Queremos agradecer a los miembros del laboratorio Buchholz y el Sigma-Aldrich RNAi de equipo para la discusión. Nos gustaría agradecer a la Sociedad Max Planck y el Bundesministerium für Bildung und Forschung Grandes Go-Bio [0315105] para la ayuda. MISIÓN ® es una marca registrada de Sigma-Aldrich Biotecnología LP

1. De alta calidad bibliotecas MISIÓN esiRNA <ol><li> Para cada gen de interés de la región de destino más sensibles y específicos para la utilización de ARNi se elige el algoritmo DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 puntuaciones DEQOR el potencial de silenciamiento de todos los posible 21 nucleótidos de largo siRNAs en un objetivo-mRNA basado en el estado de la técnica de diseño 4-restricciones. Además, cada siRNA potenciales se analizan las posibles reacciones cruzadas con otros genes mediante la realización de una búsqueda BLAST contra el transcriptoma del organismo estudiado. Modo, el programa proporciona un análisis de la calidad y el silenciamiento de las capacidades transversales de la esiRNA potencial (300-600 pb de longitud). </li><li> La zona elegida de la meta-gen de ADNc se amplificó por PCR utilizando cebadores específicos del gen flanqueado por bacteriófagos ARN-polimerasa-promotor de las secuencias. </li><li> Cada producto de PCR utilizado para la producción MISIÓN esiRNA se verifica la identidad de la secuenciación y análisis de pureza Caliper LabChip. </li><li> Largo ARN de doble cadena se transcribe a partir del producto de PCR por la ARN polimerasa, seguida de una hibridación de las cadenas transcritas. </li><li> esiRNAs son preparados por la digestión enzimática limitada de la larga ARN de doble cadena utilizando RNaseIII seguido por la purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico utilizando Q-sefarosa columnas de centrifugado. </li><li> esiRNAs se precipitan y resuspendido en buffer TE. El rendimiento se mide por las mediciones de la absorción de los rayos UV y la concentración se ajusta mediante la disolución en un volumen adecuado de tampón TE. La calidad general del producto final está marcada por Caliper análisis LabChip. </li></ol> 2. La elección de una línea celular y la optimización de transfección para la detección <ol><li> Cantidades titular de esiRNA (uso Eg5 como positivo y renilla-luciferasa como control negativo) y el aumento de las cantidades de reactivo de transfección en una placa de 384 pocillos, agregar las células y se incuba durante 48 horas. Eg5 es una proteína motora quinesina necesarias para el montaje del huso bipolar y el agotamiento conduce a un arresto mitótico. Repita este procedimiento para los reactivos de transfección diferentes líneas celulares. Aquí, nosotros usamos las células HeLa cultivadas siguiendo los procedimientos estándar y oligofectamine (Invitrogen) como reactivo de transfección. </li><li> Para la elección de las condiciones óptimas de transfección contar las células transfectadas con Eg5 esiRNAs que muestran un paro mitótico (forma redonda) y el número total de células transfectadas con renilla-luciferasa (Rluc) esiRNA por microscopía de luz. Elija el estado con la menor toxicidad para Rluc y el fenotipo más pronunciado para Eg5. Un método alternativo para optimizar las condiciones de transfección consiste en una línea celular estable que expresan EGFP (u otro gen reportero adecuado), bajo el control de un promotor activo constitutiva. Después de la transfección de un esiRNA contra EGFP (u otro gen reportero) y Rluc (u otro esiRNA adecuado control negativo) medida derribo eficacia y la toxicidad por ejemplo, la clasificación de fluorescencia de células asistida (FACS). Asegúrese de que el esiRNA