Nos gustaría dar las gracias a Michaela Jansen en el Centro de Ciencias de la Salud de Texas Tech University, Lubbock, TX y Mladen Yovchev en la Universidad de Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA para el pcDNA proporcionar generosamente 3.1 myc-Su (A) y hEF1α promotor que contiene plásmidos . Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud con el número premio R01HD037109 (a CCM). El apoyo adicional fue desde el Instituto Bush W. Laura para la Salud de la Mujer (a CCM y PNG). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

1. En Silico Diseño del plásmido y la generación de los cebadores superpuestos NOTA: El objetivo de este paso es ensamblar secuencia de nucleótidos completa de la construcción y el diseño de los cebadores que se utilizan para generar fragmentos con extremos solapados para GA clonación. <ol><li> Diseñar una secuencia de nucleótidos continua para representar el plásmido final. </li><li> Obtener o una lista de los plásmidos reales y los fragmentos de ADN que se utilizarán como plantillas en PCR. NOTA: los fragmentos de ADN que no son fácilmente disponibles - como diferentes combinaciones de etiquetas y promotores - se pueden pedir como fragmentos individuales o múltiples sintéticos de ADN bicatenario (sADN). Estos fragmentos están comercialmente disponibles a costos relativamente bajos y pueden ser de hasta 2 kb de longitud (véase la Tabla de Materiales). </li><li> Divida la secuencia de nucleótidos continua de la construcción ensamblada en el paso 1.1 en fragmentos de ADN adecuados para la PCR. Confirmado dem que los fragmentos coinciden plásmidos disponibles y fragmentos sADN. Evite fragmentos de ADN más pequeño que 200 nt. </li><li> Acceda a la herramienta de generación de imprimación (ver Tabla de Equipo). Seleccione el menú &quot;Configuración de Preferencias&quot;. Elegir parámetros haciendo clic en la pestaña &quot;PREFS cambio&quot; en la ventana emergente &quot;Cambiar la configuración de la Asamblea Gibson&quot;. NOTA: Diseño de cebadores también se puede realizar sin el uso de la herramienta de generación de imprimación. Sin embargo, el uso de la herramienta de generación de imprimación simplifica el proceso. </li><li> Empezar a construir el constructo seleccionando el menú &quot;Construir Construir&quot;. Inserte los fragmentos de ADN de división en la forma secuencial herramienta de generación de imprimación de 5 &#39;a 3&#39;. NOTA: El fragmento de ADN utilizado como esqueleto del plásmido puede ser convenientemente dividida en dos piezas. En el producto final de la PCR &#39;final de este primer fragmento y el extremo 3&#39; 5 final de la última fragmento están unidos entre sí en una DN continuoUn fragmento que representa el esqueleto del vector. </li><li> Pegue el primer fragmento de ADN que representa el extremo 5 &#39;del ADN del vector en formato FASTA (una representación basada en texto de secuencia de nucleótidos) en la ventana emergente &quot;Enter Vector o Fragment&quot;. Nombre del fragmento de ADN. Elegir la forma adecuada para obtener el fragmento de ADN, ya sea como PCR, RE Digesto o de síntesis. Haga clic en la pestaña &quot;CONTINUAR&quot;. </li><li> Si hay una necesidad de añadir nucleótidos extra / sitios de restricción en el cruce de la construcción final utilizar los espacios &quot;Fwd o cebador Rev espaciadores&quot; previstas en la opción &quot;Agregar un fragmento de inserción a la asamblea&quot; ventana. Añadir nucleótidos extra / sitios de restricción a sólo uno de los fragmentos de ADN y no a ambos fragmentos. Haga clic en la pestaña &quot;DONE&quot;. </li><li> Repita este procedimiento para todos los fragmentos hasta que el constructo es completa. Seleccione el menú &quot;Ver Primers&quot; y revisar las secuencias de cebadores. </li><li> Repita para todas las construcciones (vector backbones e inserciones), o de fragmentos de ADN que son diferentes. </li></ol> 2. La amplificación de los fragmentos de ADN por PCR utilizando Hot Start Corrección ADN polimerasa (2x Master Mix) NOTA: El objetivo de este paso es obtener suficiente ADN para la reacción de ensamblaje usando PCR. <ol><li> Compra los cebadores de PCR diseñados en el paso anterior como productos y desaladas en la escala más pequeña posible. Diluir a 10 mM en agua o TE (Tris-HCl 10, pH 7,9, EDTA 1 mM). </li><li> Compra fragmentos de ADN que no son fácilmente disponibles como fragmentos sADN. </li><li> Diluir todos los fragmentos de ADN, incluyendo los fragmentos de sADN que serán utilizados como plantillas para las PCRs a 1 ng / l en agua. </li><li> Montar las reacciones de PCR a temperatura ambiente. Brevemente, utilizar 2,5 l (de 10 mM solución madre) de la respectiva cada cebador de la pareja de cebadores, 1 l (de 1 ng solución / l de stock) del fragmento de ADN plantilla, 25 μl de ADN polimerasa corrección de pruebas de arranque en caliente (ADN pol; mezcla maestra 2x; véase la Tabla de Materiales) y 19 l de agua. Mezclar el tubo mediante parpadeo suave y recoger las gotas de líquido por centrifugación breve. </li><li> Amplificar simultáneamente en tubos separados los fragmentos de ADN de tamaño similar de acuerdo con las recomendaciones para el ADN pol. Realizar 25 a 28 ciclos de PCR