La impresión 3D integrada dentro de los compuestos SHAPE supera las limitaciones tradicionales de biofabricación para permitir un patrón preciso de tejidos mecánicamente sensibles dentro de hidrogeles que se asemejan al entorno extracelular nativo. La caja de herramientas SHAPE se basa en el diseño modular de biomateriales, lo que permite cambios fáciles en la formulación del soporte de impresión. También aprovecha materiales de bajo costo y equipos accesibles para una simple adaptación por parte de otros grupos de investigación.
Este enfoque se puede aplicar para crear modelos de tejido neural humano definidos espacialmente para examinar el desarrollo neuronal y la comunicación en trastornos neurodegenerativos como el Parkinson. Comience preparando una solución de carbonato de calcio en agua ultrapura a una concentración de dos miligramos por mililitro. Mezclarlo con la solución de alginato en una proporción igual y removerlo magnéticamente a 650 RPM durante una hora a temperatura ambiente.
Luego agregue ácido acético a esta mezcla en una proporción de uno a 500 y revuelva nuevamente durante la noche. Al día siguiente, fragmente mecánicamente la solución de alginato gelatinado en micropartículas a 15, 000 RPM durante 10 minutos usando un homogeneizador. Luego centrifugar para obtener las micropartículas.
Deseche cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las partículas en el DMEM, que contiene dos hidróxido de sodio milimolar y estreptomicina al 1%. El color de la suspensión debe cambiar de nuevo a rojo. Incubar la suspensión durante la noche a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, homogeneice la suspensión durante tres minutos a 15, 000 RPM y centrifugar a 18, 500 G durante 10 minutos. Después de centrifugar, retire el sobrenadante y observe el pellet en busca de micropartículas de alginato apretadas. Para generar el compuesto SHAPE, mezcle el pellet de micropartículas de alginato con colágeno diluido y neutralizado en una proporción de dos a uno y pipetearlo hacia arriba y hacia abajo en hielo.
Transfiera el material compuesto generado a una placa enfriada de 24 pocillos. Antes de imprimir, disocie las células madre neurales humanas previamente cultivadas o hNSC utilizando una solución de tripsina al 0,025% durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Luego neutralizar la tripsina con el medio de crecimiento y centrifugar la suspensión celular a 400 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de retirar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en dos o tres mililitros de medio de crecimiento. Usando una aguja de metal romo calibre 21, cargue 100 microlitros de micropartículas de alginato apretadas en la jeringa. Luego cargue la suspensión celular preparada en una jeringa.
Para imprimir, reemplace la aguja de carga con una aguja de metal romo de calibre 27. Usando el software de referencia, una vez que se diseña la estructura a imprimir, haga clic en generar para una generación de código G. Inserte la jeringa cargada con células en un cabezal de extrusión volumétrica en una bioimpresora basada en extrusión y registre la longitud de la aguja haciendo clic en iniciar el proceso de medición de la longitud de la aguja.
A continuación, coloque la placa de 24 pocillos cargada con el compuesto SHAPE en la impresora y haga clic en SHM para medir la altura de la superficie del pozo vacío. Seleccione pH 2 seguido del símbolo de llave inglesa. Luego, en el conjunto de parámetros, cambie el caudal volumétrico a 3.6 microlitros por segundo y presione Aplicar parámetro, seguido de Guardar y listo.
Cargue el código G en la interfaz de usuario de la impresora haciendo clic en un icono para abrir el código G. Seleccione el icono del programa de ejecución para iniciar el procedimiento de impresión. Inmediatamente después de imprimir, incubar el gel SHAPE a 37 grados centígrados durante 30 minutos para recocido.
A continuación, agregue suavemente el medio de crecimiento al soporte de gel SHAPE recocido. Para la inmunotinción, retire el exceso de medio del gel y, con una espátula, transfiera el gel a un recipiente que contenga DPBS. Una vez que la placa esté colocada en la campana extractora, retire el DPBS.
Cubra el gel con una solución de formaldehído al 4% e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar con DPBS, agregue la solución de bloqueo al gel. Mece la placa suavemente e incuba durante seis horas a temperatura ambiente para evitar una unión inespecífica.
Una vez que se retire la solución de bloqueo, agregue el anticuerpo primario al gel y sacuda suavemente. Incubar el plato durante 48 horas a cuatro grados centígrados. Después del lavado DPBS, trate de manera similar el gel con la solución de anticuerpos secundarios durante 24 horas.
Coloque el gel teñido con una espátula en una placa de pocillo con un fondo de imagen delgado antes de obtener imágenes. En el presente estudio, la tinta hNSC imprimió un filamento de células con un diámetro de alrededor de 200 micrómetros. Las hebras impresas eran ricas en células viables con morfología alrededor.
Después de 30 días de impresión, las células exhibieron morfología neural con cuerpos celulares pequeños y procesos largos y delgados, lo que indicó la diferenciación exitosa de hNSC. La tinción con tubulina beta tres permitió la visualización de las redes neuronales generadas con geometría mantenida. Y durante el proceso de diferenciación, las células no migraron fuera de las hebras impresas.
El compuesto SHAPE se puede utilizar para producir canales perfusibles imprimiendo tinta de sacrificio en lugar de celdas. Además, el soporte puede incluir perlas sensibles al oxígeno para monitorear la tensión de oxígeno en estructuras impresas en 3D a lo largo del tiempo y el espacio.