utilizado para EGFP es totalmente complementaria con el objetivo de ARNm. </li></ol> 3. Configuración de la pantalla principal 5,6 <ol><li> Optimizar la precisión de pipeteo para todos los componentes utilizados en una estación de pipeteo automatizado (por ejemplo, Acuario, Tecan y WellMate, Matrix). Debido a que los parámetros de pipeteo cambiar en función del tipo de tipo de solución, el volumen y la placa de esta optimización tiene que ser repetido para cada etapa por separado. Si es posible, la estación de pipeteo debe ser colocado bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Todos los componentes utilizados deben ser desinfectados antes de su uso ya sea en autoclave o en su caso por pulverización con etanol al 75%. Optimizar los protocolos de lavado de modo que la contaminación cruzada de pozo a pozo está excluida. Detalles para la optimización de pipeteo automático no se puede dar el espacio para las restricciones y dependen en gran medida de la estación de pipeteo utilizadas. Para más información consulte a los fabricantes de protocolo. </li><li> Transfectar células en formato de 384 pocillos con las condiciones optimizadas desde arriba con esiRNAs para Eg5 y Rluc. Use un patrón alternante de Eg5 y esiRNA Rluc cubriendo todo el plato. </li><li> Después de la incubación durante 48 horas, fijar las células con etanol frío al 100%, rehidratar en PBS durante 15 minutos, la mancha durante 25 minutos en PBS que contenía 1 mg / ml DAPI y 100 ug / ml RNasa A (Qiagen). Por último lavado con PBS y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Medir la intensidad de fluorescencia DAPI-por ejemplo, la microscopía en un sistema Olympus ScanR. Generar un histograma mediante el trazado de la intensidad de DAPI contra el número de células y evaluar la distribución del ciclo celular mediante el cálculo del porcentaje de células con el 2N contenido de ADN para la fase G1; &lt;2N&gt; 4N de la fase S; 4N para G2/M-phase y &gt; 4N de aneuploidía / poliploidía. </li><li> Evaluar la homogeneidad de los resultados sobre la placa. Una mayor optimización es necesaria si los resultados difieren significativamente de excluir a effe posicióncts. Un problema común cuando se utilizan múltiples placas es aumento de la evaporación en los pozos del borde durante el tiempo de incubación. Esto lleva a diferentes condiciones experimentales en diferentes pozos, que a menudo se traduce en efectos específicos de posición de la placa. Por esta razón, se recomienda dejar todos los pozos vacíos borde de una pantalla. Para minimizar aún más la evaporación asegurarse de que las incubadoras se mantienen a la alta humedad. También emplean habitualmente las barreras evaporación, tales como cintas de sellado Corning transpirable que bloquean la evaporación. Recursos también para otros efectos de posición tienen que ser tomadas en cuenta, por ejemplo, la variación técnica del sistema de lectura (microscopio, lector de placas, etc) o las variaciones en el manejo de líquidos (pendientes, falta de homogeneidad de las soluciones, etc.) </li><li> Las diferencias estadísticas entre los controles positivos y negativos de proporcionar una medida de la importancia de los análisis utilizados. Una gran diferencia entre el control negativo (o el ruido de fondo, la maqueta de control) y la muestra tiene que ser establecida antes de iniciar el examen real. Una buena medida para la significación estadística es el factor Z. El factor Z se calcula con la ecuación: Z = 1 - (3 SD [muestra] + 3 SD [maqueta]) * (| Av. [muestra] - Av. [maqueta] |) -1; con SD: desviación estándar; Av: media. Un factor Z de 1&gt; Z&gt; 0,5 indica una separación significativa de los controles negativos (y ruido) de los controles positivos 7. </li></ol> 4. Pantalla principal <ol><li> Preparar 384 y placas de cultivo de tejidos para la transfección de esiRNAs utilizando las condiciones optimizadas desde arriba. Aquí, nosotros usamos esiRNA 15NG por bien disuelta en buffer TE 5μl. Al menos ocho puestos de control por placa se debe cargar con adecuados controles positivos y negativos de los procesos biológicos estudiados (en este caso Eg5 y Rluc). Para evitar los efectos de posición de los pozos se cargan con borde 5μl buffer TE solamente. </li><li> Añadir 5μl OptiMEM (Invitrogen) que contiene Oligofectamine 0.2μl por tanto, mezclar e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir la suspensión de células en la mezcla de transfección (aquí: 40μl de una suspensión de células HeLa a 25 células / l de concentración, equivalente a 1.000 células por pocillo) y se incuba durante 72 horas. </li><li> Medida del ADN contenido en un microscopio automatizado (Olympus ScanR, ver arriba). Evaluar con Z-score estadísticas para la selección de golpe: Z-scores se calculan para todos los esiRNAs muestra usando la señal para el control negativo como referencia. Tenga en cuenta que el Z-score no es el mismo que el Z-factor. Z-scores proporcionar una medida estadística de significación de los valores de la muestra, en comparación con un control (maqueta). Se calcula según la ecuación: Z = (valor [Sample] - media [maqueta]) * desviación estándar [maqueta] -1. Para la selección de un umbral de éxito tiene que ser aplicado. Por lo general, un criterio de importancia como: 2 &lt;Z &lt;-2 se utiliza, pero dependiendo de la calidad del conjunto de datos, el proceso biológico estudiado o, simplemente, el alcance de la pantalla, los umbrales aplicables sean diferentes. Junto a la relativamente fácil puntaje Z-estadísticas métodos matemáticos también más elaborado de evaluación se pueden utilizar (en su interior por primera vez en el amplio campo de la evaluación estadística de los datos de investigación se puede encontrar en el Malo et al. 8). </li></ol> 5. Pantalla secundaria y la validación de éxito <ol><li> Una pantalla secundaria sigue la pantalla principal para eliminar falsos positivos debido a errores experimentales o efectos fuera del objetivo. Por los golpes seleccionado el mismo procedimiento que el utilizado en la pantalla principal se debe repetir para un mayor número de repeticiones (3-5) para permitir una mejor evaluación estadística. </li><li> Por éxitos verificado una esiRNA secundaria que no se superponen (o cualquier otro disparo silenciador no se superponen) con los objetivos fijados en las pantallas iniciales deben ser utilizados. El mismo ensayo y lectura se debe aplicar en cuanto a la pantalla principal. </li><li> En última instancia los genes seleccionados pueden ser validadas por las especies cruzadas de rescate RNAi 9. Por lo tanto un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que codifica por ejemplo, el ortólogo de ratón de los genes es transfectadas establemente en las células. BAC-construcciones de preservar un gen en su contexto genómico y permitir una expresión casi fisiológica. ARNi contra el gen humano endógeno saldrá de la expresión transgénica de ratón alterado que rescata la RNAi fenotipo. RNAi de rescate proporciona el estándar de oro para la verificación de los fenotipos RNAi disponible hasta la fecha. </li><li> Finalmente, los candidatos validados se estudian con más detalle a la larga se derivan comprensión mecanicista. En muchos casos, el ARNi puede ser utilizado en estos experimentos, por ejemplo, en los ensayos de secundaria, más elaborado. </li></ol>

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	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li><li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens.">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li><li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEQOR:+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs.">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li><li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+mammalian+cell+division.">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells.">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells.">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies.">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li></ol>

Autores declaran las relaciones financieras con entidades comerciales que puedan tener un interés en el trabajo presentado.

La interferencia de ARN se ha convertido en una técnica estándar para estudiar la pérdida de la función de los fenotipos. A gran escala colecciones de RNAi mediadores están disponibles a partir de diferentes proveedores y proporcionar un método fácil, rentable y rápida para la silenciación del gen. Esto abrió la puerta para la detección sistemática de agentes clave en muchos procesos biológicos que permite un punto de vista del genoma a gran escala sobre una amplia gama de diferentes especies y tipos de células. Las altas tasas de falsos positivos y falsos negativos es un reto común en las pantallas de RNAi. Para solucionar este problema, han realizado considerables esfuerzos invertidos para mejorar la eficacia y, en particular, provoca la especificidad de la silenciación. Un descubrimiento importante fue que un grupo de diferentes siRNAs dirigidos la misma transcripción mejora en gran medida la especificidad de destino. Debido a que un grupo muy complejo de diferentes siRNAs se produce por la endoribonuclease, esiRNAs son de alta especificidad desencadena objetivo, la reducción de la tasa de falsos positivos en las pantallas de RNAi. esiRNAs también han demostrado para lograr caídas eficaz, reduciendo también la tasa de falsos negativos. Como las pantallas de RNAi son técnicamente exigentes, probablemente seguirá siendo un reto para llevar a cabo de forma rutinaria durante algún tiempo. Sin embargo, como los reactivos y los instrumentos de los laboratorios de obtener una mejor y más compartir su experiencia, el uso de pantallas de RNAi en la biología moderna se considera que aumentará en el futuro.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>	
<tr>
<td>MISSION esiRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For additional information contact: rnai@sial.com</td>
</tr>
<tr>
<td>Wellmate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoScientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Breathable sealing tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OptiMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=E7023|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>200 proof (absolute), for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P5493|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Phosphate buffered saline</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=D8417|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&#x2032;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D8417</td>
<td>Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=R6513|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A from bovine pancreas</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6513</td>
<td>For molecular biology, &ge;70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T9285|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA buffer solution</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T9285
</td>
<td>100 x, for molecular biology</td>
</tr>
</table>

mission esirna for rnai screening in mammalian cells

ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo celular básico para el control de la expresión génica. El ARNi es inducida por el corto ARN de doble cadena también conocido como pequeños RNAs de interferencia (siRNA). El corto ARN de doble cadena se originan a partir de precursores más de doble cadena por la actividad de Dicer, una proteína de la familia de RNasa III de endonucleasas. Los fragmentos resultantes son los componentes del complejo de ARN inducida por silenciar (RISC), dirigiendo a la meta del mRNA afines. RISC corta el ARNm diana lo que se reduce la expresión de la proteína codificada 1,2,3. RNAi se ha convertido en un método experimental poderosa y ampliamente utilizado para la pérdida de los estudios de la función de genes en células de mamíferos que utilizan pequeños RNAs de interferencia. Actualmente hay dos métodos principales se encuentran disponibles para la producción de pequeños RNAs de interferencia. Un método consiste en la síntesis química, mientras que un método alternativo emplea endonucleolytic división del objetivo específico a largo ARN de doble cadena de RNasa III in vitro. Por lo tanto, un grupo diverso de como siRNA oligonucleótidos se produce lo que se conoce también como endoribonuclease preparado siRNA o esiRNA. Una comparación de la eficacia de siRNAs químicamente derivados y esiRNAs muestra que los dos gatillos son potentes en el silenciamiento de genes diana. Las diferencias pueden, sin embargo, se observa al comparar la especificidad. Muchos siRNAs única de síntesis química produce importantes efectos fuera del objetivo, mientras que la mezcla compleja inherente a esiRNAs conduce a una caída más específico 10. En este estudio, se presenta el diseño de bibliotecas a escala del genoma esiRNA MISIÓN y su utilización para la investigación de RNAi ejemplificado por una pantalla de contenido de ADN para la identificación de genes implicados en la progresión del ciclo celular. Mostramos la manera de optimizar el protocolo de transfección y el ensayo para la detección de alto rendimiento. También muestra cómo grandes grupos de datos pueden ser evaluados estadísticamente y los actuales métodos para validar accesos principales. Por último, damos los posibles puntos de partida para nuevas caracterizaciones funcionales de accesos validado.

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MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Aquí se utiliza una biblioteca esiRNA humanos en una pantalla de alto rendimiento de los genes implicados en la división celular. Demostramos cómo configurar y llevar a cabo una esiRNA pantallas, así como la forma de analizar y validar los resultados.

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K vistas.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Aquí se utiliza una biblioteca esiRNA humanos en una pantalla de alto rendimiento de los genes implicados en la división celular. Demostramos cómo configurar y llevar a cabo una esiRNA pantallas, así como la forma de analizar y validar los resultados.

Video: MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Investigación

Biología

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing Siembra y células de mamífero

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Entrega bacteriana de RNAi efectores: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.