o determinar el número de ciclos que producen suficiente rendimiento de ADN. </li><li> Ejecutar 10% del volumen de reacción PCR (5 l) en una electroforesis en gel de agarosa estándar teñido con bromuro de etidio (/ ml de concentración final 0,2 g). Asegúrese de que una única banda de ADN que representa el producto de PCR es visible. Determinar el tamaño y la cantidad relativa de los fragmentos de ADN utilizando ADN estándares de peso molecular. Si es necesario, repita el PCR para obtener suficiente cantidad de fragmentos de ADN. </li></ol> 3. DpnI La digestión de los productos de PCR NOTA: El objetivo de este paso es Digest plantilla de ADN plásmido residual de los PCRs en la Sección 2. DpnI digerirá ADN de plásmido sólo si es metilado, tal como ocurre al plásmido de ADN crecido en la presa + cepas bacterianas. Por lo tanto, no tratan con DpnI si plásmido de ADN se utiliza como un fragmento de ADN en la reacción de GA. <ol><li> Añadir 2 l de enzima de restricción DpnI a los 45 l de los productos de PCR producidos en la Sección 2. Incubar a 37 ° C durante 1 hr. Continúe con la Sección 4 o congelación a -20 ° C hasta que se necesite. </li></ol> 4. purificación y concentración de los fragmentos de ADN sobre purificación de ADN de los granos magnéticos NOTA: El objetivo de este paso es purificar y concentrar los productos de PCR obtenidos en las secciones 2 y 3. Otros métodos de purificación de PCR se pueden utilizar también. <ol><li> Equilibrar las perlas magnéticas de purificación de ADN a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las cuentas por breve vórtex. </li><li> Transferir las PCR wi digerido pre-º DpnI a un tubos de 1,5 ml y añadir 81 l de perlas magnéticas de purificación de ADN a cada tubo. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Colocar los tubos en el colector magnética durante aproximadamente 2 min. Deseche el líquido transparente con una pipeta. Lavar dos veces con 200 l de etanol al 80% durante 30 segundos. </li><li> Permitir que los pellets se sequen. Mantenga la tapa de los tubos abierta, con los tubos colocados en el colector magnético. </li><li> Vuelva a suspender las perlas secas en 10 l de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Centrifuga brevemente para recoger el líquido en la parte inferior de los tubos. </li><li> Colocar los tubos en el colector magnético durante 2 min. Retire 8,5-10 l de la solución clara y colocarlo en un nuevo tubo previamente etiquetado. Determinar la concentración de los fragmentos de ADN mediante espectroscopia UV (véase la Tabla de Equipo). </li></ol> 5. Asamblea Clonación de reacción y transformación de los productos en E. coli &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: El objetivo de este paso es calcular 3: 1 de inserción: vector y llevar a cabo la reacción de ensamblaje. <ol><li> Utilice al menos 100 ng del fragmento de ADN que representa el esqueleto del vector o fragmento de ADN que lleva el marcador selectivo. Calcular el exceso molar de 3 veces para los fragmentos de ADN que se utilizarán como insertos. </li><li> Convertir el molar exceso en ng necesaria de cada inserción particular. NOTA: Una forma cómoda de hacer los cálculos es el uso de una aplicación basada en la web (véase la Tabla de Equipo). </li><li> Mezcle cantidades calculadas de fragmentos de ADN en un tubo de PCR, ajustar el volumen de 10 l. Añadir 10 l de la mezcla maestra GA (2x, consulte la Tabla de Materiales). Incubar la reacción a 50 ° C durante 1 hora para el montaje de 4 - 6 o fragmentos de 15 min para el montaje de fragmentos de 2-3 en un ciclador térmico PCR. </li><li> Proceda con la transformación del producto de ensamblaje en E. competente coli o congele los productos a -20° C, hasta que se necesite. </li><li> Siga el procedimiento de transformación que acompaña a la células electro competentes química o. Por lo general, utilizar 2 l de la reacción de ensamblaje por reacción de transformación. </li><li> Después de la transformación es completa, difundir las células transformadas en placas de agar suplementado con el antibiótico selectivo apropiado. </li></ol> 6. El plásmido Aislamiento, Restricción Digestión enzimática y secuenciación NOTA: El objetivo de este paso es aislar ADN plasmídico a partir de E. coli, a continuación, para verificar el constructo mediante digestión de restricción y secuenciación. <ol><li> Propagar varias colonias individuales para mini preparaciones y aislamiento de plásmidos. Durante la noche de cultivo líquido LB Uso 2-5 ml complementa con antibiótico adecuado. Aislar los plásmidos correspondientes siguiendo el procedimiento que se describe en el kit de mini-prep que se utiliza. </li><li> Determinar la cantidad y la concentración de los plásmidos obtenidos utilizando Spectrofotómetro. </li><li> Realizar la digestión de restricción con una o varias endonucleasas de restricción a ~ 0,5 g de los plásmidos purificados. Use enzimas de restricción que proporcionan patrón distinto de característica de digestión para las construcciones de ADN. </li><li> Confirmar el éxito de clonación de ADN mediante secuenciación de ADN utilizando cebadores específicos o estándar. Analizar los datos de secuenciación para la exactitud. </li></ol>

