Los autores agradecen Prof. Andrea Armani en la Universidad del Sur de California para el apoyo durante el tiempo que se ha desarrollado este protocolo. El financiamiento para el desarrollo inicial de este trabajo fue proporcionado por la National Science Foundation [085281 y 1028440] y el Instituto Nacional de Salud a través de Nueva director del NIH, el Programa Premio a la Innovación [1DP2OD007391-01]. Información adicional está disponible en <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ hunthk ~ /</a> .

1. Fondo La biotina se une a la superficie de estos dispositivos a través de un simple proceso de tres pasos (Figura 1). En primer lugar, limpiar la superficie y rellenarla con los grupos hidroxilo mediante la exposición de los dispositivos de plasma de oxígeno ya sea o solución de pirañas. En segundo lugar, se utiliza la deposición de vapor para unir el agente de acoplamiento de silano terminado con una amina primaria a los grupos hidroxilo a través de hidrólisis y reacción de condensación. En tercer lugar, le damos la biotina a la superficie a través de N-hidroxisuccinimida (NHS), la química del éster. Pedimos al lector interesado en nuestro trabajo anterior para obtener más información sobre el desarrollo de estas técnicas, así como una explicación de nuestra motivación para la elección de estas técnicas. 8 El éxito de estas reacciones puede ser evaluada mediante microscopía óptica y de fluorescencia después de la adición de la amina primaria, así como después de la adición de la biotina. Mientras m ópticoicroscopy se puede utilizar para determinar si los protocolos de funcionalización de la superficie provoque daños en la superficie de la microesfera, o incluso la contaminación, la microscopía de fluorescencia se utiliza para verificar la calidad y la uniformidad de la cobertura de la superficie de la molécula de biotina, así como la capacidad de la biotina sobre la superficie para enlazar con (strept) avidina. Para evaluar la cobertura de las aminas en la superficie, se utilizó isotiocianato de fluoresceína (FITC) tinte fluorescente, que reacciona con aminas primarias para formar enlace estable, tiourea covalente a la microesfera. Tejas tinte rojo fluorescente que ha sido conjugado con avidina se utiliza para etiquetar los grupos de biotina en la superficie a través de la interacción biotina-avidina. En ambos casos, los colorantes se eligieron que pueden interactuar (ya sea a través de interacciones ligando-receptor o unión covalente) con los grupos funcionales en la superficie. Aquí, el agente de acoplamiento de silano, que tiene tres grupos salientes y un grupo funcional, proporciona la apuesta puenteWeen la superficie inorgánica y orgánica molécula sonda. La funcionalidad de amina primaria reacciona cuantitativamente con ésteres de NHS para formar enlaces estables amida. En este caso, se utiliza una molécula sonda biotina cuya cadena lateral valérico se ha modificado con un grupo éster NHS. Realista, cualquier molécula sonda para que un grupo éster NHS se puede añadir a la superficie utilizando los siguientes protocolos. Además, estos protocolos son generales, y se puede utilizar para funcionalizar cualquier superficie del dispositivo de sílice con biotina. El desafío principal con estos protocolos no está realmente en la misma química, sino más bien en el manejo de la sílice microesferas. Por favor, tenga en cuenta que, a través de los protocolos, las microesferas deben ser manejados por grapsing sus tallos ligeramente con pinzas de punta afilada. Esto mantiene las pinzas bien lejos de los mismos microesferas, y permite un fácil transporte entre los pasos. Muchos de los pasos en el protocolo a continuación están diseñados específicamente para hacer frente a este hechoo. 2. Fabricación de microesferas <ol><li> Construir la caja de almacenamiento para las microesferas. <ol><li> Usando un cuchillo exacto, corte un pedazo grueso de ¼ de cartón en un 1 x 1 en la plaza, la cinta de este sobre un portaobjetos de vidrio de tamaño normal, y adjuntar un 1 en la sección de cinta adhesiva, con el cumplimiento de sus extremos para formar un rollo , para el cartón. </li><li> Esto crea una plataforma sobre la cual puede ser la microesfera elevado y aislado del entorno circundante, y previene el daño a su superficie. </li></ol></li><li> Con una tijera, cortar una sección de 3 pulgadas de fibra óptica desde un carrete de fibra óptica. </li><li> El uso de un No-Nik fibra stripper, pelar el recubrimiento polimérico protector de los últimos 0,5 pulgadas del extremo de la pieza cortada de fibra, dejando sólo el núcleo de sílice. Limpiar la superficie de cualquier polímero restante con un Kimwipe humedecido con metanol por limpiando suavemente la fibra con la Kimwipe. </li><li> Usando una fibra desnuda cuchillo, cortar el extremo pelado por lo ªen sólo aproximadamente 1 milímetro de fibra despojado permanece en el extremo de la fibra. </li><li> Coloque el extremo pelado de la fibra óptica en el camino de un láser de CO 2, teniendo cuidado de alinear verticalmente la fibra de manera que su extremo pelado está orientada hacia abajo. </li><li> Encienda el láser de CO 2, y dirigirla a la superficie del extremo pelado de la fibra óptica. El láser se funde el extremo pelado de la fibra en una esfera con un 3,5% de potencia en 2 segundos. </li><li> Utilizando pinzas, cuidadosamente