Nos gustaría agradecer a los miembros de los laboratorios de Edgar y Linington, en particular al Prof. Chris Linington, la Dra. Diana Arseni y la Dra. Katja Muecklisch, por sus consejos, comentarios útiles y asistencia para alimentar las culturas mientras establecemos estas culturas. Un agradecimiento especial al Dr. Muecklisch por proporcionar los puntos de partida para las tuberías de Cell Profiler. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad de EM (subvención 122) y la fundación Yuri y Lorna Chernajovsky a MP; Financiación de la Universidad de Glasgow a JC y MP; y Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) y Medical Research Council (MRV0109721) a GJG.

Todos los experimentos con animales cumplieron con las leyes y pautas locales para el uso de animales, y fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética local de la Universidad de Glasgow. Los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales del Reino Unido de 1986, bajo los auspicios de una Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior del Reino Unido. Para este estudio, se utilizaron ratones adultos C57BL / 6J criados internamente. Se recomienda el uso de mujeres jóvenes (8-12 semanas) debido a la mayor tasa de éxito del embarazo; Los machos pueden ser reutilizados para múltiples rondas de reproducción. La Figura 1 representa una descripción esquemática del método descrito para generar cultivos neuronales y gliales mixtos.
1. Preparación de los consumibles de cultivo de tejidos
<ol><li>Prepare los platos y/o platos que contengan cubreobjetos de microscopía dentro de un gabinete de seguridad de Clase 2. Esterilizar todos los reactivos o autoclaves para asegurar la esterilidad durante el período de cultivo.</li>
	<li>Agregue el volumen apropiado de BA-PLL (13.2 μg/mL poli-L-lisinahidrobromuro [PLL] en tampón de ácido bórico [BA] [50 mM de ácido bórico, 12.5 mM de tetraborato de sodio, pH 8.5]; ver Tabla de materiales) a cada pocillo (1,000 μL/pocillo en una placa de 6 pocillos, 100 μL/pocillo en una placa de 96 pocillos; los volúmenes se resumen en la Tabla 1). Para los cubreobjetos de microscopía, agregue 20 ml de BA-PLL a una placa de cultivo de tejidos de 9 cm de diámetro que contenga 200 cubreobjetos estériles y agite para distribuir uniformemente.</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante 1-2 h.</li>
	<li>Retire la solución de BA-PLL de cada pocillo o plato que contenga cubreobjetos de microscopía y lávelos agregando 20 ml de agua estéril, agitando los cubreobjetos y luego retirando el agua. Repita este paso de lavado tres veces. Para un plato que contiene cubreobjetos, deje agua estéril en el plato de cultivo de tejidos en el lavado final para quitar fácilmente los cubreobjetos.</li>
	<li>Retire la mayor cantidad de líquido posible con una pipeta estéril y deje secar durante al menos 2 h durante toda la noche.</li>
	<li>Conservar las placas recubiertas a 4 °C durante un máximo de 2 meses. NOTA: La solución de ácido bórico preparado con poli-l-lisina (BA-PLL) se puede reutilizar hasta tres veces, agregando nueva PLL cada vez. Conservar el BA-PLL a 4 °C. Los platos se tratan con BA-PLL, ya que el PLL permite que las células se peguen y crezcan. Sin este tratamiento, las células se levantarán después de aproximadamente 1 semana de cultivo y ya no podrán diferenciarse.</li>
</ol>2. Disección de cerebros embrionarios E17
<ol><li>Co-casa uno o varios ratones hembra con un ratón macho. Revise a las hembras diariamente para ver si hay un tapón de moco, lo que indica que se ha producido el apareamiento. NOTA: Cualquier ratón hembra "tapado" debe separarse del macho para garantizar la fecha correcta de inicio de la gestación. Los ratones pueden ser pesados para confirmar el embarazo o monitoreados visualmente.</li>
	<li>Sacrificar a la ratona preñada en E17 utilizando métodos apropiados de acuerdo con las directrices y leyes locales de bienestar animal, por ejemplo, aumentando la concentración de dióxido de carbono (CO2), una sobredosis de anestesia letal o la dislocación del cuello. NOTA: El método elegido no debe interrumpir los embriones. Para este estudio, la exposición a una concentración creciente de gas de dióxido de carbono seguida de la confirmación de la muerte por corte de la arteria femoral se utilizó para sacrificar a las madres embarazadas.</li>
	<li>Coloque el ratón preñado sacrificado sobre su espalda en una tabla de disección; Si bien no es necesario fijarlo, podría hacerlo más fácil para los investigadores sin experiencia. Pellizque la línea media del abdomen con fórceps. Con unas tijeras afiladas, abra el abdomen a través de la piel y el peritoneo sobre la línea media desde los genitales hasta la caja torácica, teniendo cuidado de no perforar el útero.<ol><li>El útero del ratón tiene dos cuernos, cada uno típicamente contiene de uno a cinco embriones. Retire el útero que contiene los embriones de la madre e inmediatamente colóquelo en hielo.</li>
	</ol></li>
	<li>Corte a través del saco vitelino en el lado de las placentas, teniendo cuidado de no dañar los embriones, y retire los embriones de su saco vitelino.</li>
	<li>Decapitar inmediatamente los embriones. Agregue las cabezas decapitadas en un plato con la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) sin calcio (Ca 2+) y magnesio (Mg2+) (HBSS-/-) en hielo. NOTA: Si se requiere genotipado, se puede quitar la cola en esta etapa para el análisis genético. Cuando se esperan múltiples genotipos, las cabezas de cada embrión deben mantenerse separadas para el cultivo.</li>
	<li>Usando pinzas en ángulo, coloque la cabeza de lado mirando hacia la izquierda.</li>
	<li>Perfore el ojo con un borde de los fórceps, sujetando firmemente la barbilla con el otro.</li>
	<li>Comenzando en la nuca, rasgue suavemente la piel del cuero cabelludo a lo largo de la línea media hacia la punta del hocico.</li>
	<li>Al entrar a través de la médula espinal, notable como un óvalo blanco, use los fórceps en ángulo para abrir el cráneo a lo largo de la línea media, exponiendo el cerebro.</li>
	<li>Despegue suavemente el cráneo del lado hacia arriba, exponiendo el cerebro.</li>
	<li>Levante el cerebro fuera del cráneo, desechando el cráneo una vez que el cerebro se haya eliminado por completo.</li>
	<li>Usando los fórceps, retire las meninges, que se notan como una membrana delgada con vasos sanguíneos densos.</li>
	<li>Coloque los cerebros en una joya (consulte la Tabla de materiales) que contenga 2 ml de HBSS-/- en hielo.</li>
	<li>Repita los pasos 2.6 a 2.13 con los cerebros restantes, sumando hasta cuatro cerebros por bisutería.</li>
	<li>Agregue 250 μL de tripsina 10x a la bisutería y triture los cerebros agitando la bisutería. Incubar durante 15 min a 37 °C. NOTA: Todos los pasos a partir de este punto en adelante deben realizarse en una campana de cultivo de tejido estéril.</li>
	<li>Descongele 2 ml de inhibidor de la tripsina de soja (SD) (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml inhibidor de tripsina de soja, 40 μg/ml DNasa I, 3 mg/ml de albúmina sérica bovina [BSA] fracción V; ver Tabla de materiales) de -20 °C colocándola a 37 °C.</li>
	<li>Agregue 2 ml de inhibidor SD a cada bisutería que contenga cerebros (por bisutería que contenga hasta cuatro cerebros), agitando la bisutería nuevamente para dispersarla uniformemente. NOTA: El inhibidor de SD disminuye la actividad de la tripsina para evitar la digestión innecesaria de las muestras y preservar la viabilidad celular.</li>
	<li>Sin centrifugación, retire 2 ml del sobrenadante de cada bisutería y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 ml, teniendo cuidado de no transferir grupos celulares.</li>
	<li>Triturar las células restantes en la bisutería con una aguja de 19 G conectada a una jeringa de 5 ml aspirando la suspensión dos veces. Esto creará una mezcla espesa similar al moco.<ol><li>Repita dos veces más con una aguja de 21 G. Si quedan grumos, triturar una vez más con la aguja de 21 G.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera las células de la bisutería al mismo tubo centrífugo de 15 ml (a partir del paso 2.18) utilizando una aguja de 23 G.</li>
	<li>Centrifugar a 200 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.</li>
	<li>Retirar todo el sobrenadante con una pipeta serológica de 5 ml y transferirlo a otro tubo de centrífuga de 15 ml, teniendo cuidado de no alterar el pellet suelto en el fondo que contiene las células requeridas.</li>
	<li>Centrifugar de nuevo el sobrenadante a 200 x g a RT durante 5 min. NOTA: Este paso no es esencial, pero si uno requiere muchas células o tiene pocos embriones, se podría realizar este paso para recuperar tantas células como sea posible del sobrenadante.</li>
	<li>Usando 10 ml de medios de recubrimiento (PM) (49% de medio de águila modificado de Dulbecco [DMEM], 1% de penicilina/estreptomicina [Pen/Strep], 25% de suero de caballo, 25% de HBSS con Ca 2+ y Mg2 + [HBSS+ /+]; ver Tabla de materiales), combine y resuspenda los dos gránulos juntos para crear una suspensión de células completas.</li>
	<li>Contar las células usando azul de tripano y un hemocitómetro o contador celular digital, y diluir la suspensión celular con PM a una concentración de 1.8 x 106 células/ml.</li>
</ol>3. Recubrimiento de las células
<ol><li>Agregue el volumen requerido de la suspensión celular al formato requerido como se detalla en la Tabla 1: 1,000 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 100 μL por cubreobjetos.</li>
	<li>Incubar durante 2-4 h a 37 °C con 5%-7% deCO2. Verifique que las células se hayan adherido con un microscopio invertido.</li>
	<li>Retire el medio y rellene con un nuevo medio de diferenciación (DM+: DM- incluyendo insulina de 10 μg/ml. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM hidrocortisona, 10 ng/mL de biotina, 2.5 mL 100x N1 suplemento de medios; véase la Tabla de materiales). Los volúmenes se detallan en la Tabla 1. Presione cualquier cubreobjetos flotantes con una punta de pipeta estéril.</li>
</ol>4. Mantener las culturas
NOTA: Estos cultivos requieren alimentación tres veces por semana para apoyar el crecimiento y la diferenciación óptimos. Los cultivos alcanzarán una salud y madurez óptimas para experimentos en DIV (días in vitro) 21. Las células se pueden mantener en cultivo hasta por 28 días, después de lo cual los cultivos degeneran rápidamente.
<ol><li>Tres veces por semana hasta DIV12, sustituir parte del sobrenadante por DM+ fresca eliminando 500 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 500 μL por plato que contenga tres cubreobjetos, y añadiendo 600 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 60 μL por pocillo en formato de 96 pocillos, o 600 μL por plato de cubreobjetos (Tabla 1).</li>
	<li>Tres veces por semana a partir de la DIV13, sustituir parte del sobrenadante por DM- fresca eliminando 500 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 500 μL por plato que contenga tres cubreobjetos, y añadiendo 600 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 60 μL por pocillo en formato de 96 pocillos, o 600 μL por plato de cubreobjetos (Tabla 1).</li>
</ol>

Cultivos celulares mixtos de cerebro de ratón embrionario para estudiar la infección y la inmunidad innata

<ol>
	<li>Kovacs, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+reactions+of+the+central+nervous+system.">Cellular reactions of the central nervous system.</a> Handbook of Clinical Neurology. 145, 13-23 (2018).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, (1959).</li><li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+and+humane+experimental+technique:+Implementing+change.">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754 (2019).</li><li>Thomson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=synapsing+cultures+of+murine+spinal+cord-validation+as+an+in+vitro+model+of+the+central+nervous+system.">synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system.</a> The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).</li><li>Bijland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+for+studying+CNS+white+matter:+Functional+properties+and+experimental+approaches.">An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches.</a> F1000Research. 8, 117 (2019).</li><li>Fragkoudis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+and+oligodendrocytes+in+the+mouse+brain+differ+in+their+ability+to+replicate+Semliki+Forest+virus.">Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus.</a> Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).</li><li>Hayden, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-specific+IgMs+induce+antiviral+responses+in+the+CNS:+Implications+for+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+in+multiple+sclerosis.">Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).</li><li>Kantzer, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-ACSA-2+defines+a+novel+monoclonal+antibody+for+prospective+isolation+of+living+neonatal+and+adult+astrocytes.">Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes.</a> Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).</li><li>Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+and+macrophages+in+CNS+homeostasis,+autoimmunity,+and+cancer.">The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer.</a> Journal of Immunology Research. 2017, (2017).</li><li>Gee, J. R., Keller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+Regulation+of+brain+homeostasis+via+apolipoprotein+E.">Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).</li><li>Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+myelination:+possible+roles+of+the+immune+proteasome+in+oligodendroglial+homeostasis+and+dysfunction.">Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction.</a> Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).</li><li>Keller, D., Er&#246;, C., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+densities+in+the+mouse+brain:+A+systematic+review.">Cell densities in the mouse brain: A systematic review.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).</li><li>Wang, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenglucose+deprivation+enhancement+of+cell+death/apoptosis+in+PC12+cells+and+hippocampal+neurons+correlates+with+changes+in+neuronal+excitatory+amino+acid+neurotransmitter+signaling+and+potassium+currents.">Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents.</a> Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).</li><li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+response+to+cell+death.">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).</li><li>Chen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology+atlas+of+the+developing+prenatal+and+postnatal+mouse+central+nervous+system,+with+emphasis+on+prenatal+days+E7.5+to+E18.5.">Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5.</a> Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).</li><li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li><li>Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+decades+of+new+drug+development+for+central+nervous+system+disorders.">Two decades of new drug development for central nervous system disorders.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).</li><li>Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+new+approaches+in+CNS+drug+discovery:+Why+drugs+have+failed,+and+what+can+be+done+to+improve+outcomes.">The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes.</a> Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2+cells+(polydendrocytes)+in+brain+physiology+and+repair.">NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).</li><li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+brain+organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells:+Promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders.">3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).</li><li>Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+and+actin-containing+filaments+of+normal,+preneoplastic,+and+neoplastic+mouse+mammary+epithelial+cells.">Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells.</a> Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).</li><li>Koch, K. S., Leffertt, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+of+differentiated+adult+rat+hepatocytes+in+primary+culture.">Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).</li><li>Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+the+infiltrating+immune+cells+in+the+brain+of+healthy+individuals:+effect+of+aging.">Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging.</a> Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).</li><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El SNC es una red compleja que se extiende desde el cerebro hasta la médula espinal y consta de muchos tipos de células, predominantemente neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglía1. Como cada célula tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y la generación de respuestas apropiadas a los desafíos en el SNC 9,10,11, un sistema de cultivo que contenga todos estos tipos de células es una herra...

Mejorar nuestra comprensión del sistema nervioso central (SNC) es fundamental para mejorar las opciones terapéuticas para muchas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. El SNC, una compleja red de células interconectadas dentro del cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos, comprende neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y sus células inmunes innatas, la microglía1. Un enfoque in vitro a menudo puede reducir drásticamente el número de ratones necesarios para realizar una investigación significativa; sin embargo, la naturaleza compleja del SNC hace imposible recapitular la situación in vivo utilizando líneas celulares. Los cultivos celulares neuronales mixtos proporcionan una herramienta de investigación extremadamente valiosa para investigar cuestiones de neuro(inmuno)logía en un modelo relevante, en línea con los principios de Reemplazo, Reducción y Refinamiento (3R) 2,3.
Thomson et al. describieron un método de cultivo celular utilizando células de la médula espinal prenatal que se diferencian en todos los tipos principales de células del SNC antes mencionados4. Este sistema también tiene formación de sinapsis, axones mielinizados y nodos de Ranvier. La principal limitación de este método de cultivo es que, al ser la médula espinal, no modela de manera útil el cerebro, y los rendimientos celulares de la médula espinal del día embrionario 13 (E13) son constrictivos. Por lo tanto, esto limita el número de condiciones experimentales que se pueden investigar. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un nuevo sistema de cultivo celular que recapitule las características del cerebro con un mayor rendimiento celular para reducir los requisitos de los animales.
Usando Thomson et al. como punto de partida, desarrollamos un modelo de cultivo celular derivado puramente de cerebros de ratones prenatales. Estos cultivos tienen las mismas poblaciones celulares, interconectividad y opciones de tratamiento que los cultivos de la médula espinal, excepto que hay menos mielinización en comparación. Sin embargo, tener un modelo in vitro del SNC con un rendimiento celular aproximadamente tres veces mayor es más eficiente, ya que requiere menos ratones y menos tiempo procesando embriones. Optimizamos este sistema de cultivo único para múltiples aplicaciones y escalas aguas abajo, incluido el uso de cubreobjetos de vidrio para el análisis de microscopía y varios tamaños de placas de pozos de plástico, incluidas placas de 96 pocillos para investigación de alto rendimiento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4549-100ML</td>
			<td>To digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm TC Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11339283</td>
			<td>Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td>To collect cells into pellet for resuspension in plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710012040</td>
			<td>For trituration of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304432</td>
			<td>For trituration of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710006030</td>
			<td>For trituration of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15869152</td>
			<td>For trituration of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Bijoux</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DIS080010R</td>
			<td>To put brains intp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>To plate out cells for high-throughput testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-123-284</td>
			<td>For flow cytometry staining of astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0108-5/45-PO</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4501</td>
			<td>For DM+/-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td>For boric acid buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101825</td>
			<td>For flow cytometry staining of neurons and astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103139</td>
			<td>For flow cytometry staining of microglia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101243</td>
			<td>For flow cytometry staining of microglia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-10G</td>
			<td>For SD Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6319</td>
			<td>Mature oligodendrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0149</td>
			<td>To plate out cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scissors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3146-1EA</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21969-035</td>
			<td>For DM+/-, and for plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>18047019</td>
			<td>For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td>For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td>Live / Dead stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0102-SS135-PO</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w Ca Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9269-500ML</td>
			<td>For plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/o Ca Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9394-500ML</td>
			<td>For brains to be added to</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>For plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td>For DM+/-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1</td>
			<td>Alpha-Laboratories</td>
			<td>019-1971</td>
			<td>Microglia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1882</td>
			<td>For DM+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15</td>
			<td>GIbco</td>
			<td>11415-049</td>
			<td>For SD Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA409S</td>
			<td>Myelin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit</td>
			<td>BioTechne</td>
			<td>DY478-05</td>
			<td>ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 media supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6530-5ML</td>
			<td>For DM+/-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB353</td>
			<td>Neuronal stem/progenitor cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PA578499</td>
			<td>Neuronal cell body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Immature oligodendrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-119-155</td>
			<td>For flow cytometry staining of oligodendrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>For DM+/-, and for plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysinehydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1274</td>
			<td>For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI31</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>Axons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Tetraborate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221732-100G</td>
			<td>For boric acid buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>For lysing cells for RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003-100MG</td>
			<td>For SD Inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing mixed neuronal and glial cell cultures from embryonic mouse brains to study infection and innate immunity

Los modelos del sistema nervioso central (SNC) deben recapitular la compleja red de células interconectadas que se encuentran in vivo. El SNC consiste principalmente en neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y microglía. Debido a los crecientes esfuerzos para reemplazar y reducir el uso de animales, se han desarrollado una variedad de sistemas de cultivo celular in vitro para explorar las propiedades celulares innatas, que permiten el desarrollo de terapias para infecciones y patologías del SNC. Si bien ciertas preguntas de investigación pueden ser abordadas por sistemas de cultivo celular basados en humanos, como las células madre pluripotentes (inducidas), trabajar con células humanas tiene sus propias limitaciones con respecto a la disponibilidad, los costos y la ética. Aquí, describimos un protocolo único para aislar y cultivar células de cerebros embrionarios de ratones. Los cultivos celulares neuronales mixtos resultantes imitan varias poblaciones celulares e interacciones que se encuentran en el cerebro in vivo. En comparación con los métodos equivalentes actuales, este protocolo imita más de cerca las características del cerebro y también obtiene más células, lo que permite investigar más condiciones experimentales de un ratón preñado. Además, el protocolo es relativamente fácil y altamente reproducible. Estos cultivos se han optimizado para su uso en varias escalas, incluidas las pantallas de alto rendimiento basadas en 96 pocillos, el análisis de microscopía de 24 pocillos y los cultivos de 6 pocillos para citometría de flujo y análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Este método de cultivo es una herramienta poderosa para investigar la infección y la inmunidad dentro del contexto de algunas de las complejidades del SNC con la conveniencia de los métodos in vitro .

Improving our understanding of the central nervous system (CNS) is critical to improve therapeutic options for many neuroinflammatory and neurodegenerative diseases. The CNS, a complex network of interconnected cells within the brain, spinal cord, and optic nerves, comprises neurons, oligodendrocytes, astrocytes, and their innate immune cells, the microglia1. An in vitro approach can often drastically reduce the number of mice required to perform meaningful research; however, the complex nature of the CNS makes it impossible to recapitulate the in vivo situation using cell lines. Mixed neural cell cultures provide an extremely valuable research tool to investigate neuro(immuno)logy questions in a relevant model, in line with the Replacement, Reduction and Refinement (3Rs) principles2,3.
Thomson et al. described a cell culture method using prenatal spinal cord cells that differentiate into all the aforementioned main CNS cell types4. This system also has synapse formation, myelinated axons, and nodes of Ranvier. The main limitation of this culturing method is that, being spinal cord, it does not usefully model the brain, and the cell yields from embryonic day 13 (E13) spinal cords are constricting. Thus, this limits the number of experimental conditions that can be investigated. Therefore, this study aimed to develop a new cell culture system that recapitulates the characteristics of the brain with increased cell yield to reduce the requirements for animals.
Using Thomson et al. as a starting point, we developed a cell culture model derived purely from prenatal mouse brains. These cultures have the same cell populations, interconnectivity, and treatment options as the spinal cord cultures, except there is less myelination by comparison. However, having a CNS in vitro model with an approximately threefold higher cell yield is more efficient, requiring fewer mice and less time processing embryos. We optimized this unique culture system for multiple downstream applications and scales, including using glass coverslips for microscopy analysis and various sizes of plastic well plates, including 96-well plates for high throughput research.

Autor destacado: Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratón para estudiar la infección y la inmunidad innata  

Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata

The ultimate research question of my project is to figure out how we can manipulate the innate immune responses of the central nervous system to protect against viral infections. Currently, we research their response to the profoundly antiviral protein interferon beta. An experimental challenge is generating enough cells to allow for detailed investigation.Each result needs to be validated using multiple techniques and this can, unfortunately, result in many animals being culled. Due to the large number of cells generated by this novel culture technique, many different experimental conditions can be investigated from one pregnant mouse. Additionally, using in vitro alternatives, where possible, also greatly decreases animal suffering.This method reduces and refines animal use, closely following the principles of the three Rs.This culture method can be used to address many different research questions using a variety of readout methods such as ELISA, qPCR, microscopy and flow cytometry. This technique could help other researchers to reduce and refine their animal usage. We hope to improve our understanding of the innate antiviral response, modulating it to protect against opportunistic viruses such as human polyomavirus 2, or John Cunningham virus, as it is commonly known, the primary agent of PML which can be a severe side effect of immune suppressive drugs used to treat MS and other diseases.

Microscopia Los cultivos cultivados en cubreobjetos de vidrio son ideales para analizar por microscopía. Para visualizar el desarrollo de los cultivos, los cubreobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) en múltiples puntos de tiempo desde DIV0 (una vez que las células se unieron) hasta DIV28. Los cultivos se tiñeron para imágenes de inmunofluorescencia como se describió anteriormente5 utilizando tres combinaciones de tinción diferentes: NG2 (oligodendrocitos in...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity at JoVE.com

Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

La última pregunta de investigación de mi proyecto es descubrir cómo podemos manipular las respuestas inmunes innatas del sistema nervioso central para proteger contra las infecciones virales. Actualmente, investigamos su respuesta a la proteína profundamente antiviral interferón beta. Un desafío experimental es generar suficientes células para permitir una investigación detallada.Cada resultado debe validarse utilizando múltiples técnicas y esto puede, desafortunadamente, resultar en el sacrificio de muchos animales. Debido a la gran cantidad de células generadas por esta novedosa técnica de cultivo, se pueden investigar muchas condiciones experimentales diferentes de un ratón preñado. Además, el uso de alternativas in vitro, cuando sea posible, también disminuye en gran medida el sufrimiento de los animales.Este método de cultivo se puede utilizar para abordar muchas preguntas de investigación diferentes utilizando una variedad de métodos de lectura como ELISA, qPCR, microscopía y citometría de flujo. Esta técnica podría ayudar a otros investigadores a reducir y refinar su uso de animales. Esperamos mejorar nuestra comprensión de la respuesta antiviral innata, modulándola para proteger contra virus oportunistas como el poliomavirus humano 2 o el virus John Cunningham, como se conoce comúnmente, el agente primario de PML que puede ser un efecto secundario grave de los medicamentos inmunosupresores utilizados para tratar la EM y otras enfermedades.

establishing-mixed-neuronal-glial-cell-cultures-from-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

1.7K vistas.  University of Glasgow. La última pregunta de investigación de mi proyecto es descubrir cómo podemos manipular las respuestas inmunes innatas del sistema nervioso central para proteger contra las infecciones virales. Actualmente, investigamos su respuesta a la proteína profundamente antiviral interferón beta. Un desafío experimental es generar suficientes células para permitir una investigación detallada.Cada resultado debe validarse utilizando múltiples técnicas y esto puede, desafortunadamente, re...

Video: Autor destacado: Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratón para estudiar la infección y la inmunidad innata  

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

Investigación

Neurociencias

Murine E17 Embryonal Brain Dissection, Cell Plating, and Maintenance

Begin by placing a sacrificed pregnant mouse on its back on a dissection board. Using forceps, pinch the abdominal midline. With a pair of sharp scissors, cut the abdomen through the skin and the peritoneum from the genitalia to the rib cage over the midline.Remove the uterus containing the embryos and place it immediately on ice. Carefully cut through the yolk sac on the placental sides and remove the embryos. Then, place the decapitated embryonic heads into an iced dish containing calcium and magnesium-deficient HBSS.Place the head into a 35-millimeter dish facing left. Pierce one eye with the edge of the forceps, firmly holding the chin with the other. Gently tear the scalp skin from the nape along the midline towards the snout.Use the angled forceps to enter through the white oval spinal cord and crack the skull open along the midline, exposing the brain. Gently peel the skull away from the sides. Then, lift the brain out of the skull and dispose of the skull.Use forceps to remove the meninges. Place the brains in a bijou containing two milliliters of calcium and magnesium-deficient HBSS. Add 250 microliters of 10X trypsin to the bijou.Triturate the brains by shaking the bijou and then incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius. Next, add two milliliters of soybean trypsin inhibitor to each bijou. Shake to disperse the inhibitor evenly.Without centrifuging, transfer two milliliters of the supernatant from each bijou into a 15-milliliter centrifuge tube. Using a 19-gauge needle attached to a five-milliliter syringe, aspirate the suspension twice to triturate the remaining cells in the bijou. Repeat aspiration twice with a 21-gauge needle.Using a 23-G needle, transfer the cells from the bijou into the 15-milliliter centrifuge tube containing the cell supernatant and centrifuge at 200 G for five minutes at room temperature. Using a five-millimeter serological pipette, transfer all the supernatant into a new 15-milliliter centrifuge tube without disturbing the pellet. Repeat centrifugation.Add 10 milliliters of the plating media to a tube containing the combined pellets from both centrifugation steps and mix well to create a whole suspension. Stain the cells with trypan blue and count using a hemocytometer or a cell counter. Plate the cells by adding the required volume of the murine E17 embryonic brain cell suspension into a well plate.Incubate the cells at 37 degrees Celsius under 5 to 7%carbon dioxide for two to four hours. After removing the media, add new differentiation media to each well. Press down any floating cover slips using a sterile pipette tip.Maintain cultures by removing part of the supernatant and replacing it with fresh differentiation media three times each week. Cultures were visualized by immunofluorescence staining for NG2 and nestin as developmental markers, SMI31, MBP, and NeuN as neuronal markers, and CNP, GFAP and Iba1 as glial markers Infection of cultures with neurotropic Semliki Forest virus affected the oligodendrocytes and the neurons. qRT-PCR investigations of the infected cells demonstrated upregulation of the chemotactic cytokine Ccl5 mRNA in cultures treated with interferon beta.ELISA studies displayed increased Ccl5 in the supernatant, thus displaying a correlation between mRNA and protein expression. Flow cytometric studies of single-cell suspension showed that 70%of the cells remained viable. A large number of microglia, neurons, and astrocytes were present, while oligodendrocytes were the least abundant.