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El uso exitoso de GA clonación debe ser siempre precedido por un diseño cuidadoso de la construcción completa (Figura 2 y Figura 3). También es muy recomendable la verificación cuidadosa de las secuencias de cebadores diseñados por la herramienta de generación de imprimación. Los cebadores para GA se pueden generar sin el uso de la herramienta de generación de imprimación. Sin embargo, el uso de la herramienta es muy recomendable, ya que simplifica el proceso. Generalmente, el cebador para la clonación GA debe tener dos secuencias funcionalmente diferentes. La primera secuencia es fragmento específico de ADN, y permite la amplificación del fragmento de PCR utilizando. La segunda secuencia se solapa con el fragmento adyacente, que es necesario para el montaje GA. Una secuencia típica-DNA-fragmento específico sería 18-22 nt de longitud. Secuencias específicas de ADN fragmento utilizados para amplificar el mismo ADN deben tener temperaturas de fusión similares y contenido de GC. Secuencia de superposición debe ser al menos de 15nt de longitud con una temperatura de fusión de al menos 48 ° C. El conjunto de más de 4 fragmentos de ADN requerirá la secuencia de superposición que ser al menos 20 nt. Superposiciones más largos permitirán un mayor especificidad de la hibridación que resulta en fragmentos de ADN más correctamente ensamblados. Se recomienda evitar secuencias que están sesgadas en su GC o AT contenido en el desarrollo de secuencias superpuestas, porque las secuencias sesgadas podrían comprometer montaje adecuada del ADN. También sugerimos usar como un control negativo, que no debe producir ningún colonias de bacterias resistentes a los fármacos, sólo el fragmento de ADN correspondiente a la cadena principal del vector en una reacción de GA. Por otra parte, uno de los fragmentos de ADN que comprenden las &quot;inserciones&quot; puede omitirse de la reacción GA, que también debería dar lugar a colonias bacterianas resistentes a los medicamentos. La razón no hay colonias crecerán será la falta de extremos superpuestos de los fragmentos de ADN adyacentes, lo que hará que el montaje de un complplásmido ete. En el protocolo descrito, la superposición de secuencias de 25 nt para generar Se utilizaron los conjuntos de cebadores, debido al número de fragmentos de ADN utilizados (Figura 3). La recomendación de la página web de la herramienta de generación de imprimación (véase la Tabla de Equipo) es el uso de al menos 20 nt secuencias superpuestas de montar 4-6 fragmentos de ADN. Además, la superposición de secuencia más larga asegure la complementación adecuada de las cadenas de ADN (véase la Figura 1) aumentar el número de productos ensamblados con precisión. Actualmente, varios sistemas para la clonación sin fisuras están disponibles. Sin embargo, algunos de estos sistemas todavía utilizan enzimas de restricción (es decir, la puerta de oro de clonación 18). Otros utilizan mezclas de propiedad de enzimas basados ​​en virus vaccinia ADN polimerasa y la proteína de unión a ADN de una sola hebra de la misma fuente biológica 19. Ambos sistemas son limitados en comparación con GA por el shorter longitud de secuencias que se solapan. Debido a la superposición de secuencias más cortas podrían no proporcionar la suficiente especificidad para la etapa de hibridación de fragmentos de ADN adyacentes, haciendo que el montaje correcto de más de 23 fragmentos de ADN problemáticos. Estas deficiencias no están presentes en el sistema GA. El tamaño de los fragmentos de ADN a amplificar se debe también considerarse a fin de no exceder el tamaño fiable amplificable por PCR (es decir, menos de 8 kpb de longitud). Incluso con las mejoras en la función de las polimerasas de ADN en los últimos 10 años, grandes fragmentos de ADN se amplificaron con menos eficiencia y precisión. Si es necesario, los fragmentos de ADN más grandes podrían ser obtenidos de otras fuentes alternativas de PCR, por ejemplo, mediante el aislamiento del plásmido y digestión del ADN con enzimas de restricción apropiadas. En concreto, para el protocolo descrito en el manuscrito actual, nuestro racional para utilizar PCR se basó en el tamaño de los fragmentos de ADN disponibles, que eran todos menos de5 kpb. Si hay más de un producto PCR identificado por electroforesis en gel de agarosa, se recomienda la purificación en gel del fragmento de tamaño conveniente utilizando cualquiera de las técnicas de biología molecular disponibles o kits apropiados. En el protocolo actual se utiliza una ADN polimerasa termoestable (véase la Tabla de Materiales). Sin embargo, cualquier ADN polimerasa proporcionando alta fidelidad y rendimiento será adecuado para ser utilizado con este protocolo. Si ADN polimerasas de alta fidelidad diferentes de lo descrito en el protocolo están disponibles, utilice las condiciones establecidas como se describe en los manuales respectivos. En el protocolo actual, E. químicamente competentes coli células se utilizan que se suministra con el kit de GA. E. Alternativamente, química o electro competente cepas de E. coli tales como DH5a o DH10B pueden ser utilizados. El montaje de la clonación de mezcla maestra 2x es fácil de usar con manos en un tiempo mínimo. Sin embargo, se requiere de pipeteado preciso debido a los pequeños volúmenes neEDED a mezclar juntos. Una buena técnica de biología molecular debe ser ejercido en todo momento así. La clonación GA ofrece posibilidades ilimitadas para una construcción de fragmentos de ADN, plásmidos y vectores, que son más de 3 kpb de tamaño. Además tiene un impacto más amplio en el campo de la biología sintética, ya que permite la síntesis y ensamblaje de, por ejemplo, un (Mycoplasma mycoides) genoma entero bacteriana o una levadura (Saccharomyces cerevisiae) cromosoma 20,21. La técnica también es aplicable a la clonación convencional necesita para generar construcciones sin costura. En conclusión, GA clonación ofrece alternativa rápida, fiable y flexible para el procedimiento de clonación de ADN convencional.