agarre el vástago (la parte no recortada de la fibra óptica) de la microesfera. Coloque el tallo hasta el rollo de cinta en la caja de las microesferas. La lámina de vidrio puede ser almacenada en sí mismo una placa de Petri. Esto permite que para el almacenamiento seguro de la microesfera. </li></ol> 3. Rellenar la superficie con grupos hidroxilo <ol><li> Utilizando la solución de pirañas: <ol><li> En un vial de polipropileno de 60 ml con una tapa con bisagras, preparar una solución de pirañas (70:30 en volumen fumante H <sub&gt; 2 SO 4: H 2 O 2 (30% en peso)) mediante la adición de 5 ml de peróxido de hidrógeno al vial, seguido por 11,6 ml de ácido sulfúrico fumante. PRECAUCIÓN: Utilice guantes resistentes a los ácidos. </li><li> Transferir el portaobjetos de vidrio, manteniendo por lo menos 1 microesfera, al vial. La microesfera debe estar en contacto con el líquido, pero el líquido no debe tocar el cartón. Ajustar el volumen de la solución, si es necesario. </li><li> Retire con cuidado el portaobjetos de vidrio del vial, y la inserta en otro frasco de plástico con DDI H 2 O. Que las muestras sentarse en la solución durante 5 minutos. </li><li> Suavemente quitar la placa de vidrio del vial, y lo coloca una estufa a 80 ° C durante 10 minutos para secar la superficie. </li></ol></li><li> Utilizando el tratamiento con plasma de oxígeno: <ol><li> Transferir el portaobjetos de vidrio que contiene al menos una microesfera a la cámara de plasma de oxígeno. </li><li> Ajustar la presión de oxígeno a 200 mTorr, y el poder de 120 W. Exponer la muestra al plasma de oxígeno durante 2 millasnutos. </li><li> Retirar la placa de vidrio de la cámara de plasma. </li></ol></li></ol> 4. Colocación de los agentes de acoplamiento de silano a la superficie <ol><li> Coloque el portaobjetos de vidrio, que contiene al menos una microesfera, en un desecador de vacío en una campana de humos. </li><li> También en la campana de humos, abrir la botella agente de acoplamiento de silano (en este caso, aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) se utiliza), y colocar la botella abierta en el desecador. </li><li> Vuelva a colocar la tapa en el desecador de vacío, y conecte el puerto de salida a un aspirador o la línea de vacío de la casa. </li><li> Encienda el vacío de la casa o la línea de agua y evacuar el desecador de vacío. Una vez que una junta de vacío está formado entre la tapa y la base, comienza a cronometrar la reacción. Esto depositar el agente de acoplamiento de silano a la superficie como una película delgada. </li><li> Después de 15 minutos, apague el vacío, y poco a poco abrir el puerto para que el aire en el desecador. Para este agente de acoplamiento, a 15 minutos es suficiente para formar una unifomonocapa RM en la superficie. Para otros agentes de acoplamiento, el tiempo puede ser necesario ajustar. </li></ol> 5. Colocación de la biotina a la superficie <ol><li> Aproximadamente una hora antes de fijar la biotina, preparar una solución 10 mM de N-hydroxylsuccinimide biotina (NHS-biotina) en dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) en un vial de polipropileno de 60 ml con una tapa articulada. <ol><li> Si el NHS-biotina se ha almacenado en frío, deje que se equilibre a la temperatura ambiente antes de masificación a cabo. </li><li> Soníquelos la solución durante 1 hora para disolver completamente el polvo NHS-biotina en el disolvente. </li></ol></li><li> Transferir el portaobjetos de vidrio que contenía la microesfera en otro vial de plástico, con las microesferas en la parte inferior, y se deriva en la parte superior del vial. </li><li> Transferencia, utilizando una pipeta de plástico, un volumen adecuado de la solución de NHS-biotina por el lado del vial, detrás de la placa de vidrio (por lo que la solución no toca la microesfera a medida que se añadió al vial). Add suficiente solución para cubrir la superficie de la microesfera. </li><li> Colocar los viales que contienen ahora las microesferas y el NHS-biotina en solución de DMSO en una incubadora oscilante (bandeja de inclinación) durante 30 minutos a temperatura ambiente, con la velocidad y el ángulo de inclinación a 5 rpm y 5 grados, respectivamente. </li><li> Retire con cuidado el portaobjetos de vidrio del vial, y suavemente se desliza a otro frasco lleno de DDI H 2 O. Coloque el vial en la bandeja de inclinación durante otros 10 minutos a la misma velocidad y ángulo de inclinación como antes. Repita este paso dos veces con agua fresca cada vez. Esto ayuda a eliminar el exceso de DMSO de la superficie, y elimina cualquier biotina físicamente adsorbido que en realidad no injerto a la superficie. </li><li> Retirar la placa de vidrio del vial, y lo coloca en un horno a 80 ° C durante 10 minutos, o hasta que todas las gotas de agua se eliminan de la superficie. </li></ol> 6. Etiquetado fluorescente de terminado en amina de sílice <ol><li> Para etiquetar los grupos amino presentes después de tratamENT con APTMS, preparar la solución de FITC en un cuarto oscuro por disolución de 1 mg de FITC en 1 ml de DMSO anhidro. </li><li> Se diluye la solución en 6,1 mediante la adición de 50 l de la solución con FITC a 1 ml de tampón 0,1 M de bicarbonato de sodio. </li><li> Colocar la solución en un vial de polipropileno de 60 ml con una tapa articulada, y deslice suavemente las microesferas terminado en