Las biopelículas de Candida albicans como muchos especímenes biológicos son muy translúcidas a opacas en su estado nativo. En estos protocolos, mostramos que utilizando métodos de clarificación, la estructura interna de biopelículas intactas fijas se puede ser imagen por microscopía de sección óptica. Con pasos de procesamiento simples, económicos y relativamente rápidos, las biopelículas intactas fijas se pueden hacer transparentes para la toma de imágenes 3D mediante microscopía de fluorescencia de escaneo confocal.
Demostrando este procedimiento hoy estará Katie Lagree, una investigadora post-doctoral aquí, y yo. Para iniciar el crecimiento de biopelículas en una placa de 12 pozos, prepare la placa como se describe en el protocolo de texto. Coloque la placa sobre un mezclador orbital de 60 RPM en una incubadora de aire humidificado de 37 grados Celsius durante 90 minutos para dar tiempo a la adhesión celular.
Después de 90 minutos, retire las células medianas y no conectadas y lave con un medio estéril o PBS. Transfiera el sustrato inoculado a otra placa de varios pozos que contenga un medio de filamentación precalejado. Devuelva la placa a la incubadora de aire ambiente humidificado de 37 grados Celsius y haga crecer las biopelículas hasta 48 horas con una mezcla orbital de 60 RPM para la aireación.
Recuperar la placa de 48 horas de la incubadora y retirar el medio de cultivo de cada espécimen. Reemplace el medio con PBS e incubar durante varios minutos para diluir las proteínas séricas. Después de retirar el PBS, rellene los pozos con fijador.
Se debe añadir un volumen fijador suficiente a cada plato para sumergir todo el crecimiento del biofilm, incluido el de los lados internos del plato. Ponga el plato cubierto en un mezclador orbital lento durante 20 minutos. Después de retirar el fijador como se describe en el protocolo de texto, preparar para la tinción drenando el PBS y rellenar rápidamente los pozos con una solución que contenga PBS y la mancha necesaria.
No permita que la biopelícula drene o se seque durante más de unos segundos. Agregue la mancha al plato. La cantidad necesaria de manchas depende de la masa de biopelícula.
A continuación, ponga el plato cubierto en un mezclador orbital lento durante la noche y protéja de la luz con papel de aluminio o un pedazo de papel negro. Con pinzas, transfiera la biopelícula teñida fija de PBS a cinco mililitros de 50/50 PBS-metanol en un vial de vidrio de 20 mililitros con la biopelícula hacia arriba. Mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de un minuto durante cinco minutos.
Retire el disolvente a una botella de desecho siendo cauteloso para evitar el contacto entre la pipeta y la biopelícula o la biopelícula y el vial. Rellene suavemente con tres mililitros de metanol limpio. Mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de un minuto durante tres minutos.
Ahora retire el disolvente a una botella de desecho y rellene inmediatamente con cinco mililitros de metanol. Después de mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de un minuto durante cinco a 10 minutos, retire el disolvente a la botella de desecho. Rellene inmediatamente con tres mililitros de metanol.
Las biopelículas a menudo se ven más opacas en este punto que su apariencia inicial. Retire el disolvente a la botella de desecho y rellene inmediatamente el vial con cinco mililitros de salicilato de metanol-metanol 50/50. Mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de un minuto durante cinco a 10 minutos.
El biofilm debe ser semitransparente en este disolvente mixto. Después de retirar el disolvente a una botella de desecho, rellene suavemente el vial con tres mililitros de salicilato de metilo limpio. Mezclar manualmente con movimiento orbital a intervalos de un minuto durante tres minutos.
Repita el proceso de nuevo con cinco mililitros de salicilato de metilo limpio, mezclando manualmente a intervalos de un minuto durante cinco a 10 minutos. En este punto, el biofilm debe ser transparente. Retire el disolvente a la botella de desecho y rellene inmediatamente el vial con tres mililitros de salicilato de metilo limpio.
El biofilm procesado es estable en este disolvente. Si utiliza un microscopio invertido, utilice un plato a prueba de disolventes que tenga un fondo de tapa y prepare espaciadores para el soporte de la muestra invertida. Aquí, los espaciadores son anillos de silicona de 13 milímetros que están pre-empapados en salicilato de metilo durante una hora para minimizar la deriva de enfoque debido a la hinchazón.
Para una biopelícula en un cuadrado de silicona de grado médico, invierta el cuadrado y tírelo en un espaciador en un charco de salicilato de metilo en el plato. Asegúrese de evitar cualquier burbuja debajo de la muestra. Montar el plato firmemente en el escenario del microscopio y hacer contacto sumergido en aceite con el objetivo.
Ajuste la cantidad de salicilato de metilo en el plato para que el menisco mantenga el espécimen firmemente hacia abajo en el espaciador por tensión superficial. Coloque una gota de salicilato de metilo en la parte superior del sustrato cuadrado invertido para reducir la dispersión de la luz del acabado mate. A continuación, cubra el plato con una placa de vidrio para limitar la evaporación.
Espere varios minutos hasta que la muestra se asiente en los espaciadores antes de tomar imágenes. Ahora, realice una microscopía confocal para crear imágenes de la muestra como se describe en el protocolo de texto. Para procesar las imágenes, abra ImageJ o Fiji.
Compruebe que el programa tiene suficiente memoria asignada para que se procesen los datos. Procesar un conjunto de datos de dos gigabytes requiere al menos ocho gigabytes de RAM dedicada para una operación fluida. Abra el archivo de imagen del plano serie que se va a procesar.
Si el equipo no tiene suficiente RAM para procesar toda la pila, las subapilaciones se pueden procesar y, a continuación, volver a ensamblar en una sola pila. Convierta los datos a formato de 32 bits para habilitar las operaciones aritméticas de punto flotante mediante el menú de imagen, escriba, 32 bits. Esto duplicará el tamaño del archivo.
Restar el fondo suave para aumentar el contraste de las entidades de enfoque. Procesar toda la pila navegando al menú de proceso, restar fondo. Ajuste el radio de la bola rodante si es necesario.
El radio de la bola debe ser significativamente mayor que la dimensión más grande de las entidades de enfoque que se conservarán. Para establecer todos los píxeles negativos en cero, agregue cada imagen a su valor absoluto. En primer lugar, duplique la pila usando el menú de imagen, duplicado, pila duplicada.
A continuación, tome el valor absoluto de los datos duplicados utilizando el menú de proceso, matemáticas, valor absoluto. Agregue las dos pilas navegando al menú de proceso, calculadora de imágenes, agregue. Para volver a crear la pila de imágenes de forma axial, utilice el menú de imágenes, pilas, reslice.
A continuación, seleccione el espaciado de salida 1.0, comience en la parte superior y evite la interpolación. El eje de enfoque es ahora el eje vertical de la pila. La dimensión Y de la pila reaplicada es igual al número de planos de enfoque.
Para realizar una proyección de vista lateral de parte o de la totalidad de la pila, vaya al menú de la imagen, pilas, proyecto Z. Establezca el sector inicial y el sector de detención para incluir algunos o todos los planos de vista laterales. Seleccione la intensidad máxima para obtener mejores resultados.
Corrija la escala axial de la proyección de vista lateral navegando al menú de imagen, escala. La proyección debe corregirse para la pixelación desigual del plano de imagen y el incremento de enfoque utilizando el factor de escala axial. Establezca la escala X en uno y establezca la escala Y en el factor de escala axial.
Seleccione Interpolación bicúbica. Seleccione Crear nueva ventana. Ajuste el brillo y el contraste.
A continuación, convierta a formato de ocho bits para su visualización. Como alternativa, aplique una tabla de búsqueda de color y guárdela como color RGB u ocho bits. Utilizando disolventes miscibles en serie de índice de refracción creciente, el máximo en claridad se puede estimar rápidamente.
Esto se refina mediante la microscopía de contraste de fase convencional para encontrar el punto de contraste mínimo. Una biopelícula se intercambió en serie entre el xileno y un conjunto estrecho de líquidos de referencia en ese rango. Después de cada intercambio, el mismo campo fue reubicado y visto a través de un vidrio de portada.
Con el aumento del índice, la inversión de contraste se observa por primera vez cuando n es igual a 1.530 para la pared celular, seguido por el citoplasma cuando n es igual a 1.535. Aquí se muestran imágenes profundas de biopelículas mutantes y salvajes de tipo C.albicans. El biofilm de tipo salvaje creció hasta un espesor de 502 micras como se ve en la proyección de vista lateral de la pila de imágenes confocales de 538 planos.
Las proyecciones axiales desde el ápice hasta la base muestran la variación en los tipos de células y diferentes estratos de la biopelícula. Este ejemplo muestra la estructura de tipo comodín característica. La biopelícula mutante creció hasta un grosor de 500 micras como se ve en la proyección de vista lateral de la pila de imágenes de 556 planos.
Este mutante conocido por sufrir un crecimiento filamentoso en ausencia de factores estresantes inductores produjo una arquitectura dramáticamente diferente. Como se ve tanto en la vista lateral como en las proyecciones axiales, muchas células ramificadas dan lugar a crecimientos radiales. Este es un protocolo de imágenes profundas de alto índice de refracción.
Idealmente, el índice de refracción de la muestra y el índice de refracción del aceite de inmersión deben coincidir. Es por eso que en este caso, utilizamos un objetivo de inmersión en aceite. La mayoría de nuestros estudios han sido imágenes estructurales de biopelículas utilizando marcadores de pared celular, pero cualquier método de fluorescencia que se utilice con muestras fijas debe funcionar incluyendo inmunofluorescencia, hibridación fluorescente in situ y expresión génica de reportero.
Este organismo en particular, Candida albicans, es commensal en seres humanos sanos, pero también es un patógeno oportunista que puede causar infecciones mucosas o de levadura sistémica. En algunas instituciones, se requieren métodos y protocolos de contención BSL II. Además, los fijadores de formaldehído y glutaraldehído son volátiles y peligrosos.
Son carcinógenos conocidos. Ine a partir de las diluciones de los fijadores en una campana de humos. Mantenga cubiertos los platos que contengan fijadores diluidos y no coloque recipientes que contengan estos fijadores en un gabinete de bioseguridad o en una incubadora de cultivo celular.
