1. Numunelerin Hazırlanması <ol><li> Hücre yoğunluğu aleti (3000 ila 500,000 hücre / mL Tip M kaset için, ya da 3.000 ila 2.500.000 hücre / S kaset tipi için mL) çalışma aralığı içinde kalacak biçimde ORFLO seyreltici ya da uygun bir seyreltici ile hücre süspansiyonu ile seyreltilir. </li><li> 01:20 (M Tipi kaset) veya 1:5 seyreltme (Type S kaset) için seyreltme 1:5 bir seyreltme en memeli hücre hatları için tavsiye edilir, ancak uygun seyreltme hücre tipi ve tohum yoğunluğu bağlıdır. Doğru bir sayım için gerekli hacmi yaklaşık 75 uL olup. </li></ol> 2. Koşu Örnekleri <ol><li> Güç düğmesine basarak ve Ana ekranda görüntülenir tarafından Moxi Z çevirin. </li><li> Tepsiye bastırın ve Moxi Z. Pipet 75μL örnek ... ekranı göreceksiniz içine bir kaset yerleştirin. </li><li> Kaset doldurma portu (mavi oval bir 75 uL örnek PipetiHangi kasetinin ucu bağlı olarak 1 ya da 2, etiketli) alet içine yerleştirilmiştir. Bunlar, 2 testleri için de kullanılabilir atılabilir kasetleri, bulunmaktadır. Not: Yeri ucu iyi ön dudak altında yakalanan böylece ~ 45 ° açıyla de, doğrudan yükleme içine pipet. Dağıtma zaman, kaset girmek için hava cepleri neden olabilecek şekilde vakumla sıvı dozaj arasında &quot;ileri&quot; alın değildir olması önemlidir. Bu dağıtım sırasında oldukça üzerinde sıvı formunda küçük bir boncuk (iyi giriş boyutu) olması tavsiye edilir. </li><li> Çoğu memeli hücre sayımı için, başlamak için ekranın herhangi bir yerine dokunun. Çok küçük parçacıklar (4 ila 8 mikron M Tipi ve 3-8 mikron Type S için ortalama çapı ortalama çapı) sayma için Moxi Z Küçük Parçacık modunda çalıştırılabilir. Not: kaset tipi ekran üstündeki siyah çubuk endikedir. Bu modda, Moxi Z varsayılan olarak 2 ila 10 um çapı ölçekli ayarlar ve sayımı u gerçekleştirirküçük hücrelerin saptanması için optimize edilmiş parametreler şarkı. BURAYA TOUCH testi başlatmak ve bu modda çalıştırmak için Küçük Parçacık Modu düğmesine (siyah kare) tuşuna basın. </li><li> Moxi Z testi başlayacak ve hücre sayımı sonuçları yaklaşık 8 saniye (M tipi kaset) veya 15 saniye (Type S kaset) içinde tamamlanmış olacaktır. </li><li> Eğri Uydurma MVI ve hesaplamaları otomatik olarak başlayacak ve sadece birkaç saniye ek gerektirir. Uygun bir formda bulunduğunda, sonuçlar daha sonra otomatik olarak ekranda görüntülenir. </li><li> Ayırıcı varsayılan kazanım modu yapmak için, Eğri Ayırıcı moduna geçiş yapmak için Kont düğmesine Fit basın. </li><li> Bu noktada, kaset ünitesi çıkarılabilir. </li></ol> 3. Veri Yönetimi <ol><li> AutoMode ölçekleme kapalıysa, sonuçlar başlangıçta bir eğri uyum 2-34 m çaplı ölçeği (M Tipi kaset) üzerinde sayısı veya 2-26 μ için görüntülenirm (Type S kaset). Otomatik mod ölçekleme açıksa, o Moxi Z otomatik olarak tüm eğri-fit verileri görüntülenir sağlarken eğrisi-fit nüfusun genişliği en yakın aralığında yatay eksen (x ekseni) dönüşebilecek. </li><li> AutoMode ölçekleme elle yüksek çözünürlükte sonuçlarını görüntülemek için, kapalı ise, 2-26 mikron simgesini (M Tipi) veya 2-18 mikron simgesini (Type S) dokunun. Not: Kaset tipi ekranın sol üst kısmında mavi kutu içinde gösterilir. Eğri yetenekleri gibi görsel verilerin nüansları ayırmak için kullanıcının yeteneğinde iyileştirmek için küçük parçacıkların hücreleri veya sayma takdirde önerilir. </li><li> Yatay çözünürlük artan üzerine, ölçekleme düğmesini dinamik olarak mümkün olan x-ekseni ölçeği aralıkları arasında bisiklet