Procedimientos de clonación de ADN convencionales se basan en el uso de enzimas de restricción para escindir el ADN y ADN ligasa para unir los fragmentos de ADN juntos. Generación de construcciones de expresión personalizados que contienen diferentes fragmentos de ADN es un procedimiento secuencial que incluye la escisión del ADN con una y / o múltiples endonucleasas de restricción y la posterior inserción de fragmentos de ADN a través de la ligadura. El principal inconveniente de este procedimiento es que las enzimas de restricción adecuadas para uno de los fragmentos de ADN pueden ser difíciles de identificar (es decir, podría tener varios sitios de escisión) de representación de clonación de ADN con éxito de la proteína de longitud completa de interés imposible. Por lo tanto, la generación de expresión personalizada construye bajo la regulación transcripcional de promotores específicos del tipo de células eficiente con proteína-etiquetas personalizadas requiere diseño muy cuidado. También es una técnica de tiempo y mano de obra que consume. Recientemente, varios informes describen metodologías para armar multíparaLe diferentes fragmentos de ADN sintético en una secuencia continua, al mismo tiempo, ya sea en reacciones de uno o de dos pasos sin el uso de enzimas de restricción 1-3. La reacción de la clonación de un solo paso (con exclusión de todos los pasos preparatorios), depende de la utilización de una mezcla de exonucleasa del ADN, ADN polimerasa, ADN ligasa 2,3 y los extremos solapados de fragmentos de ADN (Figura 1). Puesto que no hay uso de enzimas de restricción, fragmentos de ADN de cualquier tamaño y composición de la secuencia (con exclusión de secuencias altamente repetitivas) se pueden fusionar juntos en una construcción sin costuras. Recientemente, un kit comercial (montaje Gibson; GA) para las reacciones de clonación de un solo paso se hizo disponible. Este kit permite un montaje rápido y eficiente y costo de los fragmentos de ADN en un solo vector con los promotores de la medida y etiquetas de proteínas. Los vectores de expresión de plásmidos disponibles ampliamente usados ​​para expresar proteínas exógenas en los modelos de cultivo de células de mamíferos son a menudo bajo la reg transcripcionalulación del citomegalovirus viral (CMV) o el virus 40 (SV40) promotores Simian. Estos promotores virales proporcionan la expresión transitoria robusta de las proteínas exógenos en la mayoría de los modelos basados ​​en cultivos celulares de mamíferos. Sin embargo, la generación de líneas celulares que expresan de manera estable proteínas exógenas es a menudo éxito debido a silenciamiento transcripcional del CMV o promotores de SV40 durante el proceso de establecimiento de 4,5. Además, los promotores de SV40 y CMV viral no suficientemente promover la expresión de proteínas exógenas en células del linaje linfoide o células madre embrionarias 6,7. La solución a la limitación inherente de los promotores virales es el uso de promotores fuertes no virales constitutivos 8-10. Un promotor fuerte no viral constitutiva bien caracterizado de origen humano es el promotor del factor de elongación 1α (hEF1α) (hEF1α está implicado en la catálisis de la asociación dependiente de GTP de aminoacil-tRNA a los ribosomas 11). Sin embargo,vectores de expresión que contienen el promotor hEF1α no son tan ampliamente disponibles como el promotor viral que contiene plásmidos, especialmente los que también contiene 3 × FLAG en el extremo terminal amino de la proteína de interés. La proteína del factor de estimulación de escisión de 64.000 MW (CSTF-64) está implicado en el procesamiento del extremo 3 &#39;de la mayoría de los mRNAs 12,13, incluyendo mRNAs histonas replicación dependiente de 14,15. CSTF-64 se expresa en todos los tejidos somáticos 12. Su motivo de reconocimiento de ARN se une a GU-ricos secuencias de ARN en naciente transcripciones aguas abajo de la escisión y poliadenilación sitio 16. Esta unión de CSTF-64 a la pre-mRNA promueve la escisión endonucleolítica eficiente de la transcripción naciente. Aquí, un protocolo se describe que utiliza amplificación por PCR de los fragmentos de ADN, un kit de clonación de montaje Gibson (que incluye células bacterianas químicamente competentes) para producir vectores personalizados de m-etiquetados 3xFLAGouse CSTF-64 o CSTF-64 mutante a su extremo amino terminal bajo la expresión de hEF1α promotor 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="553">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:196px;">Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA)</td>
			<td style="width:71px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">DNA purification magnetic beads</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Agencourt AMPure XP - PCR Purification system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Plasmid Isolation Mini Kit</td>
			<td style="width:71px;">Omega Bio-Tek Inc</td>
			<td style="width:119px;">D6942-01</td>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E5510S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0494S</td>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">DpnI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NheI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NotI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">HindIII</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>NanoDrop device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">EditSeq</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">SeqBuilder</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Word</td>
			<td style="width:71px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of&#160; Microsoft Office</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBuilder</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>primer generation tool: http://nebuilder.neb.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBioCalculator</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of plasmid vectors expressing flag-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1&#945; promoter using gibson assembly

Asamblea Gibson (GA) clonación ofrece una alternativa rápida, fiable y flexible para métodos de clonación de ADN convencionales. Utilizamos GA para crear plásmidos a medida para la expresión de genes exógenos en células madre embrionarias de ratón (mESCs). La expresión de genes exógenos bajo el control del SV40 o promotores de citomegalovirus humano disminuye rápidamente después de la transfección en mESCs. Un remedio para esta expresión disminuida es utilizar el promotor de factor de elongación humano 1-alfa (hEF1α) para conducir la expresión génica. Los vectores plásmidos que contienen hEF1α no son tan ampliamente disponible como SV40 o plásmidos conteniendo CMV, especialmente aquellos que también contienen N-terminal 3xFLAG-tags. El protocolo descrito aquí es un método rápido para crear plásmidos que expresan etiquetada con FLAG CSTF-64 y CSTF-64 mutante bajo la regulación del promotor expressional hEF1α. GA utiliza una mezcla de exonucleasa del ADN, ADN polimerasa y ligasa de ADN para hacer clonación de extremos de fragmentos de ADN posible superposición.Con base en los ADN de plantilla que teníamos disponible, hemos diseñado nuestros constructos para ser montados en una sola secuencia. Nuestro diseño utiliza cuatro fragmentos de ADN: pcDNA 3.1 vector columna vertebral, hEF1α promotor parte 1, parte 2 hEF1α promotor (que contenía 3xFLAG-tag comprar de un fragmento de ADN sintético de doble cadena), y, o bien CSTF-64 o específica CSTF-64 mutante. Las secuencias de estos fragmentos se cargan en una herramienta de generación de imprimación para diseñar cebadores de PCR adecuados para la generación de los fragmentos de ADN. Después de la PCR, los fragmentos de ADN se mezclaron con el vector que contiene el marcador selectivo y la reacción de clonación GA fue montado. Se aislaron plásmidos a partir de colonias bacterianas transformadas individuales. Pantalla inicial de los plásmidos se realizó por digestión de restricción, seguido por secuenciación. En conclusión, GA nos permitió crear plásmidos a medida para la expresión de genes en 5 días, incluyendo la construcción de pantallas y verificación.

Un flujo de trabajo del protocolo que se siguió se muestra en la Figura 2A. Queríamos clonar CSTF-64 y mutantes CSTF-64 proteínas fusionadas a 3xFLAG etiqueta bajo la regulación del promotor expressional hEF1α (Figura 2B y Figura 3). Un hEF1α plásmido que contiene seguido 3xFLAG-tag no estaba disponible para nosotros. Sin embargo, los siguientes plásmidos estaban disponibles: pcDNA 3.1 myc-Su (A; un generoso regalo de Michaela Jansen), hEF1α plásmido que contiene (un generoso regalo de Mladen Yovchev) y ratón CSTF-64 plásmidos 12 (Figura 3). La secuencia completa para la construcción (s) se ensambla utilizando las aplicaciones de edición de nucleótidos y de texto (Figura 3; véase la tabla de Equipo). Posteriormente, la secuencia (s) se dividió en cuatro piezas convenientes (Figura 2B, bloques de color rojo y la Figura 3) correspondientes a los ADN plasmídicos disponibles. Amplificación primers fueron diseñados utilizando la herramienta de generación de imprimación (véase la Tabla de Equipo) con limitaciones de 4-6 fragmentos con mínima superposición de 25 nt, creada en la ventana emergente &quot;Cambiar la configuración de la Asamblea Gibson&quot;. Sitios de restricción NheI y NotI se incluyeron en el diseño del cebador con el propósito de identificar los plásmidos correctamente reunidos. NheI sitio se encuentra en la secuencia del cebador entre pcDNA 3.1 y el extremo 5 &#39;del promotor hEF1α. Noti sitio está ubicado después del codón de parada (UGA) de CSTF-64 y pcDNA 3.1 vector columna vertebral. Durante la digestión simultánea con el fragmento de ADN ambas enzimas que consiste en el promotor hEF1α, 3xFLAG y CSTF-64 o mutante CSTF-64 se dará a conocer (véase más adelante y en la Figura 2B). Los cebadores se ordenan en la escala más pequeña posible y desalados. La segunda parte del promotor hEF1α fragmento de ADN que contiene 3xFLAG-tag (490 pb, la Figura 2B, Figura 3) se adquirió como un solo fragmento sDNA (see Tabla de Materiales). Los fragmentos de ADN utilizados en la reacción de ensamblaje fueron amplificados utilizando ADN pol (véase la Tabla de Materiales). Fragmentos de ADN de hEF1α promotor parte 1, parte 2 hEF1α promotor, de cuerpo entero y CSTF-64 mutante se amplificaron de forma simultánea en un tubos separados durante 28 ciclos (Figura 4A), siguiendo las recomendaciones del proveedor del ADN pol (véase la Tabla de Materiales , para cada ciclo de desnaturalización fue de 7 segundos a 98 ° C, recocido 45 segundos a 55 ° C, el alargamiento de 90 segundos a 72 ° C). Inicialmente, la columna vertebral pcDNA 3.1 se amplificó durante 22 ciclos (utilizando las mismas condiciones que el anterior con la excepción del tiempo de elongación, que fue ajustado a 3 min a 72 ° C). Sin embargo, el rendimiento de ADN resultante no era suficiente para ser utilizado en una reacción de ensamblaje (Figura 4A). Por lo tanto, se realizó una amplificación adicional para obtener suficiente ADN. Productos de PCR obtienened partir de una plantilla de plásmido debe ser digerido con la enzima de restricción DpnI para eliminar el ADN de plásmido, que de otro modo contaminar los productos de reacción resultantes de montaje y producirá colonias bacterianas falsos positivos resistentes a los medicamentos. Por lo tanto, los productos de PCR fueron digeridos con la enzima de restricción DpnI, que escinde ADN de plásmido aislado metilado y hemi-metilado de la presa + E. cepas de E. coli. Productos de PCR obtenidos utilizando fragmentos de ADN sintéticos, como plantillas no necesitan ser digerido con DpnI ya que el ADN sintetizado químicamente no contiene bases metiladas o hemi-metilado. Los fragmentos de ADN se purificaron y se concentraron sobre perlas magnéticas de purificación de ADN (véase la Tabla de Materiales) como se describe en el paso de protocolo 4. Las PCRs para el pcDNA 3.1 vector columna vertebral se combinaron juntos y la cantidad de perlas magnéticas de purificación de ADN utilizada se ajustó en consecuencia. El rendimiento de ADN se determinóutilizando un espectrofotómetro (Tabla 1 y la Tabla de Equipo). Reacciones de montaje para CSTF-64 y mutantes CSTF-64 construcciones se ensamblaron en hielo (Tabla 1). Un exceso molar de 3 veces de los fragmentos de ADN consideradas como &quot;insertos&quot; fue utilizado (Tabla 1, Figura 3). El volumen final de los fragmentos de ADN mixtas se ajustó a 10 l con agua y 10 l de mezcla maestra de montaje (2x) se añadió. Las reacciones se mezclaron y se incubaron a 50 ° C durante 1 hr. Reacción de control positivo también se montó de acuerdo a la recomendación del manual del kit GA y se incubaron simultáneamente con los CSTF-64 y mutantes CSTF-64 reacciones. Como se recomienda en el protocolo, 2 l de la cada una de las reacciones de ensamblaje se transformaron en el E. químicamente competentes coli suministra con el kit de clonación de montaje (véase la Tabla de Materiales). La transformación se llevó a cabo como se describe en el kitmanual. Los clones positivos se seleccionaron en placas de agar con ampicilina / LB. 6 colonias por cada reacción de ensamblaje fueron seleccionados al azar para ser reproducido. Los ADN de plásmido se aisló utilizando un mini kit de aislamiento de plásmido (véase la Tabla de Materiales). En la digestión in silico de las construcciones con las enzimas de restricción NheI y NotI resultaron en dos fragmentos con tamaños de 4.590 pb, 3032 pb para CSTF-64 y 4.590 pb, 2711 pb para mutante CSTF-64 (Figura 2B y Figura 4B). La digestión con las enzimas de restricción HindIII y NotI resultaron en tres fragmentos con los siguientes tamaños: 5.872 pb, 1005 pb y 745 pb (CSTF-64) y 5872 pb, 1005 pb y 424 pb (CSTF-64 mutante, la Figura 2B y Figura 4C). De hecho, la digestión de los plásmidos aislados muestra los patrones característicos esperados (Figura 4B, C). Tenga en cuenta que el fragmento de ADN 424 pb producido por la digestión con HindIII y NotI de la CSTF-64 mutanteplásmidos en la figura 4C se tiñen débilmente debido a su pequeño tamaño. 2 de los 6 plásmidos aislados fueron enviados para la secuenciación. Hemos secuenciado el promotor hEF1α y CSTF-64 o mutante CSTF-64 partes de las construcciones para verificar que no hay deleciones, inserciones o sustituciones. Recomendamos encarecidamente la secuenciación de las construcciones de ADN que resultan de este o de cualquier protocolo basado en PCR. La secuenciación mostró que uno de cada plásmido secuenciado contenía la secuencia esperada en la región de hEF1α, 3xFLAG-tag y CSTF-64 o CSTF-64 mutante. Cada uno de los otros plásmidos tenían un punto de mutación introducida durante la amplificación del fragmento de ADN correspondiente. Expresión del plásmido que contiene CSTF-64 en células madre embrionarias de ratón, produce abundante cantidad de proteína exógena comparable a la de tipo salvaje expresión 17. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" width="450" /> Figura 1. Representación esquemática del mecanismo de Asamblea Gibson. Fragmentos de ADN con la superposición de los extremos se ensamblaron isotérmicamente en una sola secuencia continua. La superposición Final primera se mastica de nuevo por 5 &#39;exonucleasa, que es calentar gradualmente inactivado. En consecuencia, los diferentes fragmentos de ADN con extremos superpuestos se recocer isotérmicamente. ADN polimerasa llenará los vacíos y la ADN ligasa termoestable productos ligados los nicks. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" width="650" /> Figura 2. (A) Diagrama de flujo del protocolo descrito para la clonación de montaje. (B) Representación del plásmido, PGA-CSTF-64 generado usando el kit de GA rojos - fragmentos de ADN utilizados en la reacción de ensamblaje:. PcDNA3,1; hEF1α promotor parte 1 (hEF1a - 1); hEF1α promotor parte 2 (hEF1a - 2) ordenó como un ADN sintético; ratón CSTF-64 (mCstF-64). Marcos de lectura abierta - azul. Violet - promotores virales y no virales. Verdes -. Regiones de escisión y poliadenilación <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" width="650" /> Figura 3. Diseño de la asamblea Gibson CSTF-64 plásmido. Negro cajas representan los fragmentos de ADN que estaban disponibles para diseñar un único conjunto Gibson CSTF-64 en secuencia silico. Posteriormente, la secuencia se divide en cuatro piezas de ADN, que fueron amplificados por PCR. Tenga en cuenta que debido al pequeño tamaño de la 3xFLAG-etiqueta de la secuencia fue diseñado como un sDNA junto con la pr hEF1α<html> parte omoter 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig4highres.jpg" width="650" /> Figura 4. PCR de los fragmentos de ADN utilizados en las reacciones de clonación y representante de la digestión con enzimas de restricción de los plásmidos obtenidos (A) PCR usando representativos de arranque en caliente de alta fidelidad mezcla maestra 2x para los fragmentos de ADN utilizados en las reacciones de montaje:. (B) Representante plásmidos de hEF1α, de cuerpo entero CSTF-64, pcDNA 3.1 constructo (PGA-CSTF-64) y hEF1α, mutante CSTF-64, pcDNA 3.1 constructo (PGA-mutCstF-64) digerido con NheI y NotI. (C) los mismos plásmidos como en B digeridos con las enzimas HindIII y NotI.&quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nombre de fragmentos de ADN </td><td> El tamaño esperado (bp) </td><td> Concn. (Ng / l) </td><td> Diluido a (ng / l) </td><td> l utiliza en CSTF GA-64 de diluido </td><td> l utiliza en GA mutCstF-64, desde diluido </td><td> Relación molar (ins: vec) </td></tr><tr><td> pcDNA 3.1 (vector) </td><td> 4618 </td><td> 158 </td><td> sin diluir </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> hEF1_ promotor parte 1 </td><td> 825 </td><td> 213 </td><td> 75 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> hEF1_ promotor parte 2 para CSTF-64 </td><td> 516 </td><td> 229 </td><td> 50 </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> CSTF-64 </td><td> 1796 </td><td> 161 </td><td> sin diluir </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> hEF1_ promotor parte 2 para mutante CSTF-64 </td><td> 516 </td><td> 199 </td><td> 50 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> CSTF-64 mutante </td><td> 1448 </td><td> 201 </td><td> 171 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Rendimiento de fragmentos de ADN después de la concentración de perlas magnéticas, dilución y puesta en marcha de las reacciones de ensamblaje.

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Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Generación de plásmidos vectores que expresan proteínas de la bandera de etiquetado bajo la regulación del promotor factor de elongación humano-1α Usando Asamblea Gibson

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

generation-plasmid-vectors-expressing-flag-tagged-proteins-under

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

36.7K vistas.  Texas Tech University Health Sciences Center. Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning. 

Video: Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

Purificación del ADN plásmido de las colonias de bacterias Utilizando el kit de Qiagen Miniprep

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Investigación

Biología

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformación de ADN plásmido en E. coli utilizando el método de choque térmico

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Análisis de transcriptomes en trombina tratamiento y de control pulmonar humana células endoteliales microvasculares

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

Métodos para descubrir uso promotor alternativo y la regulación transcripcional de murino BCRP1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed specifically for this protocol and allows for the quantification of terminator efficiency. As a proof of concept, six terminators were bioinformatically identified in the mycobacteriophage Bernal13. Once identified, terminators were then made as oligonucleotides with the appropriate sticky ends and annealed together. Using Golden Gate Assembly (GGA), terminators were then cloned into pGR-Blue. Under visible light, false positive colonies appear blue and positively transformed colonies are white/yellow. After induction of an arabinose inducible promoter (pBad) with arabinose, colony strength can be determined by measuring the ratio of green fluorescent protein (GFP) produced to red fluorescent protein (RFP) produced. With pGR-Blue, the protocol can be completed in as little as three days and is ideal in an educational setting. Additionally, results show that this protocol is useful as a means for understanding in silico predictions of terminator efficiency related to the regulation of transcription.

This protocol utilizes Golden Gate Assembly and the plasmid pGR-blue to rapidly quantify the strength of terminators found in silico.

Verificación rápida de Terminators Uso de la PGR-Blue plásmido y montaje de puerta de oro

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the original plasmid recovery method and introduces restriction enzyme digestion to ease DNA ligation reactions (required for chimera assembly). For this protocol, users clone wildtype genes into the same plasmid (pUC18 or pUC19). After the in silico selection of amino acid sequence regions where chimeras should be assembled, users obtain all the synonym DNA sequences that encode them. Ad hoc Perl scripts enable users to determine all synonym DNA sequences. After this step, another Perl script searches for restriction enzyme sites on all synonym DNA sequences. This in silico analysis is also performed using the ampicillin resistance gene (ampR) found on pUC18/19 plasmids. Users design oligonucleotides inside synonym regions to disrupt wildtype and ampR genes by PCR. After obtaining and purifying complementary DNA fragments, restriction enzyme digestion is accomplished. Chimera assembly is achieved by ligating appropriate complementary DNA fragments. pUC18/19 vectors are selected for CAPRRESI because they offer technical advantages, such as small size (2,686 base pairs), high copy number, advantageous sequencing reaction features, and commercial availability. The usage of restriction enzymes for chimera assembly eliminates the need for DNA polymerases yielding blunt-ended products. CAPRRESI is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI), a protocol based on the insertion of restriction enzyme sites into synonym DNA sequences and functional plasmid recovery. This protocol is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

CAPRRESI: Ensamblaje de quimeras por inserción de sitios de enzimas de recuperación y restricción de plásmidos

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

Planta promotor análisis: Identificación y caracterización del promotor de la raíz específica de nódulo en el frijol común

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...