, GM056927) de los NIH. MK fue apoyado en parte por una subvención del NIH formación (5T32 AI007180).

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	<li>Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+duration+of+growth+factor+signaling+through+receptor+tyrosine+kinases+regulates+HSV-1+latency+in+neurons.">Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons.</a> Cell Host &#38; Microbe. 8, 320-330 (2010).</li><li>Johnson, M. I., Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+sympathetic+ganglia.">Primary cultures of sympathetic ganglia.</a> Protocols for Neural Cell Culture. , 71-94 (2001).</li><li>Letourneau, P. C., Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+substrata+for+in+vitro+culture+of+neurons.">Preparation of substrata for in vitro culture of neurons.</a> Protocols for Neural Cell Culture. , 245-254 (2001).</li><li>Price, J. P., Brewer, G. J., Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+media+for+neural+cell+cultures.">Serum-free media for neural cell cultures.</a> Protocols for Neural Cell Culture. , 255-264 (2001).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins.">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).</li><li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection.">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).</li><li>Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+glycoprotein+E+is+required+for+axonal+localization+of+capsid,+tegument,+and+membrane+glycoproteins.">Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins.</a> J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).</li><li>Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+us11+gene+product+with+the+cellular+kinesin+light-chain-related+protein+PAT1+results+in+the+redistribution+of+both+polypeptides.">Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides.</a> J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).</li><li>Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).</li><li>Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+class+of+thiourea+compounds+that+inhibit+herpes+simplex+virus+type+1+DNA+cleavage+and+encapsidation:+resistance+maps+to+the+UL6+gene.">Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene.</a> J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).</li><li>Newcomb, W. W., Brown, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+immediate-early+and+early+gene+expression+during+reactivation+from+latency+under+conditions+that+prevent+infectious+virus+production.">Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production.</a> J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).</li><li>Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+promoter+activity+during+latency+establishment,+maintenance+and+reactivation+in+primary+dorsal+root+neurons+in+vitro.">Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro.</a> J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).</li><li>Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+induce+reactivation+of+herpes+simplex+virus+type+1+in+a+latency-associated+transcript-+independent+manner+in+neuronal+cells.">Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells.</a> J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).</li><li>Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxed+repression+of+herpes+simplex+virus+type+1+genomes+in+murine+trigenminal+neurons.">Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons.</a> J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).</li><li>Harris, R. A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+latency+in+vitro+by+the+herpes+virus+type+1+mutant+in1918.">Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918.</a> J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).</li><li>Wagner, E. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+investigation+of+herpes+simplex+virus+latency.">Experimental investigation of herpes simplex virus latency.</a> Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).</li><li>Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+and+functional+comparison+of+the+latency-associated+transcript+promoters+of+herpes+simplex+virus+type+1+strains+KOS+and+McKrae.">A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae.</a> J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).</li><li>Stroop, W. G., Banks, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS-63+does+not+cause+acute+or+recurrent+ocular+disease+and+does+not+reactivate+ganglionic+latency+in+vivo.">Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo.</a> Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).</li><li>Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+latent+herpes+simplex+virus+type+1+genome+copy+number+in+individual+neurons+is+virus+strain+specific+and+correlates+with+reactivation.">The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation.</a> J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).</li><li>Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+analysis+of+the+avirulent+wild-type+herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS.">Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS.</a> J. Virol. 58, 203-211 (1986).</li><li>Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor-dependence+of+herpes+simplex+virus+latency+in+peripheral+sympathetic+and+sensory+neurons+in+vitro.">Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro.</a> J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).</li><li>Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+vestibular+ganglion+neurons+demonstrate+latent+herpes+simplex+type+I+reactivation.">Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation.</a> Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).</li><li>Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culture+model+of+facial+palsy+resulting+from+reactivation+of+latent+herpes+simplex+virus+type+1.">A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1.</a> Otology &#38; Neurotology. , (2012).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Esta cultura de la neurona y el sistema de la infección primaria proporciona un método simple y eficaz para explorar los mecanismos moleculares que subyacen a HSV-1 de latencia y reactivación. El sistema fielmente recapitula los punzones aceptados de latencia definidos, tanto en infecciones humanas y en modelos de animales vivos. Cuando el virus está latente en los cultivos SCG, las partículas virales infecciosas y productos génicos líticas no puede ser detectada. El único produ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 70μm filtro de nylon (filtro de células) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Solución Salina Equilibrada de 1x de Hank (HBSS - / -) </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> w / o CaCl 2 y MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1x Medios de Comunicación Esencial Mínimo (MEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11095-080 </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina </td><td> Sigma </td><td> F0503 </td><td> preparar a 20 mM de existencias en 1x MEM; almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Plano de 96 y placas de fondo de cooperación técnica </td><td> Corning </td><td> 3599 </td><td></td></tr><tr><td> Aciclovir </td><td> &lt;em&gt; Calbiochem </td><td> 114798 </td><td> preparar 31 mM de existencias en DMSO; almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Aphidicolin </td><td> Calbiochem </td><td> 178273 </td><td> preparar 10 mM de existencias en DMSO; almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> B-27 Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-44 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa </td><td> Sigma </td><td> C2674 </td><td> preparar a 10 mg / ml de caldo en HBSS - / -; almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> D-(+)-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> preparar a un 40% de valores en H 2 O, filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> La laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td><td> preparar a 1 mg / ml de caldo de H2O; congelar rápidamente 20 laliquats y almacenan a -80 ° C; diluido a 2 mg / ml de HCl conc trabajo. en el H 2 O estéril </td></tr><tr><td> Leibovit&#39;z L-15 los medios de comunicación </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de crecimiento nervioso </td><td> Harlan Laboratorios </td><td> BT.5017 </td><td> preparar a 50 mg / ml de caldo en HBSS - / -; se almacena a -80 ° C </td></tr><tr><td> Medio Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfonoacético ácido (PAA) </td><td> Sigma </td><td> P6909 </td><td> preparar a 75 mg / ml de caldo de H 2 O, almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina hidrobromuro </td><td> Sigma </td><td> P0899 </td><td> preparar a 20 mg / ml de caldo de H 2 O, almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> De cola de rata colágeno </td><td> Millipore </td><td> 08-115 </td><td>La concentración varía con mucha oferta, se almacena a 4 ° C y se diluye a 0,66 mg / ml concentrado de trabajo. en el H 2 O estéril </td></tr><tr><td> Tricostatina A </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td> preparar 1 mM de existencias en DMSO; almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Tripsina 2,5% </td><td> Invitrogen </td><td> 15090-04 </td><td></td></tr></tbody></table>

a primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation

El virus herpes simple tipo-1 (VHS-1) establece una infección latente de por vida en las neuronas periféricas. Este reservorio latente es la fuente de eventos de reactivación recurrentes que garantizar la transmisión y contribuir a la enfermedad clínica. Antivirales actuales no afectan el depósito latente y no existen vacunas. Si bien los detalles moleculares de la replicación lítica son bien caracterizados, los mecanismos de control de la latencia en las neuronas siguen siendo esquivas. Nuestra comprensión actual de la latencia se deriva de los estudios in vivo con modelos de animales pequeños, que han sido indispensables para definir los requisitos de genes virales y el papel de la respuesta inmune. Sin embargo, es imposible de distinguir efectos específicos sobre la relación de virus neurona de consecuencias más generales de infección mediadas por las células inmunes de apoyo o no neuronales en los animales vivos. Además, la experimentación con animales es costoso, consume mucho tiempo, y limitado en términos de las opciones disponibles para la manipulación de acogidaprocesos. Para superar estas limitaciones, un sistema de neuronas sólo se necesita desesperadamente que reproduce el de las características in vivo de la latencia y reactivación, pero ofrece las ventajas del cultivo de tejidos en términos de homogeneidad y la accesibilidad. La mayor parte Aquí se presenta un modelo in vitro utilizando cultivos de neuronas simpáticas de rata primaria superior, ganglio cervical (SCG) (Figura 1) para estudiar el VHS-1 de latencia y reactivación que se adapte a si no todos los criterios deseados. Después de eliminar las células no neuronales, casi homogéneas TrkA + cultivos de neuronas están infectadas con HSV-1 en presencia de aciclovir (ACV) para suprimir la replicación lítico. Tras la eliminación de ACV, no productivas las infecciones por HSV-1 que presentan fielmente características aceptadas de latencia se estableció de manera eficiente. En particular, los ARNm líticas, proteínas, y el virus infeccioso hace indetectable, incluso en ausencia de selección, pero asociado a la latencia-transcripción (LAT) expresanión persiste en los núcleos neuronales. Genomas virales se mantienen a un número de copias promedio de 25 por neurona y pueden ser inducidas a replicar productivamente al interferir con la PI3-quinasa / señalización Akt o la simple retirada de factor de crecimiento nervioso 1. Un recombinante VHS-1 EGFP codificación fusionada a la proteína viral lítico US11 proporciona una funcional, en tiempo real para la replicación marcador resultante de reactivación que es fácilmente cuantificado. Además de los tratamientos químicos, metodologías genéticas tales como la interferencia del ARN o el gen de entrega a través de vectores lentiviral puede aplicarse con éxito al sistema de estudios sobre el mecanismo que permite que son muy difíciles, si no imposible, en los animales. En resumen, el SCG-basado en el VHS-1 latencia / reactivación del sistema proporciona una herramienta poderosa, necesaria para desentrañar los mecanismos moleculares que controlan la HSV1 latencia y reactivación de las neuronas, un enigma de larga data en virología, cuya solución puede ofrecer nuevas ideas en el desarrollo de nuevas terapias que objetivo tse reserva latente virus del herpes.

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A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

El protocolo se describe un sistema modelo eficiente y reproducible para estudiar virus herpes simplex tipo 1 (VHS-1) latencia y reactivación. El ensayo emplea cultivos de neuronas simpáticas homogéneos y permite la disección molecular de las interacciones neurona-virus utilizando una variedad de herramientas incluyendo la interferencia de ARN y la expresión de proteínas recombinantes.

Un sistema de neuronas cultivo primario para el estudio de la latencia del virus del herpes simple y Reactivación

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

a-primary-neuron-culture-system-for-study-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.2K vistas.  New York University School of Medicine. El protocolo se describe un sistema modelo eficiente y reproducible para estudiar virus herpes simplex tipo 1 (VHS-1) latencia y reactivación. El ensayo emplea cultivos de neuronas simpáticas homogéneos y permite la disección molecular de las interacciones neurona-virus utilizando una variedad de herramientas incluyendo la interferencia de ARN y la expresión de proteínas recombinantes.