Les auteurs tiennent à remercier le professeur Andrea Armani à l&#39;Université de Californie du Sud pour le soutien pendant le temps de ce protocole a été développé. Financement pour le développement initial de ce travail a été fourni par la National Science Foundation [085281 et 1028440] et l&#39;Institut national de la santé par le biais du directeur des NIH Programme Innovateur Prix Nouveau [1DP2OD007391-01]. Des informations complémentaires sont disponibles à <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ ~ hunthk /</a> .

1. Fond La biotine est fixée à la surface de ces dispositifs par un simple, en trois étapes (figure 1). Tout d&#39;abord, on nettoie la surface et le remplir avec des groupes hydroxyles en exposant les appareils à plasma d&#39;oxygène soit ou d&#39;une solution piranha. Deuxièmement, on utilise dépôt en phase vapeur pour fixer l&#39;agent de couplage silane terminé par une amine primaire pour les groupes hydroxyle par hydrolyse et réaction de condensation. Troisièmement, nous attachons la biotine à la surface par l&#39;intermédiaire de N-hydroxysuccinimide (NHS) de la chimie ester. Nous renvoyons le lecteur intéressé à notre travail précédent pour plus d&#39;informations sur le développement de ces techniques, ainsi qu&#39;une explication de notre motivation pour le choix de ces techniques. 8 Le succès de ces réactions peut être évalué par microscopie optique et la fluorescence après l&#39;addition de l&#39;amine primaire, ainsi que, après l&#39;addition de la biotine. Alors m optiqueicroscopy peut être utilisé pour déterminer si les protocoles de fonctionnalisation de surface entraîné des dégâts à la surface des microsphères, ou même la contamination, microscopie à fluorescence est utilisée pour vérifier la qualité et l&#39;uniformité de la couverture de surface de la molécule de biotine, ainsi que la capacité de la biotine sur la surface à lier avec (strept) avidine. À évaluer la couverture d&#39;amines sur la surface, on utilise l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) colorant fluorescent, qui réagit avec des amines primaires pour former stables, liaison thiourée covalente à la microsphère. Rouge Texas colorant fluorescent qui a été conjugué à l&#39;avidine est utilisé pour marquer les groupes biotine sur la surface à travers l&#39;interaction biotine-avidine. Dans les deux cas, les colorants ont été choisis qui peuvent interagir (par le biais soit interactions récepteur-ligand ou liaison covalente) avec les groupes fonctionnels sur la surface. Ici, l&#39;agent de couplage silane, qui a trois groupes partants et un groupe fonctionnel, fournit le pari pontWeen la surface inorganique et organique molécule sonde. La fonction amine primaire réagit quantitativement avec des esters NHS pour former des liaisons amide stables. Dans ce cas, nous utilisons une molécule sonde biotine dont la chaîne latérale valérique a été modifiée avec un groupe ester de NHS. Réaliste, une molécule sonde à laquelle un groupe ester de NHS peut être ajouté à la surface en utilisant des protocoles suivants. En outre, ces protocoles sont d&#39;ordre général, et peut être utilisé pour fonctionnaliser une surface du dispositif de silice avec de la biotine. Le principal défi de ces protocoles n&#39;est pas réellement dans la chimie elle-même, mais plutôt dans la manipulation des microsphères de silice. S&#39;il vous plaît noter que, tout au long des protocoles, les microsphères doivent être manipulés par leurs tiges grapsing légèrement avec forte à bout des pincettes. Cela permet de maintenir la pince à épiler bien loin de la microsphères eux-mêmes, et permet un transport facile entre les étapes. De nombreuses étapes dans le protocole ci-dessous sont spécifiquement conçus pour répondre à cet état de faitou. 2. Fabrication des microsphères <ol><li> Construire le boîtier de stockage pour les microsphères. <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un couteau exacto, couper un ¼ dans la pièce de carton épais en un 1 po x 1 po carré; la bande de ce sur une lame de verre de taille normale, et joindre un 1 dans la section de scotch, avec ses extrémités se rencontrent pour former un rouleau , sur le carton. </li><li> Cela crée une plate-forme sur laquelle la microsphère peut être élevé et isolé du milieu environnant, et prévient les dommages à leur surface. </li></ol></li><li> Avec des ciseaux, couper une section de 3 pouces de la fibre optique à partir d&#39;une bobine de fibre optique. </li><li> Utilisation d&#39;un n-Nik fibres décapant, dénuder le revêtement protecteur polymère à partir des 0,5 derniers centimètres de l&#39;extrémité de la pièce de coupe de la fibre, en laissant seulement le noyau de silice. Nettoyer la surface de n&#39;importe quel polymère restant avec un Kimwipe humidifié avec du méthanol en essuyant délicatement la fibre avec le Kimwipe. </li><li> En utilisant une fibre nue couperet, couper l&#39;extrémité dénudée afin èmeà seulement environ 1 millimètre de fibre dénudée reste sur l&#39;extrémité de la fibre. </li><li> Placer l&#39;extrémité dénudée de la fibre optique dans le trajet d&#39;un laser à CO 2, en prenant soin de la fibre aligner verticalement de telle sorte que son extrémité dénudée est orienté vers le bas. </li><li> Allumer le laser à CO 2, et la diriger vers la surface de l&#39;extrémité dénudée de la fibre optique. Le laser va fondre l&#39;extrémité dénudée de la fibre dans une sphère à l&#39;aide d&#39;environ 3,5% en puissance de 2 secondes. </li><li> Utilisation pinces, soigneusement saisir la tige (la partie non dénudée de la fibre optique) de la microsphère. Fixer la tige à la rouleau de ruban adhésif sur le boîtier de la microsphère. La lame de verre peut être lui-même stocké dans une boîte de Pétri. Cela permet pour le stockage sûr de la microsphère. </li></ol> 3. Remplissage de la surface avec des groupes hydroxyles <ol><li> Grâce à la solution piranha: <ol><li> Dans un flacon de 60 ml en polypropylène avec un bouchon à charnière, préparer une solution piranha (70:30 en volume fumant H <sub&gt; 2 SO 4: H 2 O 2 (30% en poids)) par addition de 5 ml de peroxyde d&#39;hydrogène dans le flacon, suivie par 11,6 ml d&#39;acide sulfurique fumant. ATTENTION: porter des gants résistant aux acides. </li><li> Transférer la lame de verre, contenant au moins 1 microsphère, dans le flacon. Microsphère doit être en contact avec le liquide, mais que le liquide ne doit pas toucher le carton. Réglez le volume de la solution si nécessaire. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et l&#39;insérer dans un autre flacon en plastique contenant DDI H 2 O. Laissez les échantillons s&#39;asseoir dans la solution pendant 5 minutes. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et placez-le au four à 80 ° C pendant 10 minutes pour sécher la surface. </li></ol></li><li> Utilisation de traitement au plasma d&#39;oxygène: <ol><li> Transférer la lame de verre contenant au moins une microsphére à la chambre de plasma d&#39;oxygène. </li><li> Régler la pression d&#39;oxygène à 200 mTorr, et la puissance à 120 W. Exposer l&#39;échantillon à plasma d&#39;oxygène pour les 2 minutes. </li><li> Retirez la lame de verre de la chambre à plasma. </li></ol></li></ol> 4. Fixation agents de couplage silane à la surface <ol><li> Placer la lame de verre, contenant au moins une microsphére, dans un dessiccateur à vide dans une hotte. </li><li> Egalement dans la hotte, ouvrir la bouteille de couplage au silane agent (dans ce cas, l&#39;aminopropyltriméthoxysilane (APTMS) a été utilisé), et placez la bouteille ouverte dans le dessiccateur. </li><li> Replacez le couvercle sur le dessiccateur à vide, et joindre le port de sortie à un aspirateur ou d&#39;une ligne vide la maison. </li><li> Allumez le vide maison ou la ligne d&#39;eau, et d&#39;évacuer le dessiccateur sous vide. Une fois une étanchéité au vide est formée entre le couvercle et la base, commence minuter la réaction. Cela déposer l&#39;agent de couplage silane sur la surface en tant que film mince. </li><li> Après 15 minutes, éteignez le vide, et ouvrir lentement le port pour laisser l&#39;air dans le dessiccateur. Pour cet agent de couplage, à 15 minutes est suffisante pour former une unifomonocouche rm sur la surface. Pour d&#39;autres agents de couplage, le temps peut être nécessaire d&#39;ajuster. </li></ol> 5. Fixation biotine à la surface <ol><li> Environ une heure avant de fixer la biotine, préparer une solution de 10 mM de N-hydroxysuccinimide de biotine (NHS-biotine) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) anhydre dans un flacon 60 ml en polypropylène avec un bouchon à charnière. <ol><li> Si le NHS-biotine a été stockée à froid, le laisser se stabiliser à la température ambiante avant de le masser sur. </li><li> Sonication de la solution pendant 1 heure pour dissoudre complètement la poudre NHS-biotine dans le solvant. </li></ol></li><li> Transférer la lame de verre contenant de la microsphère dans un autre flacon en matière plastique, avec les microsphères au fond, et les tiges dans la partie supérieure du flacon. </li><li> Transfert, à l&#39;aide d&#39;une pipette en plastique, un volume approprié de la solution NHS-biotine sur le côté de la fiole, derrière la lame de verre (façon la solution ne touche pas la microsphère telle qu&#39;elle est ajouté à la fiole). Unejj solution suffisante pour couvrir la surface des microsphères. </li><li> Placer les flacons contenant les microsphères maintenant et NHS-biotine dans une solution DMSO sur un incubateur à bascule (plateaux basculants) pendant 30 minutes à température ambiante, avec la vitesse et l&#39;angle d&#39;inclinaison à 5 tours par minute et 5 degrés, respectivement. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et doucement glisser dans un autre flacon rempli de DDI H O. 2 Placez le flacon sur le plateau d&#39;inclinaison pour un autre 10 minutes à la même vitesse et l&#39;angle d&#39;inclinaison comme avant. Répétez cette étape deux fois avec de l&#39;eau fraîche à chaque fois. Cela permet de supprimer le DMSO excès de la surface, et supprime toute la biotine physiquement adsorbée qui n&#39;a pas fait greffé à la surface. </li><li> Retirer la lame de verre de la fiole, et le placer dans une étuve à 80 ° C pendant 10 minutes, ou jusqu&#39;à ce que toutes les gouttelettes d&#39;eau sont éliminées de la surface. </li></ol> 6. Marquage fluorescent de terminaison amine de silice <ol><li> Pour étiqueter les groupes amine présents après traitement avec APTMS, préparer la solution de FITC dans une pièce sombre en dissolvant 1 mg FITC dans 1 ml de DMSO anhydre. </li><li> Diluer la solution dans 6,1 par addition de 50 pl de la solution de FITC à 1 mL de 0,1 M de tampon bicarbonate de sodium. </li><li> Placer la solution dans un flacon 60 ml en polypropylène avec un bouchon à charnière, et faites glisser doucement les microsphères à terminaison amine, logé à nouveau sur la lame de verre, dans le flacon. </li><li> Placez le flacon dans un bain de glace, et de laisser l&#39;échantillon réagissent avec la solution FITC pour un minimum de 4 heures dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer l&#39;excès fluorophore travers deux rinçages, 10 minute de l&#39;microsphères dans un tampon carbonate de sodium. Comme auparavant, remplir un flacon 60 ml en polypropylène avec un bouchon à charnière avec le tampon, et faites glisser doucement la lame de verre dans la solution, en prenant soin que la solution ne couvre que la microsphère, et non pas le boîtier en carton. Couvrir le flacon avec une feuille d&#39;aluminium, et placez le flacon sur un plateau d&#39;inclinaison fixé à 5 degrés et 5 tours, comme avant. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et doucement glisser dans un autre flacon rempli de DDI H 2 O et recouverts d&#39;une feuille d&#39;aluminium. Placez le flacon sur le plateau d&#39;inclinaison pour un autre 10 minutes à la même vitesse et l&#39;angle d&#39;inclinaison comme avant. Répétez cette étape deux fois avec de l&#39;eau fraîche à chaque fois. Cela permet de supprimer l&#39;excédent de teinture de la surface. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et au sec dans un four réglé à 80 ° C pendant 10 minutes avant l&#39;imagerie. </li></ol> 7. Marquage fluorescent de la biotine-terminée par de la silice <ol><li> Préparer une solution à 10 pg / ml du Texas-Red avidine en tampon phosphate salin. </li><li> Ajouter la solution à un flacon polypropylène 60 ml avec un couvercle articulé, et lentement coulisser la lame de verre contenant une microsphère biotine à terminaison dans la solution, de sorte que la microsphère est juste recouverte par la solution. </li><li> Réagir pendant 30 minutes à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer fluorophore en excès par deux, 10 minutes de rinçages des microsphères dans du tampon PBS. <ol><li> Comme auparavant, remplir un flacon 60 ml en polypropylène avec un bouchon à charnière avec le tampon, et faites glisser doucement la lame de verre dans la solution, en prenant soin que la solution ne couvre que la microsphère, et non pas le boîtier en carton. </li><li> Couvrir le flacon avec une feuille d&#39;aluminium, et placez le flacon sur un plateau d&#39;inclinaison fixé à 5 degrés et 5 tours, comme avant. </li></ol></li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et doucement glisser dans un autre flacon rempli de DDI H 2 O et recouverts d&#39;une feuille d&#39;aluminium. Placez le flacon sur le plateau d&#39;inclinaison pour un autre 10 minutes à la même vitesse et l&#39;angle d&#39;inclinaison comme avant. Répétez cette étape deux fois avec de l&#39;eau fraîche à chaque fois. Cela permet de supprimer l&#39;excédent de teinture de la surface. </li><li> Retirez délicatement la lame de verre du flacon, et au sec dans un four réglé à 80 ° C pendant 10 minutes avant l&#39;imagerie. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Microsphère correctement fonctionnalisés peuvent être identifiés par microscopie optique et de fluorescence. Si la fonctionnalisation de surface est fait correctement, il devrait aboutir à une couverture homogène et dense de molécules de biotine sur la surface, et la surface doit rester défaut et exempt de contaminants après fonctionnalisation afin de maintenir leurs sensibilités élevées au cours des expériences de détection. La microscopie optique peut être utilisé pour sonder ce dernier, tandis que la microscopie fluorescente permet de sonder la qualité et l&#39;uniformité de la couverture de surface. Dans la figure 2, nous montrons des exemples de microsphères correctement fonctionnalisé. Ces images montrent qu&#39;il n&#39;y a pas endommager la surface ou la contamination due à la fonctionnalisation (fig. 2a), et que les microsphères montrent un uniforme, une couverture uniforme de groupes amine soit (fig. 2b) ou des groupes biotine (figure 2c) sur la surface . Si les microsphères ont pas été correctement fonctionnalisés, la microsphère optique des images will présentent une contamination de surface, la couverture agglutination ou non uniforme, et les défauts évidents dans la surface, comme des fissures de surface (Figure 3). Ici, nous voyons un exemple courant de la contamination de surface, résultant de l&#39;agglutination des réactifs à la surface. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma réactionnel 3-étape pour la fixation des molécules sondes à la surface de microsphères de silice. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> Figure 2. Microsphères de silice. une micrographie) optique de microsphères de silice peuplée avec des groupes hydroxyles par l&#39;exposition à un plasma d&#39;oxygène; b) Micrographie fluorescent de microsphères de silice peuplée avec des amines primaires et marqué au FITC colorant; c) micrographie fluorescent de silice microsphere peuplée avec de la biotine et étiquetés au Texas Red-avidine conjuguée. Reproduit avec la permission de Soteropulos, CE, Hunt, HK &amp; Armani, AM Détermination de la cinétique de liaison en utilisant chuchotant microcavités mode de galerie. Appl. Phys. Lett. 99, 103703 à 103703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics 17. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> Figure 3. Micrographie optique de la sphère mal fonctionnalisés. Ici, vous pouvez voir la poussière sur la surface en haut à droite, ainsi que la contamination s&#39;étend hors de la surface. En outre, le côté droit de la microsphère optique présente une motte de terre petite à la surface.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Comme décrit dans les protocoles, nous avons créé une plate-forme de logement qui pour transporter les microsphères de silice par leurs tiges tout au long du processus de fonctionnalisation. Cette plate-forme de logement a été créé comme une solution à la contamination de surface et les dommages qui ont résulté de la microsphère entrer en contact avec les parois des récipients divers utilisés dans le procédé de fonctionnalisation. Nous avons réalisé la principale difficulté résulte de constamment att...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> Pêcheur </td><td> 67-56-1 </td><td> Qualité ACS </td></tr><tr><td> Acide sulfurique </td><td> Pêcheur </td><td> 8014-95-7 </td><td> Fumant </td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène </td><td> Pêcheur </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30% en poids </td></tr><tr><td> Aminopropyltriméthoxysilane </td><td> Pêcheur </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-biotine linker EZ </td><td> Percer </td><td> 20217 </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde </td><td> Pêcheur </td><td> 67-68-5 </td><td> Anhydre </td></tr><tr><td> Isothiocyanate de fluorescéine </td><td> Percer </td><td> 46425 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Pêcheur </td><td> 7647-14-5 </td><td> Concentré de poudre </td></tr><tr><td> Tampon bicarbonate de sodium </td><td> Pêcheur </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red - avidine conjugué </td><td> Percer </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> Fibre Optique </td><td> Newport </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> Décapant fibre </td><td> Les ventes d&#39;instruments à fibre </td><td> NN-175 </td><td> Non-Nik 175 um décapant </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Pêcheur </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> Bare Fiber Cleaver </td><td> Ilsintech </td><td> Cl-03A </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Pêcheur </td><td> 12-550B </td><td></td></tr><tr><td> Flacons en polypropylène </td><td> Pêcheur </td><td> 03-341-75A </td><td> 60 ml, avec bouchon à charnière </td></tr><tr><td> Incubation Rocker </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> Dessiccateur à vide </td><td> Pêcheur </td><td> 08-594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

attaching biological probes to silica optical biosensors using silane coupling agents

Pour l&#39;interface avec les milieux biologiques, les plates-formes de biocapteurs, tels que le populaire système Biacore (basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR) technique), faire usage des diverses techniques de modification de surface, qui peuvent, par exemple, de prévenir l&#39;encrassement de surface, régler le hydrophobie / hydrophilie de la surface, de s&#39;adapter à une variété d&#39;environnements électroniques, et le plus souvent, induisent une spécificité vers une cible d&#39;intérêt. 1-5 Ces techniques d&#39;étendre les fonctionnalités de biocapteurs par ailleurs très sensibles aux applications du monde réel dans des environnements complexes, tels que le sang, l&#39;urine, et l&#39;analyse des eaux usées. 2,6-7 Alors que les plates-formes de biodétection commerciaux, tels que Biacore, ont bien compris, des techniques standard pour effectuer des modifications de surface tels, ces techniques n&#39;ont pas été traduits de manière standardisée à d&#39;autres étiquettes plates-formes libres biocapteurs, comme Whispering Gallery Mode (WGM) résonateurs optiques. 8-9 moins de<html> / P&gt; Résonateurs optiques WGM représentent une technologie prometteuse pour effectuer sans étiquette de détection d&#39;une grande variété d&#39;espèces à ultra-faibles concentrations 6,10-12 La grande sensibilité de ces plates-formes est le résultat de leurs uniques optique géométrique:. WGM optique résonateurs confinent circulation . la lumière à des fréquences de résonance spécifiques, intégrés 13 Comme les plates-formes SPR, le domaine de l&#39;optique n&#39;est pas totalement confiné au dispositif de capteur, mais evanesces; cette &quot;queue évanescente&quot; peut alors interagir avec des espèces dans le milieu environnant. Cette interaction provoque l&#39;indice de réfraction effectif du champ optique à modifier, résultant en une légère, mais détectable, décaler la fréquence de résonance du dispositif. Parce que le champ optique circule, il peut interagir plusieurs fois avec l&#39;environnement, ce qui entraîne une amplification du signal intrinsèque, et des sensibilités très élevées à des changements mineurs dans l&#39;environnement. 2,14-15 tente &quot;&gt; Pour effectuer une détection ciblée dans des environnements complexes, ces plates-formes doit être couplé avec une molécule sonde (généralement la moitié d&#39;une paire de liaison, par exemple des anticorps ou antigènes) à travers la modification de surface. 2 Bien que résonateurs optiques WGM peut être fabriqué en différentes géométries de une série de systèmes matériels, la microsphère de silice est le plus commun. ces microsphères sont généralement fabriqué sur l&#39;extrémité d&#39;une fibre optique, qui fournit une «stem» par lequel les microsphères peuvent être traitées au cours des expériences de fonctionnalisation et de détection. chimie de surface de silice peut appliquer à fixer des molécules de sonde à leurs surfaces, mais les techniques traditionnelles générés pour des substrats planes sont souvent pas suffisant pour ces structures tridimensionnelles, que toute modification apportée à la surface des microsphères (poussières, la contamination, des défauts de surface, et les revêtements inégales) peut avoir de graves, les conséquences négatives sur leurs capacités de détection. Ici, nous démontrons une approche facilepour la fonctionnalisation de surface de résonateurs de silice WGM microsphères optiques utilisant des agents de couplage silane pour combler la surface inorganique et l&#39;environnement biologique, en attachant la biotine à la surface de silice. 8,16 Bien que nous utilisions des résonateurs de silice microsphères WGM que le système de capteur dans le présent rapport, les protocoles sont générale et peut être utilisé pour fonctionnaliser la surface d&#39;un dispositif de silice avec de la biotine.

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Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Biocapteurs s&#39;interfacer avec des environnements complexes et biologiques et effectuer une détection ciblée en combinant des capteurs très sensibles avec des sondes très spécifiques attachés à la sonde par l&#39;intermédiaire d&#39;une modification de surface. Ici, on démontrer la fonctionnalisation de la surface de capteurs optiques en silice avec de la biotine en utilisant des agents de couplage silane pour combler le capteur et le milieu biologique.

Fixation des sondes biologiques à des biocapteurs optiques de silice à l&#39;aide d&#39;agents de couplage au silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K vues.  University of Missouri. Biocapteurs s'interfacer avec des environnements complexes et biologiques et effectuer une détection ciblée en combinant des capteurs très sensibles avec des sondes très spécifiques attachés à la sonde par l'intermédiaire d'une modification de surface. Ici, on démontrer la fonctionnalisation de la surface de capteurs optiques en silice avec de la biotine en utilisant des agents de couplage silane pour combler le capteur et le milieu biologique.