Os autores agradecem o Prof Andrea Armani na University of Southern California para apoio durante o tempo este protocolo foi desenvolvido. Financiamento para o desenvolvimento inicial deste trabalho foi fornecido pelo National Science Foundation [085281 e 1028440] e do Instituto Nacional de Saúde através do Programa Nova NIH Director do Innovator Award [1DP2OD007391-01]. Informações adicionais estão disponíveis em <a href="http://web.missouri.edu/~hunthk/" target="_blank">http://web.missouri.edu/ ~ hunthk /</a> .

1. Fundo A biotina é ligada à superfície destes dispositivos por meio de um processo simples de três passos (Figura 1). Primeiro, nós limpar a superfície e preenchê-lo com grupos hidroxilo, expondo os dispositivos para o plasma de oxigénio ou de solução piranha. Em segundo lugar, usar deposição de vapor para prender o agente de acoplamento de silano terminada com uma amina primária para os grupos hidroxilo através de hidrólise e reacção de condensação. Em terceiro lugar, damos biotina para a superfície através de N-hidroxissuccinimida (NHS) Química éster. Nós dirigimos o leitor interessado em nosso trabalho anterior para obter mais informações sobre o desenvolvimento dessas técnicas, bem como uma explicação de nossa motivação para a escolha destas técnicas 8. O sucesso destas reacções pode ser avaliada através de microscopia óptica e de fluorescência após a adição da amina primária, assim como após a adição da biotina. Enquanto m ópticaicroscopy pode ser usado para determinar se os protocolos de funcionalização da superfície resultou em danos para a superfície de microesferas, ou mesmo a contaminação, a microscopia de fluorescência é utilizado para verificar a qualidade e uniformidade da cobertura da superfície da molécula de biotina, bem como a capacidade da biotina no a superfície a ligar com (strept) avidina. Para avaliar a cobertura de aminas na superfície, utilizou-se o isotiocianato de fluoresceína (FITC) corante fluorescente, que reage com aminas primárias para formar estável, a ligação covalente de tioureia para a microesfera. Texas Red corante fluorescente que tem sido conjugado com avidina é usado para identificar os grupos de biotina na superfície através da interacção biotina-avidina. Em ambos os casos, foram escolhidos corantes que podem interagir (quer através de interacções receptor-ligando ou ligação covalente) com os grupos funcionais sobre a superfície. Aqui, o agente de acoplamento de silano, que tem três grupos de saída e um grupo funcional, fornece a aposta pontetre a superfície inorgânica e orgânica molécula de sonda. A funcionalidade amina primária reage quantitativamente com ésteres de NHS para formar ligações amida estáveis. Neste caso, usamos uma molécula sonda de biotina, cuja cadeia lateral valérico foi modificado com um grupo éster NHS. Realisticamente, qualquer molécula de sonda para o qual um grupo éster NHS pode ser adicionado à superfície utilizando os protocolos que se seguem. Além disso, esses protocolos são em geral, e pode ser usado para funcionalizar qualquer superfície dispositivo de sílica com biotina. O desafio primária com esses protocolos não é na verdade na química si, mas sim no tratamento da sílica microesferas. Por favor note que, ao longo dos protocolos, as microesferas devem ser manuseados por grapsing suas hastes levemente com uma pinça de ponta aguçada. Isto mantém as pinças bem longe da microesferas si, e permite o transporte fácil entre os passos. Muitos passos do protocolo abaixo são projetados especificamente para abordar este fatoou. 2. Fabricação de microesferas <ol><li> Construir o invólucro de armazenamento para as microesferas. <ol><li> Usando um estilete, corte um pedaço de espessura em ¼ de papelão em um 1 x 1 no quadrado; esta fita numa lâmina de vidro de tamanho normal, e anexar a 1 na seção de fita adesiva, com suas extremidades reunidos para formar um rolo , para o papelão. </li><li> Isto cria uma plataforma sobre a qual a microsfera pode ser elevada e isolado a partir do ambiente circundante, e evita danos à sua superfície. </li></ol></li><li> Utilizando uma tesoura, cortar uma secção de 3 polegadas de fibra óptica a partir de um carretel de fibra óptica. </li><li> Usando um n-Nik fibra-stripper, tira o revestimento protector polimérico a partir dos últimos 0,5 cm de distância da extremidade da peça cortada de fibra, deixando apenas o núcleo de sílica. Limpar a superfície de qualquer polímero restante com uma Kimwipe humedecido com metanol por suavemente limpando a fibra com o Kimwipe. </li><li> Usando uma simples fibra cutelo, corte a extremidade descascada tão them apenas cerca de 1 milímetro de fibra despojado permanece na extremidade da fibra. </li><li> Coloque a extremidade descarnada da fibra óptica no caminho de um laser de CO 2, tendo o cuidado de alinhar verticalmente a fibra tal que a sua extremidade descarnada está voltada para baixo. </li><li> Ligue o laser de CO 2, e dirigi-lo para a superfície da extremidade descarnada da fibra óptica. O laser vai derreter a extremidade descascada da fibra em uma esfera com cerca de 3,5% de poder em 2 segundos. </li><li> Com uma pinça, cuidadosamente agarrar da haste (a porção não-descascada da fibra óptica) da microesfera. Fixe a haste com o rolo de fita na caixa de microesferas. A lâmina de vidro pode ser em si armazenado numa placa de Petri. Isto permite a armazenagem segura da microesfera. </li></ol> 3. Preenchendo a superfície com grupos hidroxila <ol><li> Usando solução piranha: <ol><li> Em um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada, preparar uma solução piranha (70:30 em volume fumegante H <sub&gt; 2 SO 4: H2O 2 (30% em peso)) pela adição de 5 ml de peróxido de hidrogénio para o frasco, seguido por 11,6 mL de ácido sulfúrico fumante. CUIDADO: usar ácido-resistentes luvas. </li><li> Transferir a lâmina de vidro, que possuem pelo menos uma microesfera, ao frasco. A microesfera deve estar em contacto com o líquido, mas o líquido não deve tocar o papelão. Ajustar o volume da solução, se necessário. </li><li> Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e inseri-lo em outro frasco plástico contendo DDI H 2 O. Deixe as amostras sentar-se na solução durante 5 minutos. </li><li> Remover suavemente a lâmina de vidro a partir do frasco, e colocá-lo num forno a 80 ° C durante 10 minutos para secar a superfície. </li></ol></li><li> Usando o tratamento de plasma de oxigênio: <ol><li> Transferir a lâmina de vidro contendo pelo menos uma microesfera para a câmara de plasma de oxigénio. </li><li> Ajustar a pressão de oxigénio para 200 mTorr, eo poder de 120 W. Expor a amostra para o plasma de oxigénio durante 2 minutos. </li><li> Remover a lâmina de vidro a partir da câmara de plasma. </li></ol></li></ol> 4. Colocar agentes de acoplamento de silano à superfície <ol><li> Coloque a lâmina de vidro, contendo pelo menos uma microesfera, em um exsicador de vácuo numa hotte. </li><li> Também no exaustor, abrir a garrafa agente silano de engate (neste caso, aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) foi utilizado), e colocar a garrafa aberta no exsicador. </li><li> Colocar a tampa sobre o exsicador de vácuo, e anexar a porta de saída para um aspirador ou uma linha de vácuo casa. </li><li> Ligue o vácuo casa ou a linha de água, e evacuar o exsicador de vácuo. Uma vez que um selo de vácuo é formado entre a tampa ea base, começar a cronometragem a reacção. Isto irá depositar o agente de acoplamento de silano sobre a superfície como uma película fina. </li><li> Após 15 minutos, desligar a vácuo, e, lentamente, abrir a porta para permitir que o ar no exsicador. Para este agente de acoplamento, a 15 minutos é suficiente para formar um unifomonocamada rm sobre a superfície. Para outros agentes de acoplamento, o tempo pode necessitar de ser ajustada. </li></ol> 5. Colocar Biotina à superfície <ol><li> Aproximadamente uma hora antes de prender a biotina, preparar uma solução 10 mM de N-hydroxylsuccinimide biotina (NHS-biotina) em dimetilsulfóxido anidro (DMSO) num frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada. <ol><li> Se o NHS-biotina foi armazenado frio, deixe-o atingir a temperatura ambiente antes juntando-lo. </li><li> Sonicar a solução durante 1 hora para dissolver completamente o pó NHS-biotina no solvente. </li></ol></li><li> Transferir a lâmina de vidro contendo a microesfera em outro frasco de plástico, com as microesferas no fundo, e as hastes na parte superior do frasco. </li><li> De transferência, usando uma pipeta de plástico, um volume apropriado da solução NHS-biotina para o lado do frasco, por trás da lâmina de vidro (para que a solução não toca a microesfera como está sendo adicionada ao frasco). Add solução suficiente para cobrir a superfície de microesferas. </li><li> Colocar os tubos que contêm agora as microesferas e NHS-biotina em solução de DMSO numa incubadora de balanço (bandeja de inclinação) durante 30 minutos à temperatura ambiente, com a velocidade e ângulo de inclinação a 5 rpm e 5 graus, respectivamente. </li><li> Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e deslize-o em outro frasco cheio de DDI H 2 O. Colocar o frasco sobre a bandeja de inclinação por mais 10 minutos à mesma velocidade e ângulo de inclinação, como antes. Repetir este passo duas vezes com água fresca de cada vez. Isto ajuda a remover o excesso de DMSO a partir da superfície, e remove qualquer biotina fisicamente adsorvido que não chegou a enxerto à superfície. </li><li> Remover a lâmina de vidro a partir do frasco, e colocá-lo num forno a 80 ° C durante 10 minutos, ou até que todas as gotas de água são removidos da superfície. </li></ol> 6. Marcação fluorescente de amina terminada sílica <ol><li> Para identificar os grupos amina presentes após tratament com APTMS, preparar a solução de FITC num quarto escurecido por dissolução de 1 mg em 1 mL de FITC DMSO anidro. </li><li> Dilui-se a solução em 6,1 pela adição de 50 uL da solução de FITC a 1 mL de 0,1 M tampão de bicarbonato de sódio. </li><li> Coloque a solução num frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada e deslize suavemente a microesferas de amina terminada, alojados novamente sobre a lâmina de vidro, para dentro do frasco. </li><li> Colocar o frasco num banho de gelo, e deixar a amostra reagir com a solução de FITC durante um mínimo de 4 horas no escuro. </li><li> Remover o excesso fluoróforo através de duas lavagens, 10 minutos de microsferas em tampão de carbonato de sódio. Como antes, encher um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada com o tampão, e deslize suavemente a lâmina de vidro para dentro da solução, tendo o cuidado de que a solução apenas cobre a microesfera, e não o invólucro de cartão. Cobrir o frasco com folha de alumínio, e colocar o frasco sobre uma bandeja de inclinação fixada em 5 graus e 5 rpm, como anteriormente. </li><li> Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e deslize-o em outro frasco cheio de DDI H 2 O e coberto com papel alumínio. Colocar o frasco sobre a bandeja de inclinação por mais 10 minutos à mesma velocidade e ângulo de inclinação, como antes. Repetir este passo duas vezes com água fresca de cada vez. Isto ajuda a remover o excesso de corante da superfície. </li><li> Remover suavemente a lâmina de vidro a partir do frasco, e seco num forno regulado a 80 ° C durante 10 minutos antes de imagem. </li></ol> 7. Marcação fluorescente da biotina terminada sílica <ol><li> Preparar uma solução de 10 ug / mL de Texas Red-avidina em tampão fosfato salino. </li><li> Adicionar a solução para um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada e deslize suavemente a lâmina de vidro contendo uma microesfera biotina terminada dentro da solução, de modo que a microesfera está coberto pela solução. </li><li> Reagir durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Remover fluoróforo excesso através de dois, 10 minutos enxaguars de microsferas em tampão PBS. <ol><li> Como antes, encher um frasco de polipropileno de 60 ml com uma tampa articulada com o tampão, e deslize suavemente a lâmina de vidro para dentro da solução, tendo o cuidado de que a solução apenas cobre a microesfera, e não o invólucro de cartão. </li><li> Cobrir o frasco com folha de alumínio, e colocar o frasco sobre uma bandeja de inclinação fixada em 5 graus e 5 rpm, como anteriormente. </li></ol></li><li> Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do frasco, e deslize-o em outro frasco cheio de DDI H 2 O e coberto com papel alumínio. Colocar o frasco sobre a bandeja de inclinação por mais 10 minutos à mesma velocidade e ângulo de inclinação, como antes. Repetir este passo duas vezes com água fresca de cada vez. Isto ajuda a remover o excesso de corante da superfície. </li><li> Remover suavemente a lâmina de vidro a partir do frasco, e seco num forno regulado a 80 ° C durante 10 minutos antes de imagem. </li></ol> 8. Os resultados representativos Microesfera corretamente funcionalizados podem ser identificados através de microscopia óptica e de fluorescência. Se a funcionalização da superfície é feito correctamente, deve resultar em uma cobertura uniforme densa de moléculas de biotina na superfície, ea superfície deve permanecer defeito e contaminante-livre após a funcionalização, a fim de manter as suas sensibilidades elevadas durante as experiências de detecção. A microscopia óptica pode ser usado para sondar a esta última, enquanto fluorescente microscopia pode sondar a qualidade e uniformidade da cobertura da superfície. Na Figura 2, que mostram exemplos de microesferas correctamente funcionalizado. Estas imagens mostram que não há danos na superfície ou contaminação devida a funcionalização (Fig. 2a), e que as microesferas mostram uma cobertura uniforme e consistente de grupos tanto de amina (Fig. 2b) ou grupos de biotina (Fig. 2c) sobre a superfície . Se as microesferas não foram funcionalizados correctamente, a microsferas óptico de imagens will exibem a contaminação da superfície, a cobertura de aglutinação ou não-uniforme, e defeitos óbvias na superfície, como fissuras de superfície (Figura 3). Aqui, vemos um exemplo comum de contaminação da superfície, resultante da aglomeração dos reagentes na superfície. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig1.jpg" /> Figura 1. 3-passo esquema de reacção para a fixação de moléculas de sonda para a superfície de sílica microesferas. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3866/3866fig1large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig2.jpg" /> Figura 2. Sílica microesferas. uma micrografia) óptico de microesfera de sílica preenchida com grupos hidroxilo através da exposição ao plasma de oxigénio; b) micrografia fluorescente de microesfera de sílica preenchida com aminas primárias e marcadas com FITC corante; c) micrografia fluorescente de sílica microsphere preenchida com biotina e rotuladas com Texas Red-avidina conjugada. Reproduzido com permissão da Soteropulos, CE, Hunt, HK &amp; Armani, AM Determinação da cinética de ligação usando microcavidades modo sussurrando galeria. Appl. Phys. Lett. 99, 103.703-103.703 (2011). Copyright 2011, a American Institute of Physics 17. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3866/3866fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografia óptica de esfera impropriamente funcionalizado. Aqui, pode ver pó sobre a superfície superior direito, bem como a contaminação se estende para fora da superfície. Além disso, o lado direito da microesfera óptico mostra um torrão pequeno sobre a superfície.

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U.S.A. 105, 20701-20704 (2008).</li><li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+microcavity+optical+biosensors.">Recycling microcavity optical biosensors.</a> Opt. Lett. 36, 1092-1094 (2011).</li><li>Soteropulos, C. E., Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+binding+kinetics+using+whispering+gallery+mode+microcavities.">Determination of binding kinetics using whispering gallery mode microcavities.</a> Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Tal como descrito nos protocolos, foi criada uma plataforma de habitação, através da qual a transportar o microesferas de sílica por suas hastes durante todo o processo de funcionalização. Esta plataforma habitação foi criado como uma solução para a contaminação da superfície e danos que resultou da microesfera que entram em contacto com as paredes dos recipientes diferentes usados ​​em todo o processo de funcionalização. Percebemos que a principal dificuldade surgiu constantemente anexação e desane...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Pescador </td><td> 67-56-1 </td><td> ACS grau </td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> Pescador </td><td> 8014-95-7 </td><td> Irritado </td></tr><tr><td> Peróxido de Hidrogênio </td><td> Pescador </td><td> 7722-84-1 </td><td> 30% em peso </td></tr><tr><td> Aminopropiltrimetoxisilano </td><td> Pescador </td><td> 13822-56-5 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-biotina linker EZ </td><td> Perfurar </td><td> 20217 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Pescador </td><td> 67-68-5 </td><td> Anidro </td></tr><tr><td> Isotiocianato de fluoresceína </td><td> Perfurar </td><td> 46425 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino </td><td> Pescador </td><td> 7647-14-5 </td><td> Concentrado em pó </td></tr><tr><td> Tampão de bicarbonato de sódio </td><td> Pescador </td><td> NC0099321 </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red - Avidina Conjugado </td><td> Perfurar </td><td> A820 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra ótica </td><td> Newport </td><td> F-SC </td><td></td></tr><tr><td> Stripper Fibra </td><td> Instrumento de Vendas Fibra </td><td> NN-175 </td><td> No-Nik Stripper hum 175 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Pescador </td><td> 06666A </td><td></td></tr><tr><td> Nua Fibra Cleaver </td><td> Ilsintech </td><td> Cl-03A </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas de microscopia de vidro </td><td> Pescador </td><td> 12-550B </td><td></td></tr><tr><td> Os frascos de polipropileno </td><td> Pescador </td><td> 03-341-75A </td><td> 60 mL, tampa articulada </td></tr><tr><td> A incubação de Rocker </td><td&gt; VWR </td><td> 12620-910 </td><td></td></tr><tr><td> Exsicador de vácuo </td><td> Pescador </td><td> 08-594-15B </td><td></td></tr></tbody></table>

attaching biological probes to silica optical biosensors using silane coupling agents

A fim de interface com ambientes biológicos, plataformas de biossensor, tais como o sistema BIAcore popular (com base na ressonância plasmon de superfície técnica (SPR)), fazer uso de técnicas de superfície várias alterações, que podem, por exemplo, evitar a contaminação da superfície, ajustar o hidrofobicidade / hidrofilicidade da superfície, se adaptar a uma variedade de ambientes eletrônicos, e mais frequentemente, induzir especificidade em direção a um alvo de interesse. 1-5 Estas técnicas estender a funcionalidade de biossensores de outra forma altamente sensíveis para aplicações do mundo real em ambientes complexos, tais como sangue, urina, e análise de águas residuais. 2,6-7 Enquanto plataformas biosensoriamento comerciais, tais como BIAcore, têm bem entendido, as técnicas padrão para a realização de modificações de superfície tais, estas técnicas não foram traduzidos em uma forma padronizada para outro rótulo plataformas livres biosensoriamento, como Whispering Gallery modo (WGM) ressonadores ópticos. 8-9 &lt;<html> / P&gt; Ressonadores WGM ópticos representam uma tecnologia promissor para a realização de rótulo livre detecção de uma grande variedade de espécies de ultra-baixas concentrações 6,10-12 A elevada sensibilidade destas plataformas é um resultado dos seus únicos óptica geométrica:. WGM óptico ressonadores confine circulante . luz em momentos específicos, as frequências de ressonância integrais 13 como as plataformas SPR, o campo óptico não está totalmente confinada ao dispositivo sensor, mas evanesces; este &quot;cauda evanescente&quot; pode então interagir com as espécies no ambiente circundante. Esta interacção faz com que o índice de refracção efectivo do campo óptico para alterar, resultando em um ligeiro, mas detectáveis, deslocar na frequência de ressonância do dispositivo. Como o campo óptico circula, pode interagir muitas vezes com o meio ambiente, resultando numa amplificação inerente do sinal, e sensibilidades muito elevados a pequenas alterações no ambiente. 2,14-15 tenda &quot;&gt; Para realizar a detecção de alvo em ambientes complexos, estas plataformas devem ser emparelhado com uma sonda molecular (geralmente a metade de um par de ligação, por exemplo, anticorpos / antígenos) por meio de modificação da superfície. 2 Embora ressonadores WGM ópticos podem ser fabricados em diversas geometrias de uma variedade de sistemas de materiais, a microesfera de sílica é o mais comum. Estas microesferas são geralmente fabricadas na extremidade de uma fibra óptica, o que proporciona uma &quot;haste&quot;, através da qual as microesferas podem ser manipulados durante as experiências de funcionalização e de detecção. químicas superfície da sílica pode ser aplicado para anexar moléculas de sonda para as suas superfícies, no entanto, as técnicas tradicionais gerados para substratos planares muitas vezes não são adequados para estas estruturas tridimensionais, como quaisquer alterações na superfície das microesferas (contaminação, pó, defeitos de superfície, e revestimentos irregulares) pode ter graves consequências negativas sobre as suas capacidades de detecção. Aqui, nós demonstrar uma abordagem fácilpara a funcionalização da superfície de ressoadores de sílica de microsferas WGM ópticos usando agentes de acoplamento de silano para colmatar a superfície inorgânico e para o ambiente biológico, anexando biotina para a superfície de sílica. 8,16 Embora usamos ressoadores de sílica WGM de microsferas como o sistema de sensor no presente relatório, os protocolos são geral e pode ser usado para funcionalizar a superfície de qualquer dispositivo de sílica com biotina.

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Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Biossensores interface com ambientes complexos e biológicas e realizar a detecção de alvo, combinando sensores altamente sensíveis com sondas altamente específicos ligados ao sensor através de modificação da superfície. Aqui, nós demonstrar a funcionalização da superfície de sensores ópticos de sílica com biotina, utilizando agentes de acoplamento de silano para colmatar o sensor eo ambiente biológico.

Colocar Sondas Biológicas para Biossensores ópticos de sílica usando agentes de acoplamento de silano

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

attaching-biological-probes-to-silica-optical-biosensors-using-silane

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JoVE Journal

Bioengineering

12.9K visualizações.  University of Missouri. Biossensores interface com ambientes complexos e biológicas e realizar a detecção de alvo, combinando sensores altamente sensíveis com sondas altamente específicos ligados ao sensor através de modificação da superfície. Aqui, nós demonstrar a funcionalização da superfície de sensores ópticos de sílica com biotina, utilizando agentes de acoplamento de silano para colmatar o sensor eo ambiente biológico.

Vídeo: Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Enriquecimento protéico de baixo peso molecular em filmes finos de sílica mesoporosa para a descoberta de biomarcadores

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

Inserção de Flexible Neural Sondas Usando Reforços rígidos anexados com Biodissolvable Adhesive

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband Detector óptico de ultra-som para aplicações Medical Imaging

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos