Ringraziamo i revisori per i loro suggerimenti premurosi che hanno contribuito a migliorare questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni a favore di MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) e IM (AI073898, GM056927) dal NIH. MK è stata sostenuta in parte da una formazione sovvenzione del NIH (5T32 AI007180).

<ol>
	<li>Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+duration+of+growth+factor+signaling+through+receptor+tyrosine+kinases+regulates+HSV-1+latency+in+neurons.">Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons.</a> Cell Host &#38; Microbe. 8, 320-330 (2010).</li><li>Johnson, M. I., Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+sympathetic+ganglia.">Primary cultures of sympathetic ganglia.</a> Protocols for Neural Cell Culture. , 71-94 (2001).</li><li>Letourneau, P. C., Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+substrata+for+in+vitro+culture+of+neurons.">Preparation of substrata for in vitro culture of neurons.</a> Protocols for Neural Cell Culture. , 245-254 (2001).</li><li>Price, J. P., Brewer, G. J., Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+media+for+neural+cell+cultures.">Serum-free media for neural cell cultures.</a> Protocols for Neural Cell Culture. , 255-264 (2001).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+family+Herpesviridae:+A+brief+introduction.">The family Herpesviridae: A brief introduction.</a> Fields Virology. 2, 2381-2397 (2001).</li><li>Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+infection+of+isolated+autonomic+neurons+in+culture:+viral+replication+and+spread+in+a+neuronal+network.">Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network.</a> Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).</li><li>Tomishima, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins.">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).</li><li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection.">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).</li><li>Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+glycoprotein+E+is+required+for+axonal+localization+of+capsid,+tegument,+and+membrane+glycoproteins.">Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins.</a> J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).</li><li>Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+us11+gene+product+with+the+cellular+kinesin+light-chain-related+protein+PAT1+results+in+the+redistribution+of+both+polypeptides.">Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides.</a> J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).</li><li>Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus:+propagation,+quantification+and+storage.">Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).</li><li>Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+class+of+thiourea+compounds+that+inhibit+herpes+simplex+virus+type+1+DNA+cleavage+and+encapsidation:+resistance+maps+to+the+UL6+gene.">Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene.</a> J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).</li><li>Newcomb, W. W., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+herpes+simplex+virus+replication+by+WAY-150138:+assembly+of+capsids+depleted+of+the+portal+and+terminase+proteins+involved+in+DNA+encapsidation.">Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation.</a> J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).</li><li>Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+immediate-early+and+early+gene+expression+during+reactivation+from+latency+under+conditions+that+prevent+infectious+virus+production.">Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production.</a> J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).</li><li>Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+promoter+activity+during+latency+establishment,+maintenance+and+reactivation+in+primary+dorsal+root+neurons+in+vitro.">Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro.</a> J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).</li><li>Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+induce+reactivation+of+herpes+simplex+virus+type+1+in+a+latency-associated+transcript-+independent+manner+in+neuronal+cells.">Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells.</a> J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).</li><li>Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxed+repression+of+herpes+simplex+virus+type+1+genomes+in+murine+trigenminal+neurons.">Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons.</a> J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).</li><li>Harris, R. A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+latency+in+vitro+by+the+herpes+virus+type+1+mutant+in1918.">Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918.</a> J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).</li><li>Wagner, E. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+investigation+of+herpes+simplex+virus+latency.">Experimental investigation of herpes simplex virus latency.</a> Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).</li><li>Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+and+functional+comparison+of+the+latency-associated+transcript+promoters+of+herpes+simplex+virus+type+1+strains+KOS+and+McKrae.">A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae.</a> J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).</li><li>Stroop, W. G., Banks, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS-63+does+not+cause+acute+or+recurrent+ocular+disease+and+does+not+reactivate+ganglionic+latency+in+vivo.">Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo.</a> Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).</li><li>Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+latent+herpes+simplex+virus+type+1+genome+copy+number+in+individual+neurons+is+virus+strain+specific+and+correlates+with+reactivation.">The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation.</a> J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).</li><li>Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+analysis+of+the+avirulent+wild-type+herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS.">Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS.</a> J. Virol. 58, 203-211 (1986).</li><li>Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor-dependence+of+herpes+simplex+virus+latency+in+peripheral+sympathetic+and+sensory+neurons+in+vitro.">Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro.</a> J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).</li><li>Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+vestibular+ganglion+neurons+demonstrate+latent+herpes+simplex+type+I+reactivation.">Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation.</a> Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).</li><li>Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culture+model+of+facial+palsy+resulting+from+reactivation+of+latent+herpes+simplex+virus+type+1.">A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1.</a> Otology &#38; Neurotology. , (2012).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questa cultura neurone primario e l&#39;infezione del sistema fornisce un metodo semplice ed efficace per esplorare i meccanismi molecolari alla base HSV-1 la latenza e la riattivazione. Il sistema riprende fedelmente le caratteristiche di latenza accettati definiti in entrambe le infezioni umane ed in live-modelli animali. Quando il virus è latente nelle culture SCG, particelle virali infettive e prodotti genici litici non può essere rilevato. L&#39;unico prodotto del gene virale rilevato in neuroni ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Comments </td></tr><tr><td> 70μm nylon filtro (filtro cella) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Salt 1x Hank soluzione equilibrata (HBSS - / -) </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> w / o CaCl 2 e MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1x supporti minimi essenziali (MEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11095-080 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2&#39;-desossiuridina </td><td> Sigma </td><td> F0503 </td><td> preparare 20 mM in 1x MEM, da conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> 96 e piastre piane TC ben inferiori </td><td> Corning </td><td> 3599 </td><td></td></tr><tr><td> Acyclovir </td><td> &lt;em&gt; Calbiochem </td><td> 114798 </td><td> preparare 31 mM in DMSO; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Afidicolina </td><td> Calbiochem </td><td> 178273 </td><td> preparare stock 10 mM in DMSO; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> B-27 Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-44 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Sigma </td><td> C2674 </td><td> preparare i 10 mg / ml in magazzino HBSS - / -; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> preparare 40% stock in H 2 O; filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td><td> preparare 1 mg / ml in magazzino H 2O; rapido congelamento 20 plaliquats e conservare a -80 ° C, diluita a 2 ug / ml di lavoro conc. sterile in H 2 O </td></tr><tr><td> Leibovit&#39;z L-15 supporti </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Nerve Growth Factor </td><td> Harlan Laboratories </td><td> BT.5017 </td><td> preparare i 50 mg / ml in magazzino HBSS - / -, da conservare a -80 ° C </td></tr><tr><td> Media Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348 </td><td></td></tr><tr><td> Acido fosfonoacetico (PAA) </td><td> Sigma </td><td> P6909 </td><td> preparare i 75 mg / ml in magazzino H 2 O; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Poly-D-lisina bromidrato </td><td> Sigma </td><td> P0899 </td><td> preparare i 20 mg / ml in magazzino H 2 O; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Rat-tail collagene </td><td> Millipore </td><td> 08-115 </td><td>Concentrazione varia con il lotto di fornitura; conservare a 4 ° C e diluire a 0,66 mg / ml conc di lavoro. sterile in H 2 O </td></tr><tr><td> A tricostatina </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td> preparare 1 mM in DMSO; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Tripsina 2,5% </td><td> Invitrogen </td><td> 15090-04 </td><td></td></tr></tbody></table>

a primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation

Herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) stabilisce una vita lunga infezione latente nei neuroni periferici. Questo serbatoio latente è la fonte di eventi riattivazione ricorrenti che garantiscono la trasmissione e contribuire alla malattia clinica. Antivirali attuali non influenzano il serbatoio latente e non ci sono vaccini. Mentre i dettagli molecolari di replicazione litico sono ben caratterizzati, meccanismi che controllano la latenza nei neuroni rimangono elusivi. La nostra attuale comprensione di latenza è derivato da studi in vivo su modelli animali di piccole dimensioni, che sono stati indispensabili per la definizione dei requisiti dei geni virali e il ruolo delle risposte immunitarie. Tuttavia, è impossibile distinguere effetti specifici sul virus-neurone rapporto da conseguenze più generali di infezione mediati da cellule immunitarie di sostegno o non neuronali in animali vivi. Inoltre, la sperimentazione animale è costosa, richiede tempo, e limitate in termini di opzioni disponibili per la manipolazione di accoglienzaprocessi. Per superare queste limitazioni, un neurone solo sistema è disperatamente necessario che riproduce la vivo nelle caratteristiche di latenza e la riattivazione, ma offre i vantaggi di coltura tissutale in termini di omogeneità e di accessibilità. Qui vi presentiamo un modello in vitro utilizzando colture di neuroni primari dai gangli simpatici rat cervicale superiore (SCG) (Figura 1) per studiare HSV-1 la latenza e la riattivazione che si adatta maggior parte se non tutti i criteri desiderati. Dopo aver eliminato cellule non neuronali, vicino omogenei TrkA + colture neuronali sono infettati con HSV-1 in presenza di acyclovir (ACV) per sopprimere la replicazione litico. Dopo la rimozione ACV, non produttivi infezioni da HSV-1 che presentano caratteristiche fedelmente accettato di latenza sono stabiliti in modo efficiente. In particolare, mRNA litici, proteine ​​e virus infettivo diventa non rilevabile, anche in assenza di selezione, ma latenza associata trascrizione (LAT) expression persiste in nuclei neuronale. Genomi virali sono mantenuti ad un numero medio di copie 25 per neurone e possono essere indotte a replicare produttivamente interferendo con PI3-chinasi / Akt segnalazione o il ritiro semplice del nerve growth factor 1. A ricombinante HSV-1 EGFP codifica fusa alla proteina virale US11 litico fornisce uno funzionale, in tempo reale marcatore per la replica risultante da riattivazione che è facilmente quantificato. In aggiunta ai trattamenti chimici, metodologie genetiche come la RNA-interferenza o il gene di consegna attraverso vettori lentivirali può essere applicato con successo al sistema di autorizzazione gli studi meccanicistici che sono molto difficili, se non impossibile, negli animali. In sintesi, il SCG-based HSV-1 la latenza / riattivazione sistema fornisce un potente strumento necessario per svelare i meccanismi molecolari che controllano HSV1 latenza e riattivazione nei neuroni, un puzzle di lunga data in virologia, la cui soluzione può offrire nuove intuizioni nello sviluppo di nuove terapie che obiettivo tsi riserva herpesvirus latente.

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A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Il protocollo descrive un sistema modello efficiente e riproducibile per studiare herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) latenza e riattivazione. Il dosaggio utilizza omogenei culture neurone simpatico e consente la dissezione molecolare del virus-neurone interazioni utilizzando una varietà di strumenti interferenza tra RNA e l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti.

A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

a-primary-neuron-culture-system-for-study-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.2K Views.  New York University School of Medicine. Il protocollo descrive un sistema modello efficiente e riproducibile per studiare herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) latenza e riattivazione. Il dosaggio utilizza omogenei culture neurone simpatico e consente la dissezione molecolare del virus-neurone interazioni utilizzando una varietà di strumenti interferenza tra RNA e l'espressione di proteine ​​ricombinanti.