amina, que se encuentra de nuevo en el portaobjetos de vidrio, en el vial. </li><li> Coloque el vial en un baño de hielo, y dejar que la muestra reacciona con la solución de FITC para un mínimo de 4 horas en la oscuridad. </li><li> Eliminar el exceso de fluoróforo a través de dos minutos, 10 enjuagues de las microesferas en tampón de carbonato de sodio. Como antes, llenar un vial de polipropileno de 60 ml con una tapa articulada con el tampón, y deslice suavemente el portaobjetos de vidrio en la solución, teniendo cuidado de que la solución sólo cubre la microesfera, y no la caja de cartón. Cubrir el vial con papel de aluminio y coloque el frasco en una bandeja de inclinación fija en 5 grados y 5 rpm, como antes. </li><li> Retire con cuidado el portaobjetos de vidrio del vial, y suavemente se desliza a otro frasco lleno de DDI H 2 O y se cubre con papel de aluminio. Coloque el vial en la bandeja de inclinación durante otros 10 minutos a la misma velocidad y ángulo de inclinación como antes. Repita este paso dos veces con agua fresca cada vez. Esto ayuda a eliminar el exceso de tinte de la superficie. </li><li> Suavemente retirar el portaobjetos de vidrio de la ampolla, y seca en un horno a 80 ° C durante 10 minutos antes de imágenes. </li></ol> 7. Etiquetado fluorescente de biotina-terminado sílice <ol><li> Preparar una solución 10 mg / mL de Texas-Roja avidina en tampón fosfato salino. </li><li> Añadir la solución a un vial de polipropileno de 60 ml con una tapa articulada, y deslice suavemente el portaobjetos de vidrio que contiene una microesfera biotina-terminado en la solución, de modo que la microesfera apenas es cubierto por la solución. </li><li> Reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Retire el exceso de fluoróforo a través de dos, 10 minutos de enjuagues de las microesferas en tampón PBS. <ol><li> Como antes, llenar un vial de polipropileno de 60 ml con una tapa articulada con el tampón, y deslice suavemente el portaobjetos de vidrio en la solución, teniendo cuidado de que la solución sólo cubre la microesfera, y no la caja de cartón. </li><li> Cubrir el vial con papel de aluminio y coloque el frasco en una bandeja de inclinación fija en 5 grados y 5 rpm, como antes. </li></ol></li><li> Retire con cuidado el portaobjetos de vidrio del vial, y suavemente se desliza a otro frasco lleno de DDI H 2 O y se cubre con papel de aluminio. Coloque el vial en la bandeja de inclinación durante otros 10 minutos a la misma velocidad y ángulo de inclinación como antes. Repita este paso dos veces con agua fresca cada vez. Esto ayuda a eliminar el exceso de tinte de la superficie. </li><li> Suavemente retirar el portaobjetos de vidrio de la ampolla, y seca en un horno a 80 ° C durante 10 minutos antes de imágenes. </li></ol> 8. Los resultados representativos Microesferas correctamente funcionalizadas se puede identificar mediante microscopía óptica y de fluorescencia. Si la superficie de funcionalización se hace correctamente, debe resultar en una cobertura densa y uniforme de las moléculas de biotina en la superficie, y la superficie debe permanecer defectos y libre de contaminantes después de funcionalización a fin de mantener sus altas sensibilidades de detección durante los experimentos. Microscopía óptica se puede utilizar para sondear el último, mientras fluorescente microscopía puede probar la calidad y la uniformidad de la cobertura de la superficie. En la Figura 2, se muestran ejemplos de correcta funcionalizados microesferas. Estas imágenes muestran que no hay daños en la superficie o la contaminación debido a funcionalización (fig. 2a), y que las microesferas muestran una cobertura uniforme y consistente de grupos amino o bien (fig. 2b) o grupos de biotina (Fig. 2c) en la superficie . Si las microesferas no han sido funcionalizados correctamente, la microesfera óptico imágenes will exhiben contaminación de la superficie, la cobertura de aglutinación o no uniforme, y defectos obvios en la superficie, como grietas en la superficie (Figura 3). Aquí vemos un ejemplo común de contaminación de la superficie, como resultado de la aglutinación de los reactivos en la superficie. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> Figura 1. 3-paso esquema de reacción para unir moléculas de la sonda a la superficie de microesferas de sílice. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> Figura 2. Microesferas de sílice. una micrografía) óptico de microesferas de sílice rellena con grupos hidroxilo a través de la exposición al plasma de oxígeno, b) micrografía fluorescente de microesferas de sílice rellena con aminas primarias y marcado con FITC colorante, c) micrografía fluorescente de sílice millascrosphere poblada con biotina y etiquetados con Texas Red-avidina conjugada. Reproducido con permiso del Soteropulos, CE, Hunt, Hong Kong y Armani, AM Determinación de la cinética de unión utilizando susurrando microcavidades modo de galería. Appl. Phys.. Lett. 99, 103,703 a 103.703 (2011). Copyright 2011, Instituto Americano de Física. 17 <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografía óptica de la esfera de mal funcionalizados. Aquí, se puede ver polvo en la superficie superior derecha, así como la contaminación que se extiende fuera de la superficie. Además, el lado derecho de la microesfera óptico muestra una pequeña chuleta en la superficie.

<ol>
	<li>Datar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cantilever+Sensors:+Nanomechanical+Tools+for+Diagnostics.">Cantilever Sensors: Nanomechanical Tools for Diagnostics.</a> MRS Bull. 34, 449-454 (2009).</li><li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biological+and+chemical+sensors.">Label-free biological and chemical sensors.</a> Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).</li><li>Sundberg, F., Karlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+characterization+of+immune+responses+using+label-free+biacore+immunoassays.">Rapid detection and characterization of immune responses using label-free biacore immunoassays.</a> Immunology. 120, 46-47 (2007).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , (2008).</li><li>Bernards, M. T., Cheng, G., Zhang, Z., Chen, S. F., Jiang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonfouling+polymer+brushes+via+surface-initiated,+two-component+atom+transfer+radical+polymerization.">Nonfouling polymer brushes via surface-initiated, two-component atom transfer radical polymerization.</a> Macromolecules. 41, 4216-4219 (2008).</li><li>Fan, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+optical+biosensors+for+unlabeled+targets:+A+review.">Sensitive optical biosensors for unlabeled targets: A review.</a> Anal. Chim. Acta. 620, 8-26 (2008).</li><li>Qavi, A. J., Washburn, A. L., Byeon, J. Y., Bailey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+technologies+for+quantitative+multiparameter+biological+analysis.">Label-free technologies for quantitative multiparameter biological analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 121-135 (2009).</li><li>Hunt, H. K., Soteropulos, C., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconjugation+Strategies+for+Microtoroidal+Optical+Resonators.">Bioconjugation Strategies for Microtoroidal Optical Resonators.</a> Sensors. 10, 9317-9336 (2010).</li><li>Kalia, J., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Bioconjugation.">Advances in Bioconjugation.</a> Curr. Org. Chem. 14, 138-147 (2010).</li><li>Matsko, A. B., Savchenkov, A. A., Strekalov, D., Ilchenko, V. S., Maleki, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Applications+of+Whispering-Gallery+Mode+Resonators+in+Photonics+and+Nonlinear+Optics.">Review of Applications of Whispering-Gallery Mode Resonators in Photonics and Nonlinear Optics.</a> IPN Progress Report. , 42-162 (2005).</li><li>Armani, A. M., Kulkarni, R. P., Fraser, S. E., Flagan, R. C., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+single-molecule+detection+with+optical+microcavities.">Label-free, single-molecule detection with optical microcavities.</a> Science. 317, 783-787 (2007).</li><li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+single+nanoparticle+detection+and+sizing+by+mode+splitting+in+an+ultrahigh-Q+microresonator.">On-chip single nanoparticle detection and sizing by mode splitting in an ultrahigh-Q microresonator.</a> Nat. Photon. 4, 122-122 (2010).</li><li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip.">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whispering-gallery-mode+biosensing:+label-free+detection+down+to+single+molecules.">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering+gallery+mode.">Single virus detection from the reactive shift of a whispering gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20701-20704 (2008).</li><li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+microcavity+optical+biosensors.">Recycling microcavity optical biosensors.</a> Opt. Lett. 36, 1092-1094 (2011).</li><li>Soteropulos, C. E., Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+binding+kinetics+using+whispering+gallery+mode+microcavities.">Determination of binding kinetics using whispering gallery mode microcavities.</a> Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Como se describe en los protocolos, se creó una plataforma de vivienda por el cual para el transporte de la sílice microesferas por sus tallos en todo el proceso de funcionalización. Esta plataforma de vivienda fue creado como una solución a la contaminación de la superficie y el daño que resultó de la microesfera que entren en contacto con las paredes de los diversos recipientes utilizados en el proceso de funcionalización. Nos dimos cuenta de la principal dificultad surgió de forma constante y el desprendimie...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> El metanol </td><td> Pescador </td><td> 67-56-1 </td><td> Grado ACS </td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> Pescador </td><td> 8014-95-7 </td><td> Echando humo </td></tr><tr><td> Peróxido de hidrógeno </td><td> Pescador </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30% en peso </td></tr><tr><td> Aminopropiltrimetoxisilano </td><td> Pescador </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-biotina EZ enlazador </td><td> Atravesar </td><td> 20217 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Pescador </td><td> 67-68-5 </td><td> Anhidro </td></tr><tr><td> Isotiocianato de fluoresceína </td><td> Atravesar </td><td> 46425 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino </td><td> Pescador </td><td> 7647-14-5 </td><td> Polvo concentrado </td></tr><tr><td> Un amortiguador de bicarbonato de sodio </td><td> Pescador </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red - avidina conjugada </td><td> Atravesar </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra óptica </td><td> Newport </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> La fibra Stripper </td><td> Las ventas de fibra de instrumentos </td><td> NN-175 </td><td> No-Nik 175 um separador </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Pescador </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> Bare Cleaver fibra </td><td> Ilsintech </td><td> Cl-03A </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Pescador </td><td> 12-550B </td><td></td></tr><tr><td> Los viales de polipropileno </td><td> Pescador </td><td> 03 a 341-75A </td><td> 60 ml, tapa de bisagra </td></tr><tr><td> La incubación de Rocker </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> Desecador de vacío </td><td> Pescador </td><td> 08 a 594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