sağlamak için ayarlar: 2-34, 2-26, 2-18, ve M Tipi kaset için 2-10 mikron veya 2 Type S kaset için -26, 2-18 ve 2-10 mikron. Bu özellik sadece availa olduğunuhemen bir hücre sayımı takip ble. </li><li> Eğri-fit veya kapı bölge için sayın bilgileri (hücre / ml) histogramın sol tarafında küçük siyah bir kutu görüntülenir. Ortalama hücre boyutu bilgi histogramın sağ tarafında küçük siyah kutu görüntülenir. </li><li> MVI değeri histogramın sağ üst köşesinde mavi bir kutu görüntülenir. Test küçük parçacık modunda çalıştırmak ise, MVI geçerli değildir ve &quot;MVI = SPM&quot; olarak gösterilir. Hücrelerin konsantrasyonuna MVI çalışma aralığı, &quot;Aralığı MVI = yetersiz&quot; bir mesajın dışındaysa Ek olarak gösterilir. </li><li> Mevcut histogram kaydetmek için, Bitti simgesine dokunun. Bu XXX ilgili test sayıdır &quot;Test XXX&quot; bir isim ile verileri kaydeder. </li><li> Elle kapısı histogram için, Curve Fit sayımı sonuçları düğmesine geçiş yapmak için dokunun. Bu Ayırıcı varsayılan satın mod yapar. Sonra inci kapıları ayarlamak veya dokunun her mavi yolluk işaretleyici kaydırınince kapısı ayarlamaları için e sağ ve sol ok (bu mavi yolluk işaretleyici dokunulduğunda görünür) işaretleri arasında sadece hücre sayılır. Histogram dikey ölçeğini otomatik olarak eğri-fit nüfus genlik göre tartılır. Bu dikey ölçeğini ayarlamak için, histogram bölgede tokatlamak ekranı aşağı veya yukarı. </li><li> Eğri sığdırma modu ekranına geri dönme ve eğri uygun modu, varsayılan toplama modu yapmak için Gated Sayım sonuçları düğmesine dokunun. </li><li> Sonra sonuçları kaydetmek ve Ana ekrana geri dönmek için Done simgesine basın. Sonuçlarını silmek için, kalıcı test sonuçlarını silmek için her zaman Sil simgesine basın. </li></ol> 4. Daha önce Edinsel Veri Analizi <ol><li> Kaydedilmiş bir testi açmak için, Ana ekranda Histogram simgesine basın. </li><li> Dokuz kaydedilen histogramlarına simgeleri ekranda görüntülenir.Ilgi testi için uygun simgesine basın veya daha fazla test sonuçlarını görüntülemek için ikonlar Aşağı Page Up veya Page basın. </li><li> Her histogram kaydettiğiniz nasıl bağlı olarak, Curve Fit Kont modu veya Gated Sayısı modunda da açılacaktır. Gated Kont modunda, yolluk belirteçler bağımsız olarak her mavi yolluk işaretleyici kaydırarak istenilen şekilde yerleştirilebilir. Otomatik Kapı istenen tepe üzerine dokunarak. Gated Kont ve Curve Fit Kont modları arasında geçiş yapmak için dokunun. </li><li> Histogramın dikey ölçeğini ayarlamak için Yakınlaştırma ve Unzoom simgeleri basın. Dikey ölçek dikey olarak da aşağı yukarı ekran (artırmak için) veya (azaltmak için) bir parmak swiping tarafından değiştirilebilir. </li><li> Sürekli test sonuçlarını silmek için Sil simgesine basın. </li><li> Için Done simgesine basıntest sonuçları kapatın ve Ana ekrana geri dönmek. (Not: Yakınlaştırılmış görünümü kaydedilmez.) </li></ol> 5.. PC&#39;ye veri aktarma <ol><li> Veri, bir PC veya Mac için Moxi Z USB kablosu takarak Orflo Moxichart uygulamasını kullanarak bir PC veya USB aktarım yoluyla aktarılabilir. Bluetooth transferi için (MoxiChart), ilk Moxi Z biriminin Ana ekranda Bluetooth simgesini basarak cihazı Bluetooth kimliğini belirlemek. </li><li> Bilgisayarda, MoxiChart uygulamasını açın ve sağ üst köşede Bluetooth simgesini tıklayın. Sonra, Moxi Z Bluetooth kimliği karşılık cihaz seçin ve yüklenen dosyalar için hedef klasörü seçin. </li><li> Moxichart otomatik Bluetooth bağlantısı ile belirtilen dizine tüm dosyaları transfer olacak. </li><li> Bluetooth (MoxiChart) veya USB tarafından aktarılan dosyaları analy açılıp edilebilironlar biçimlendirilmiş, çünkü MoxiChart uygulama ile doğrudan zed veya. csv dosyaları, doğrudan ek / özel analiz için Microsoft Excel veya diğer veri analiz programları açılabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Moxi Z hassas ve kesin değerlendirmek için, HEK-293 hücreleri, HeLa hücreleri, CHO-K1, maya, Jurkat E6-1 hücreleri, PC12, ve sayım 0-500,000 hücreleri arasında değişen konsantrasyonlarda sahip boncuk süspansiyonlar hassas kalibre / mL (Tip M kaset) ve 0-2-2.5e 6 hücre / ml (Tip S kaset) sayıldı ve tüm memeli hücrelerinin Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan (ATCC) elde edildi, bir Coulter Z2 ve Moxi Z. ile karşılaştırıldı ve kültür olarak daha önce 7-11 nitelendirdi. Kısaca, hücreler RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa) hücreler veya F12K (CHO-K1) hücrelerin çekirdek ortam ile 75 mm 2 doku kültür şişeleri içinde süspansiyon içerisinde kültüre edildi. Tüm medya ile tamamlanıyor% 10 fetal sığır serumu ve 100 U penicillin/100 mikrogram Streptomisin. Flasks% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir inkübatör muhafaza edildi. Hücreler 3 gün boyunca her pasajlanmağa devam edildi. Maya hücreleri (X5, C. albicans, Vin 13) bağışlanan ve hemen olarak verilmiştir kullanılmıştır. M Tipi kaset veri ve Type S kaset için ~ 2-2.5e 6 hücre / ml için ~ 500.000 hücre / ml İlk örnek konsantrasyonları Coulter Z2 kullanılarak oluşturuldu. Müteakip teorik konsantrasyon seviyesi fizyolojik tamponlar (ISOTON II ya da Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi) ile seri seyreltiler vasıtasıyla hazırlandı. Her konsantrasyondaki, aynı örnekleri her iki sistem ile ölçüldü ve birbirlerine karşı çizilmiştir. Şekil 2&#39;de görüldüğü gibi, güçlü bir doğrusal ilişki vardı (M Tipi r 2&gt; 0,9886, Type S r 2&gt; 0,9781) tüm örnekler için sayımları arasında. Konsantrasyonlar da Moxi Z ve Z2 her ikisi ile teorik / beklenen hücre konsantrasyonları ile karşılaştırılmıştır ( <strong&gt; Şekil 3) ve daha göstermiştir güçlü bir doğrusal ilişki (M Tipi r 2&gt; 0,9758, Type S r 2&gt; 0,9774). Hassas değerlendirmek için, HEK-293 ve HeLa hücre sayımı Coulter Z2, Moxi Z, ve bir hemasitometre ile yapıldı. CV 200,000-300,000 hücre / ml aralığında 5 ayrı sayıları ile ölçülür ile Moxi Z (M Tipi kaset), Coulter Z2 ve hemasitometre kullanarak hücre sayıları varyasyon ortalama katsayısı (CV, n = 19) hesaplandı. Moxi Z küçük ortalama CV (Şekil 4) Z2 ile karşılaştırılabilir ve Coulter tabanlı sayma teknolojileri ile sadece ulaşılabilir hassasiyet yüksek düzeyde temsilcisidir. Moxi Z enstrüman boyutlandırma satın hassas, hassas kalibre polistiren boncuklar ölçümü yoluyla sonraki değerlendirildi. Moxi Z ortalama parçacık boyutu ölçümleri (n = 5) üretici rapor boyutları karşı grafiğe geçirildi. Görülebileceği gibi in Şekil 5, Moxi Z ölçümleri sürekli bir yüksek doğrusal korelasyon (r 2 = 0,9989) ile üretici değerler eşleştirilir. Boyutu ve sayısı bilgileri ötesinde, Moxi Z bir rapor Moxi Canlılık Endeksi (MVI) değeri ile memeli hücre kültürü bir sağlık reaktif gerektirmeyen, genel bir değerlendirme sağlar. Bu indeks toplam parçacık sayımı ile ilgili olarak ilgi popülasyonda hücrelerin sayısının oranı, bir elde edilir. MVI ölçüm yetenekleri göstermek için, MVI değerleri (M Tipi kaset) standart manuel ve flow sitometri ölü / canlı ölçüm teknikleri ile karşılaştırıldı. Ölü (&lt;% 10 canlı) HEK-293 ve HeLa hücre popülasyonları 37 seyreltici (ISOTON II, Beckman Coulter) içeren bir besin içermeyen, sodyum florür ° C&#39;de canlı hücrelerin gecede inkübasyonlar yoluyla oluşturulan Kontrollü teorik canlılık düzeyleri canlı ve ölü hücreleri ratiometrically karıştırma bilinen konsantrasyonları tarafından hazırlanmıştır. Resulting çözümler hemositometre sayıları ve akış sitometresi ölçümleri ile her iki nüsha halinde canlılık düzeyleri incelendi. Hemasitometre ölçümler% 0.1 Tripan mavi bir çözelti ve hücrelerin geleneksel bir 50/50 karışım kullanılarak yapılmıştır. Flow sitometri ölçümleri Viacount reaktif ve üretici tarafından belirtilen protokol (Merck) kullanarak bir Guava PCA sitometresi (Merck) kullanılarak yapıldı. Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, HEK hücreleri ve HeLa hücreleri &quot;için analog bir hemasitometre canlılığı yüzdelere MVI verilerin lineer bir formda&quot; Pearson katsayısı değerlerinin (R 2) = 0,9937 ve r 2 = 0,9728, sırasıyla, R 2 idi. Bu sonuçlar, bu yaklaşım bir sitometresi veya hemositometre kullanılarak elde edilen canlı / ölü ölçümleri üstünlügümüz hücre canlılığı geniş bir yelpazesinde kültür sağlık bilgileri sağladığını göstermiştir. Tablolar ve Şekiller (Dittami ve ark, 2011). 15: Şekil 1.. İnce film Coulter Sayma: Elektrik akımı ince-film kaseti Hücre Algılama Bölgesi geçirilir. Hücreleri CSZ aracılığıyla tek bir dosya akışı gibi, voltaj anlık artışlar Moxi Z. ile ölçülür <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig2.jpg" /> Şekil 2. Moxi Z sayıları Coulter Z2 sayıları karşılaştırılabilir. Hücre ve boncuk süspansiyonların Özdeş sayıları bir Coulter Z2 ve Moxi Z. hem kullanılarak sayıldı Moxi Z sayıları sayısı değerleri (n = 3-4) Ortalamalı göre çizildi Coulter ilgili Z2 sayımı ve doğrusallaştırma r 2 değerleri tespit edilmiştir. A) M Tipi kaset - 0 konsantrasyon aralığı - 500.000 hücre / ml. B) Type S kaset - 0 konsantrasyon aralığı - 2-2.5e 6 / ml.Error Barlar işaret ± 1 standart sapma. Şekil 3. Moxi Z konsantrasyonu ölçümleri teorik hücre konsantrasyonları vs. A) Type M kaset - Teorik konsantrasyonu değerlerinin bir başlangıç ​​500,000 hücre / ml numunesinin seri seyreltiler hazırlandı B) Type S kaset -. 2.5e 6 hücre / ml örnek - Teorik konsantrasyonu değerlerinin bir ilk 2 seri seyreltiler hazırlandı. Hata Barlar ± 1 standart sapma gösterir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig4.jpg" /> Şekil 4. Coulter Z2, Moxi Z (M Tipi kaset) ve hemositometre için Değişim Katsayısı. Her yaklaşım için HEK-293 ve HeLa hücre sayıları varyasyon ortalama katsayısı (CV, n = 19) ayrı 5 ölçülen özgeçmişleri ile hesaplandı 300.000 hücre / ml aralığı - 200.000 içinde HEK-293 ve HeLa Hücreleri sayar. Hata Barlar ± 1 standart sapma gösterir. Şekil 5. Moxi Z-Moxi Z kullanılarak partikül boyutu ölçüm Hassas boncuk büyüklüğü ölçülür (M Tipi kaset) vs üreticisi boncuk boyutu bildirdi. Hata Barlar ± 1 standart sapma gösterir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig6.jpg" /> 6 Şekil. MVI kullanarak Kültür Sağlık Değerlendirmesi - Bir hemasitometre kullanarak görsel, tripan-mavi lekeli canlılığı sayımları karşı MVI ölçümler (M Tipi kaset) ve Guava PCA Viacount canlılığının karşılaştırılması.

<ol>
	<li>Fernyhough, M. E., Helterline, D. L., Vierck, J. L., Hill, R. A., Dodson, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coulter+counter+use+in+the+enumeration+of+muscle+and+fat+stem+cells.">Coulter counter use in the enumeration of muscle and fat stem cells.</a> Methods. Cell. Sci. 25, 221-225 (2003).</li><li>Blades, A. N., Flavell, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+use+of+the+Coulter+model+D+electronic+cell+counter+in+clinical+haematology.">Observations on the use of the Coulter model D electronic cell counter in clinical haematology.</a> J. Clin. Pathol. 16, 158-163 (1963).</li><li>Morris, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+Size+Analysis+of+Beer+Solids+using+a+Coulter+Counter.">Particle Size Analysis of Beer Solids using a Coulter Counter.</a> J. Inst. Brew. 90, 162-166 (1984).</li><li>Marth, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+Somatic+Cell+Counting+Procedure.">Electronic Somatic Cell Counting Procedure.</a> Standard Methods for the Examination of Dairy Products. , 134-140 (1978).</li><li>Parks, L. R., Jurbergs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+size+distribution+of+particles+in+cellulosic+solutions.">Number and size distribution of particles in cellulosic solutions.</a> J. Appl. Polym. Sci. 11, 193-199 (1960).</li><li>Davis, R. E., Green, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+platelet+counting+with+the+Couler+particle+counter.">Automatic platelet counting with the Couler particle counter.</a> J. Clin. Pathol. 20, 777-779 (1967).</li><li>Dittami, G. D., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+evoking+and+electrochemically+resolving+quantal+release+on+a+microchip.">Electrically evoking and electrochemically resolving quantal release on a microchip.</a> Lab on a Chip. 10, 30-35 (2010).</li><li>Nahreini, P., Hanson, A., Prasad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+production+of+recombinant+antibody+fragments+in+HEK-293+cells+using+sodium+butyrate.">High-yield production of recombinant antibody fragments in HEK-293 cells using sodium butyrate.</a> BioTechiques. 34, 968-972 (2003).</li><li>Escuyer, V., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthrax+Protective+Antigen+Interacts+with+a+Specific+Receptor+on+the+surface+of+CHO-K1+Cells.">Anthrax Protective Antigen Interacts with a Specific Receptor on the surface of CHO-K1 Cells.</a> Infection and Immunity. 59, 3381-3386 (1991).</li><li>Isaacs, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+bugdorferi+bind+to+epithelial+cell+proteoglycans.">Borrelia bugdorferi bind to epithelial cell proteoglycans.</a> J. Clin. Invest. 93, 809-819 (1994).</li><li>Saito, Y., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+selenoprotein+P+as+a+selenium+supply+protein.">Characterization of selenoprotein P as a selenium supply protein.</a> Eur. J. Biochem. 269, 5746-5751 (2002).</li><li>Kataoka, S., Tsuruo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physician+Education:+Apoptosis.">Physician Education: Apoptosis.</a> Oncologist. 1, 399-401 (1996).</li><li>Liegler, T. J., Hyun, W., Yen, T. S., Stites, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+live,+apoptotic,+and+necrotic+human+peripheral+lymphocytes+by+single-laser+flow+cytometry.">Detection and quantification of live, apoptotic, and necrotic human peripheral lymphocytes by single-laser flow cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 2, 369-376 (1995).</li><li>Sheridan, J. W., Bishop, C. J., Simmons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+morphological+correlates+of+kinetic+change+and+death+in+a+starved+human+melanoma+cell+line.">Biophysical and morphological correlates of kinetic change and death in a starved human melanoma cell line.</a> J. Cell. Sci. 49, 119-137 (1981).</li><li>Dittami, G. M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORFLO+Moxi+Z:+Revolutionizing+electronic+cell+count+accuracy+and+cell+viability+estimates+through+curve+fitting.">ORFLO Moxi Z: Revolutionizing electronic cell count accuracy and cell viability estimates through curve fitting.</a> Life Science Magazine, VWR International. , (2011).</li></ol>

Gregory M. Dittami ve HE Ayliffe Orflo Teknolojileri, dizayn, üretir ve satar Moxi Z. Richard D. Rabbitt Orflo Teknolojileri ödenen danışmanlık uzmanlığı, part-time sağladığı şirket çalışanlarıdır. Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Orflo Teknolojileri tarafından desteklenmektedir.

Alttaki uygulaması Coulter yaklaşımı ölçümlerin genel doğruluk son derece belirleyici olabilir. Kritik bir bölgede iki veya daha fazla hücre aynı anda diyafram geçiyor ve tek bir elektrik olayı olarak ölçülür &quot;tesadüf olaylar&quot; için ham hücre sayımları düzeltmedir. &quot;Tesadüf olaylar&quot; hücre boyutu ve kümelenme derecesi (Davis ve ark 1967) 6 dahil olmak üzere bir dizi faktöre bağlı olarak değişir hata katkıda bulunur. Sonuç olarak, herhangi bir örnek için gerekli rastlantısal düzeltme yaygın olarak hücre / partikül tipleri arasında ve daha da özdeş hücre tipleri farklı kültür arasında değişen, önceden tahmin edilemeyen. Coulter tarafından ilk yayınlarında köklü teori, kurulan, gözlemlenen olaylar ve ampirik belirlenmiş, parçacık özel düzeltme faktörü, z sayısına göre ham sayıları bir logaritmik ayarlaması uygulama içerir. Doğru düzgün t sayımları ile elde edilebilir ikenkendi düzeltme algoritması, bu hücre tiplerinin ve doğru bir değeri tahmininde karşılık gelen zorluğu arasındaki z değerleri büyük farklılıklar bağlı olarak, pratik uygulanabilirliği sınırlıdır. Burada, rastlantısal düzeltme algoritması ile birlikte Moxi Z eğri tarafından tanımlanan &quot;gerçek&quot; hücre sayısı kullanılarak, Moxi Z dinamik gerçek konsantrasyonları elde etmek tesadüf düzeltir. 500.000 hücre / ml (M Tipi kaset) ve 3000 - 2 - 2.5e-6 hücre / ml (Type S kaset) high-end Coulter Z2 kullanılarak elde edilen sonuçlar karşılaştırıldığında, Moxi Z 0 bir konsantrasyon aralığında karşılaştırılabilir sayımları üretilen . Ayrıca, Moxi Z sayısında varyasyon benzer bir düşük katsayısı ve altın standart, hücre sayımı yılında Coulter-teknik karakteristik parçacık boyutlandırma bir hassasiyet ile bu sayı doğruluğu ulaşır. Ayrıca, burada sunulan veriler Moxi Z değerli bilgiler sağlayabilir göstermektedirHücre kültürlerinin genel sağlığı ile ilgili. Moxi Z bu kültürün sağlık değerlendirmesi belirlemek için özel bir yazılım algoritması ile eğri yaklaşımı yararlanır. Ayırmak gibi blebbing gibi hücre ölümü ile ilişkili morfolojik değişiklikler, ve hacimsel çarpıtmalar (Kataoka ve Tsuruo 1996, Liegler ve ark 1995, Sheridan ve ark 1981) 12-14, mümkün Moxi-Z arasındaki impedimetric farklılıkları ayırt etmek için yapmak popülasyonları ve ölü hücre / enkaz nüfus yaşıyor. MVI parçacık enkaz göreceli katkıları, büzüşmüş nekrotik hücreler ve ilgi eğrisi takılan hücre popülasyonunu belirlemek için kültür / tanecik boyut dağılımı analiz tarafından üretilir. MVI değeri böylece toplam partikül nüfus profiline göre kümil potasyum başlatıcısı varlığında nüfus sayımları nüfusu dizin veya oranlı metrik ölçü yansıtır. Bu değer daha sonra algoritmik-ayarlanabilir dayalı nüfus istatistikleri ve ampirik gözlemler olduğunu. Because MVI geleneksel bir boyama yaklaşımlar başka parametrelerle bakar, bu teknikler ayna beklenmez fakat bunun yerine bir hücre kültürünün sağlığı ile ilgili önemli bir görünümü, özellikle bir alternatif döküntüleri ve kirletici maddeleri mikrobiyal ile ilgili olarak, sağlar. Özetle, Moxi-Z hücre sayacı patentli bir ince-film sensör teknolojisi ile birlikte Coulter İlke ve eğri yazılım algoritmaları kullanarak hassas, tekrarlanabilir hücre sayısının deneyleri, hücre boyutunu ve hücre sağlığı sağlayan ultra küçük benchtop araçtır . 8 saniyede, - çapı 25 mikron (34 mikron 2 dinamik aralık -) M Tipi kaseti ile 4 arasında değişen parçacıklar sayma yeteneğine sahiptir. 15 saniye içinde, - çapı 20 mikron (26 mikron 2 dinamik aralık -) Type S kaset ile 3 arasında değişen parçacıklar sayma yeteneğine sahiptir. Dahası, Moxi-Z reaktiflerin kullanımı olmaksızın sağlık değerlendirmelerinin gerçekleştirir. Bu, daha az emek inte varnsive ve manuel sayım daha çok özneldir. Standart Coulter sayımı karşılaştırıldığında, Moxi, önemli ölçüde daha küçük daha hızlı, daha fazla bilgi sağlayan önemli ölçüde daha az bakım gerektirir, kullanımı kolay ve maliyetinin bir kısmını olduğunu.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> ORFLO Dilüent </td><td> ORFLO </td><td> MXA006 </td><td></td></tr><tr><td> Kaset Dispenser </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Uygun dağıtım için 25 kasetler kadar Mağazaları </td></tr><tr><td> USB Kablosu </td><td> ORFLO </td><td></td><td> PC / Mac veya güç adaptörü cihazı bağlar </td></tr><tr><td> Güç Adaptörü (ABD ve AB modelleri) </td><td> ORFLO </td><td></td><td> AC prizine USB kablosunu </td></tr><tr><td> USB Flash Sürücü </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Mağazalar Moxi Z yazılımı ve kullanım kılavuzu </td></tr><tr><td> Kalibrasyon Kontrol Boncuk </td><td> ORFLO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektronik Kalibrasyon Kaset </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Doğru sistem operasyon ve kalibrasyon doğrulama için elektronik kaset </td></tr></tbody></table>

determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the moxi z mini automated cell counter

Parçacık ve hücre sayımı rutin hücre kültürü, hematolojik analizi, ve endüstriyel kontrol 1-5 dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılır. Hücre / partikül sayma teknolojileri kritik bir atılım 50 yılda önce Wallace Coulter tarafından Coulter tekniğinin geliştirilmesi idi. Teknik bir mikron büyüklüğünde diyafram boyunca bir elektrik alan uygulama içerir ve hidrodinamik delikten tek parçacıklar duruluyor. Parçacıklar tarafından diyafram çıkan tıkanıklığı, doğrudan ve kesin hücre boyutu / hacim ile korele edilebilir elektrik empedansı ölçülebilir bir değişiklik verir. - Hücre / parçacık sayma kriter olarak yaklaşımın tanınma, partikül boyut ve sayıları olağanüstü hassasiyet ve doğruluk kaynaklanıyor, özellikle de el ve görüntüleme dayalı teknolojiler (75 karşı Coulter sayaçlar için% 98 sipariş doğrulukları karşılaştırıldığında manuel ve görüntü tabanlı sistemler için% 80). Buhücre sayımı için görüntüleme-temelli yaklaşımlar aksine, Coulter Tekniği hassas hacimsel bilgi hesaplayarak dramatik enkaz ve kümeleme gelen sayım girişim azaltır hücre / parçacıkların bir gerçek üç boyutlu (3-D) ölçümü yapar, aslında atfedilebilir hücreler / partikülleri ile ilgili. Genel olarak bu diğer sayma teknikleri 6 daha doğru, daha az sıkıcı, daha az zaman alıcı ve daha az öznel anlamda hücrelerin numaralandırma ve boyutlandırma için bir yol sağlar. Hücre sayımı yılında Coulter tekniğin önem kazanmasına rağmen, rutin biyolojik çalışmalarda yaygın kullanımı nedeniyle geleneksel araçların maliyeti ve büyüklüğü için engelleyici olmuştur. Bir daha az pahalı Coulter bazlı aleti imal edilmiş olmasına rağmen, iki ya da daha fazla hücre diyafram geçmekte ve eş zamanlı olarak tespit edildiği &quot;tesadüf olaylar&quot; için düzeltme içindeki daha pahalı benzerleri ile karşılaştırıldığında, bu sınırlamaları vardır. AnotheMevcut Coulter teknolojileri ile r sınırlama hücre örneklerinin genel sağlık ölçümleri eksikliğidir. Sonuç olarak, ek teknikler genellikle Coulter hücre canlılığını değerlendirmek için sayma ile birlikte kullanılması gerekir. Canlılığı değerlendirme geleneksel yöntemlerle hücre boyama ve / veya böyle bir akış sitometresinin kadar pahalı ve hantal ekipman kullanımı gerektiren bu yana bu deneysel kurulum süresi ve maliyetini uzanır. Burada anlatılan Moxi Z Mini otomatik hücre sayıcı, etkinleştirmek için bir ince-film sensör teknolojisi ile Coulter İlke doğruluğunu birleştiren ultra-küçük benchtop araçtır boyutlandırma ve 3-25 mikron arasında değişen parçacıklar sayma, bağlı hassas hücre sayımı kaset kullanılabilir. 25 mikron (dinamik aralığı 2 - - 34 mikron) M tipi kaset 4 ortalama çaplı partiküllerin hesaplamak için kullanılabilir, ve Type S kaset ile parçacıklar ve 3 arasında ortalama çapı hesaplamak için kullanılabilir - 20 mikron (dinamik çaldıe 2 - 26 mikron). Sistemin bir hacimsel ölçüm yöntemi kullanır yana, 4-25 mikron 34 bir hücre hacmi aralığına karşılık gelen - 8,180 fL ve 3 - 20 mikron 14 bir hücre hacmi aralığına karşılık gelen - 4200 fL, ilgili olduğunda Küresel olmayan parçacıklar olarak ölçülmüştür. Moxi Z kullanılarak memeli hücre sayımı gerçekleştirmek için, sayılmasına hücreleri birinci ORFLO ya da benzer bir seyreltici madde ile seyreltilir. Bir hücre sayımı kaset alet sokulur ve örnek kaset portuna yüklenir. Hücrelerin binlerce 8-15 saniye içinde ince-film membran bir &quot;Hücre Algılama Zone&quot; (CSZ) aracılığıyla Tek dosya çekilir. Run ardından, enstrüman sayısı ilgi popülasyonda hücre sayısının oranı belirleyerek genel kültür sağlık bir değerlendirmesi ile birlikte tesadüfen olay düzeltme sağlamak için özel bir yazılım algoritması ile birlikte eğri özel kullanır parçacıklar. Toplam tanecik sayısı dahil olmak üzeree çekmiş ve ölü hücreleri, hem de diğer artıkları ve kirletici bozuldu. Sonuçlar gerektiği gibi el ile ayarlanabilir geçitleri ile otomatik bir eğri ile uyum histogram format, sunulmuştur. Ek kültür sağlık bilgileri sağlarken Sonuçta, Moxi Z, bir Coulter Z2, günümüzde altın standart karşılaştırılabilir bir kesinlik ve doğruluk ile sayım sağlar. Ayrıca önemli ölçüde daha kolay operasyon ve bakım ile daha küçük ayak izi, ve karşılaştırılabilir teknolojilerin maliyetinin bir kısmını, daha az zamanda bu sonuçları elde ediyor.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter at JoVE.com

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Moxi Z minyatür otomatik hücre sayıcı patentli ince film sensör teknolojisi ve boyutlandırma gerçekleştirmek için özel bir yazılım algoritması ve parçacıkların geniş bir ebat aralığında sayma gibi kümil potasyum başlatıcısı varlığında genel sağlık belirlemek için Coulter İlke birleştiren yeni bir enstrümandır memeli hücre kültürleri. Bu protokol, hücre kültürlerinin sağlık sayma ve değerlendirme için bir aracın kullanılması açıklanmaktadır.

Moxi Z Mini Otomatik Hücre Sayacı Kullanımı Memeli Hücre Sayımı, Hücre Boyutu ve Hücre Sağlık Belirlenmesi

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

determination-mammalian-cell-counts-cell-size-cell-health-using-moxi

Research

JoVE Journal

Biology

24.5K Görüntüleme.  Orflo Technologies. Moxi Z minyatür otomatik hücre sayıcı patentli ince film sensör teknolojisi ve boyutlandırma gerçekleştirmek için özel bir yazılım algoritması ve parçacıkların geniş bir ebat aralığında sayma gibi kümil potasyum başlatıcısı varlığında genel sağlık belirlemek için Coulter İlke birleştiren yeni bir enstrümandır memeli hücre kültürleri. Bu protokol, hücre kültürlerinin sağlık sayma ve değerlendirme için bir aracın kullanılması ...

Video: Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Geniş Alan Mikroskop kullanarak Uzun vadeli Görüntüleme Memeli Hücreleri

Biyoloji

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Hücre Kültürü sırasında Hücre Sayısını Belirleme Scepter Hücre Sayıcı

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the calcium-binding protein known as calmodulin (CaM)1,2. CaM is involved at multiple levels in almost all cellular processes, including apoptosis, metabolism, smooth muscle contraction, synaptic plasticity, nerve growth, inflammation and the immune response. A number of proteins help regulate these pathways through their interaction with CaM. Many of these interactions depend on the conformation of CaM, which is distinctly different when bound to Ca2+ (Ca2+-CaM) as opposed to its Ca2+-free state (ApoCaM)3.
While most target proteins bind Ca2+-CaM, certain proteins only bind to ApoCaM. Some bind CaM through their IQ-domain, including neuromodulin4, neurogranin (Ng)5, and certain myosins6. These proteins have been shown to play important roles in presynaptic function7, postsynaptic function8, and muscle contraction9, respectively. Their ability to bind and release CaM in the absence or presence of Ca2+ is pivotal in their function. In contrast, many proteins only bind Ca2+-CaM and require this binding for their activation. Examples include myosin light chain kinase10, Ca2+/CaM-dependent kinases (CaMKs)11 and phosphatases (e.g. calcineurin)12, and spectrin kinase13, which have a variety of direct and downstream effects14.
The effects of these proteins on cellular function are often dependent on their ability to bind to CaM in a Ca2+-dependent manner. For example, we tested the relevance of Ng-CaM binding in synaptic function and how different mutations affect this binding. We generated a GFP-tagged Ng construct with specific mutations in the IQ-domain that would change the ability of Ng to bind CaM in a Ca2+-dependent manner. The study of these different mutations gave us great insight into important processes involved in synaptic function8,15. However, in such studies, it is essential to demonstrate that the mutated proteins have the expected altered binding to CaM.
Here, we present a method for testing the ability of proteins to bind to CaM in the presence or absence of Ca2+, using CaMKII and Ng as examples. This method is a form of affinity chromatography referred to as a CaM pull-down assay. It uses CaM-Sepharose beads to test proteins that bind to CaM and the influence of Ca2+ on this binding. It is considerably more time efficient and requires less protein relative to column chromatography and other assays. Altogether, this provides a valuable tool to explore Ca2+/CaM signaling and proteins that interact with CaM.

Calmodulin (CaM) pull-down assay is an effective way to investigate the interaction of CaM with various proteins. This method uses CaM-sepharose beads for efficient and specific analysis of CaM-binding proteins. This provides an important tool to explore CaM signaling in cellular function.

Kalmodulin bağlayıcı Proteinler, Pull-down

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...