attaching biological probes to silica optical biosensors using silane coupling agents

Con el fin de interactuar con los entornos biológicos, plataformas de biosensores, como el popular sistema de Biacore (basado en la resonancia plasmón superficial (SPR), la técnica), hacer uso de diversas técnicas de modificación de la superficie, que pueden, por ejemplo, evitar todo exceso de superficie, ajustar el hidrofobicidad / hidrofilicidad de la superficie, adaptarse a una variedad de entornos electrónicos, y más frecuentemente, inducir especificidad hacia un objetivo de interés. 1-5 Estas técnicas extender la funcionalidad de los biosensores de otro modo altamente sensibles a aplicaciones reales en entornos complejos, tales como la sangre, la orina y análisis de aguas residuales. 2,6-7 Aun cuando las plataformas comerciales de biosensores, como Biacore, han entendido bien, las técnicas estándar para la realización de estas modificaciones de la superficie, estas técnicas no se han traducido de una manera estandarizada de otra etiqueta libres de las plataformas de biosensores, como Whispering Gallery Mode (WGM) resonadores. 8-9 menores<html> / P&gt; WGM resonadores ópticos representan una tecnología prometedora para la realización de la etiqueta sin detección de una amplia variedad de especies en muy bajas concentraciones 6,10-12 La alta sensibilidad de estas plataformas es el resultado de sus únicas óptica geométrica. WGM óptica confinan resonadores de circulación . luz en frecuencias específicas, resonancia integrales 13 Al igual que el plataformas SPR, el campo óptico no está totalmente confinado en el dispositivo sensor, pero agotaría; esta &quot;cola evanescente&quot;, entonces puede interactuar con especies en el entorno circundante. Esta interacción hace que el índice de refracción efectivo del campo óptico a cambiar, dando lugar a una ligera, pero detectables, desplazar en la frecuencia de resonancia del dispositivo. Debido a que el campo óptico circula, puede interactuar muchas veces con el medio ambiente, dando como resultado una amplificación inherente de la señal, y la sensibilidad muy alta a los cambios menores en el medio ambiente. 2,14-15 tienda &quot;&gt; Para realizar la detección específica en entornos complejos, estas plataformas debe ser emparejado con una molécula sonda (normalmente una media de un par de unión, por ejemplo, anticuerpos o antígenos) a través de modificación de superficie. 2 Aunque resonadores WGM ópticos pueden ser fabricados en varias geometrías de una variedad de sistemas de materiales, la microesfera de sílice es el más común. Estas microesferas se fabrican generalmente en el extremo de una fibra óptica, que proporciona un &quot;tallo&quot; por el que las microesferas se pueden manejar durante los experimentos de funcionalización y detección. químicas de sílice de superficie pueden aplicarse para unir moléculas de la sonda a su superficie, sin embargo, las técnicas tradicionales generados para sustratos planares a menudo no son adecuados para estas estructuras tridimensionales, como cualquier cambio en la superficie de las microesferas (polvo, contaminación, defectos en la superficie, y revestimientos desiguales) puede tener consecuencias graves y negativas en sus capacidades de detección. este sentido, demuestran un enfoque simplistapara la funcionalización de la superficie de la sílice de microesferas WGM resonadores ópticos utilizando agentes de acoplamiento de silano para cubrir la superficie inorgánica y el entorno biológico, mediante la adición de biotina a la superficie de la sílice. 8,16 A pesar de que utiliza sílice resonadores WGM de microesferas como el sistema de sensores en el presente informe, los protocolos son generales y se puede utilizar para funcionalizar la superficie de cualquier dispositivo de sílice con biotina.

Watch this Scientific Journal Video about Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents at JoVE.com

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Biosensores interactuar con entornos complejos, biológicos y realizar una detección selectiva mediante la combinación de sensores altamente sensibles con sondas muy específicas que figuran en el sensor a través de modificación de la superficie. Aquí, se demuestra la funcionalización de la superficie de los sensores ópticos de sílice con biotina utilizando agentes de acoplamiento de silano para reducir el sensor y el entorno biológico.

Colocación de sondas biológicas de biosensores ópticos de silicio mediante agentes de acoplamiento de silano

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

attaching-biological-probes-to-silica-optical-biosensors-using-silane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K vistas.  University of Missouri. Biosensores interactuar con entornos complejos, biológicos y realizar una detección selectiva mediante la combinación de sensores altamente sensibles con sondas muy específicas que figuran en el sensor a través de modificación de la superficie. Aquí, se demuestra la funcionalización de la superficie de los sensores ópticos de sílice con biotina utilizando agentes de acoplamiento de silano para reducir el sensor y el entorno biológico.

Video: Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

La ingeniería biológica basada en los injertos vasculares El uso de un biorreactor pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Investigación

Bioingeniería

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

De bajo peso molecular de proteínas en el enriquecimiento de las películas delgadas de silicio mesoporosos para el descubrimiento de biomarcadores

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

La inserción de sondas Flexible Neural Usando refuerzos rígidos adjuntos con Biodissolvable Adhesivo

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Detección óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bacterias por mesoporosos Silicon Biosensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Banda ancha Detector óptico de ultrasonido para aplicaciones de imágenes médicas

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

El uso de biosensores ópticos sin etiqueta para Detectar la modulación de los canales de potasio por la proteína G-receptores acoplados

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos