Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIDCR subvención 1R01DE019796.

Los flujos de trabajo presentados Leo-permitir el etiquetado de isótopos estables de proteínas digiere y péptidos sintéticos. Estos experimentos de tiempo (Figura 1) son aplicables a los estudios de proteómica comparativa y cuantitativa así como la investigación de proteasa. Cada flujo de trabajo consta de dos pasos experimentales (Figura 2): A) El tiempo de muestreo resuelto de la respectiva 18 O-isótopos estables codificada reacción (proteasa de escisión catalizada por péptido; proteasa catalizada carboxilo reacción de intercambio de oxígeno; catalizada por ácido intercambio de oxígeno carboxilo reacción) y análisis B) por espectrometría de masas y la representación gráfica de 18-O incorporación cinética. A. Experimentos timecourse I. paleo-timecourse: Proteasa catalizada etiquetado de escisiones proteolíticas <ol><li> (Opcional) Los enlaces disulfuro de las proteínas (10 mM) y péptidos (250 mM) se redujo con DTT (concentración final 2,5 mM)en 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recién preparada) por incubación durante 30 min a 50 ° C. </li><li> (Opcional) cisteínas libres se alquiló con yodoacetamida (concentración final 10 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 por incubación durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Dependiendo de la proteasa de interés, la proteína / péptido soluciones deben ser limpiada para eliminar el tampón residual y el agente de alquilación. Use PepClean columnas C-18 spin (Thermo) para la limpieza de péptido y Vivaspin concentradores centrífugos (Sartorius) para el intercambio de tampones para muestras de proteínas. </li><li> Volver a disolver / péptidos / proteínas de cambio en 20 l tampón de reacción de la proteasa (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) que contenía 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Retirar una muestra de tiempo cero antes de la adición de la proteasa: Mezclar 0,5 l de la mezcla de reacción y 0,5 l de alfa ciano-4-hidroxicinámicomatriz de ácido (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Extender la muestra en un Opti-TOF 384 placa de MALDI objetivo (AB SCIEX) y dejar que las gotas de disolvente a temperatura ambiente hasta que se seque (aproximadamente 5 minutos). </li><li> Dividir la solución de reacción en dos alícuotas. La primera alícuota se incubaron con la proteasa de interés (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura recomendada para la enzima particular. La segunda alícuota se incubó sin proteasa y servirá como muestra de control. La primera alícuota representa una muestra estándar para la proteasa catalizada por O-18 etiquetado y puede ser utilizado para el péptido y la identificación de proteínas, detección de las actividades proteolíticas y seguimiento de las reacciones de escisión proteolítica. La segunda alícuota se usa para mostrar que 18 O-incorporación es inducida por la proteasa, por lo tanto, no etiquetado ni escisión se espera para esta muestra. </li><li> Siga la reacción mediante la eliminación de alícuotas de reacción y manchado como described del paso 5 a intervalos de tiempo como parece conveniente. Las condiciones de reacción descritas anteriormente se utilizan para controlar una reacción proteolítica para hasta cuatro días (aproximadamente 24 puntos). Iniciar el muestreo cada 5 min hasta 30 min, luego detectar cada 30 min hasta 2 h, después cada hora hasta 8 horas y cada 8 h hasta 4 días. Productos de escisión debe aparecer dentro de las primeras 12 horas y el sustrato debe estar completamente hidrolizada después de 24 horas. Tiempos de incubación prolongados de reacción permiten definir los productos de reacción que son estables discreta a partir de intermedios de reacción, que son objeto de transformación. Dependiendo de la pregunta de investigación y dados pares enzima-sustrato, los tiempos y temperaturas de incubación manchado tiene que ser modulada para asegurar el muestreo reacción óptima. </li><li> Después de que el punto de reacción se vio por última vez o en intervalos extendidos entre manchas, la placa de MALDI objetivo es sometido a MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe más adelante (Sección B). </li></ol> II. Paleo-timecourse: Postdigestion etiquetado de termini proteolíticas <ol><li> (Opcional) Los enlaces disulfuro de las proteínas (10 mM) y péptidos (250 mM) se redujo con DTT (concentración final 2,5 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recién preparado) por incubación durante 30 min a 50 ° C. </li><li> (Opcional) cisteínas libres se alquiló con yodoacetamida (concentración final 10 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 por incubación durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Dependiendo de la proteasa de interés, la proteína / péptido soluciones deben ser limpiada para eliminar el tampón residual y el agente de alquilación. Utilice columnas PepClean C-18 para la limpieza de spin péptido y Vivaspin concentradores centrífugos para el intercambio de proteína buffer. </li><li> Volver a disolver / cambiar los productos limpiado de péptidos / proteínas en 20 l tampón de reacción de la proteasa (por ejemplo tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) y se digiere con proteasa de interés para la terminación (por ejemplo, tripsina: 0,04 nM; 37 ° C; 12 hr). </li><li> Productos de limpieza de escisión con columnas PepClean C-18 espín. Este paso eliminará las actividades residuales de proteasa. </li><li> Volver a disolver / cambiar los productos limpiado de péptidos en tampón de 20 l reacción de la proteasa (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) que contenía 1:1 (v / v) final H 2 18 O. </li><li> Retirar una muestra de tiempo cero antes de la adición de enzima: Mezclar 0,5 l de la mezcla de reacción y 0,5 l de alfa ciano-4-hidroxicinámico (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Punto de la muestra en una placa diana MALDI y dejar las gotitas de disolvente a temperatura ambiente hasta que se seque (aproximadamente 5 min). </li><li> Dividir la solución de reacción en dos alícuotas. La primera alícuota se incubaron con proteasa de interés (por ejemplo, tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura recomendada para la enzima particular. La segunda alícuota se incubó sin proteasa y servirá como un control. La primeraalícuota representa una muestra estándar para la proteasa catalizada por 18 O-postdigestion etiquetado y puede ser utilizado para el péptido y cuantificación de proteínas. La segunda alícuota se usa para mostrar que 18 O-incorporación es catalizada por la proteasa, por lo tanto, no etiquetado se esperaba para esta muestra. </li><li> Seguir la reacción por la eliminación de alícuotas de reacción y manchado como se describe en el paso 7.) A intervalos de tiempo como parece conveniente. Por ejemplo, hemos descubierto inicialmente cada 5 minutos durante hasta 30 min y cada 15 min después de que para controlar la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo catalizada por tripsina. </li><li> Después de que el punto de reacción se vio por última vez o en intervalos extendidos entre manchas de la placa de MALDI objetivo es sometido a MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe más adelante (Sección B). </li></ol> III. Aleo-timecourse: catalizada por ácido etiquetado de grupos carboxilo <ol><li> Incubar péptidos individuales (50 nM) con 1:1 (v / v) 18 O-agua enriquecida en tél presencia o ausencia (control) de 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético definitiva (volumen total de 30 l). </li><li> Muestra los productos de reacción al día durante 48 días por co-spotting una alícuota de 0,5 l de la mezcla con 0.5μl matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA) directamente en una diana MALDI plato. </li><li> Entre los intervalos de aplicación, y después de ver el punto de reacción por última vez presentar placa MALDI objetivo para MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe a continuación en la Sección B. </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS de adquisición de datos y análisis <ol><li> Los espectros de masas se adquieren en un 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX). </li><li> Antes del análisis, el instrumento se calibra con una mezcla de péptidos estándares (Kit de estándares de masa para la calibración de AB SCIEX TOF / TOF instrumentos) con una tolerancia de error de masa máxima de medición de ± 50 ppm y un número mínimo de seis picos para que coincida. </li><li> MS espectros (rango de masas400 - 4.000 m / z) son adquiridos por triplicado utilizando el modo de ion positivo con una intensidad de láser ajustable (3.400 - 3.800; tamaño de paso 50) con un rango de intensidad de base aceptable pico de 2.000 - 45.000. TOMA DE hayan sido adquiridos con sub-espectros, con 400 golpes totales / espectro, deje de condiciones entrarán en vigor después de 800 sub-espectros se adquieren (aprobado o suspenso) o 400 espectros sub-criterios de aceptación de pase. En caso de poco abundantes muestras o en presencia de complejos orígenes biológicos el extremo inferior del rango de detección MS debería elevarse a 800 m / z. Además, puede ser necesario para eliminar la sal y otros compuestos que interfieren con un paso de limpieza de la muestra como se ha descrito anteriormente o mediante la separación LC. </li><li> MS archivos de datos (. DT2 archivos) se exportan desde el 4000 Series software de adquisición de datos y el Explorador de importación en nuestro propio sistema de información de laboratorio, que utiliza software MASCOTA Distiller (Matrix Science) para el procesamiento espectral y detección de picos. Sobres isotópicosson desconvolucionado y 18 O-incorporación coeficientes determinados automáticamente usando un algoritmo similar a la descrita por Mason et al. 12 y adaptada por nuestro grupo 9. Alternativamente, las herramientas de software, tales como ZoomQuant 13 y Viper 14, así como paquetes de software comerciales tales como BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) y cuantificación Mascot Distiller Toolbox (Matrix Science) puede deconvolute 18 O-tipo de datos 15,16. 18 O-incorporación relaciones se expresan como las contribuciones relativas de las distintas especies de isótopos de péptidos (es decir, los péptidos que contienen 16 O, 18 O 18 O 1 o 2) a la envolvente isotópica entero. </li><li> Para cada experimento timecourse, las masas moleculares ([M + H] +) para todas las especies de péptidos detectados son extraídos de los archivos asociados de datos de MS y los valores agrupada en una anchura de 100 ppm en masa. </li><li> Lal menos tres [M + H] + se fijan para ser requerido para llenar un contenedor. En caso de sustratos conocidos, la lista bin filtrada se compara con una lista de los productos de escisión proteolítica predecir a partir de la secuencia del péptido sustrato utilizando la herramienta ExPASy FindPept 17 ( <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) y un 200 ppm en masa error de tolerancia de aceptación. </li><li> MS / MS espectros se adquieren para todos los valores de masa de los productos de escisión predichos por la herramienta FindPept y para valores en intervalos que tienen 18 O-incorporaciones asociados con ellos. MS / MS datos se adquieren en el 4800 MALDI TOF / TOF Analizador 1kV en modo reflector de iones positivos, con una intensidad del láser fijo de 4200 y CID-gas en el modo de apagado. 50 disparos se adquieren en un patrón aleatorio por sub-espectro, hasta un total de 40 sub-espectros por punto (lo que da un total de 2.000 disparos / in situ). </li><li> MS / MS archivos de datos (. DT2 archivos) se exportan desde la Explo 4000 Seriesrer software de adquisición de datos e importados en nuestro propio sistema de información de laboratorio, se detectan los picos y MS / MS de las listas de pico están asociados con los correspondientes datos de MS agrupadas. </li><li> Para la identificación de péptidos, MS / MS listas de los picos se registraron en contra de la base de datos SwissProt utilizando el motor de búsqueda MASCOT con los siguientes parámetros de búsqueda: ninguna especificidad enzimática, 150 ppm de ion precursor y 0,2 Da tolerancias de iones de fragmentos de masa. </li><li> Péptido identificaciones, además, puede ser validada usando el software Data Explorer (AB SCIEX) confirmando las características 18 O-incorporación patrones a través de los fragmentos de iones y de la serie según lo descrito por Shevchenko et al. 18. </li></ol> C. Preparación del Tiempo espectral y 18 parcelas incorporación O- Diagramas espectrales de tiempo: MS archivos de datos (. DT2 archivos) para cada punto de tiempo de reacción se exportan desde el software del explorador de datos como ASCII-archivos usando unamacro e importados a un análisis de datos y el programa de software gráfico (por ejemplo, por OriginLab origen) y se muestran como gráficos de cascada (figura 3). 18 O-incorporación parcelas: Para cada producto de división del péptido binned, las contribuciones relativas de las distintas especies de péptidos de isótopos (16 O, 18 O 18 O 1 o 2) se extraen a través de todos los puntos de tiempo de reacción y en función del tiempo (Figura 4).

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	<li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters.">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li><li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids.">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li><li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange.">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li><li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies:+a+status+report.">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li><li>Miyagi, M., Rao, K. 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S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+"ZoomQuant&amp;quot.">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&amp;quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li><li>Qian, W. -. J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics.">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li><li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+method+for+computing+(18)O/(16)O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+(18)O+exchange/labeling.">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li><li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry.">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li><li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FindPept,+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification.">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+'de+novo'+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray,+isotopic+labeling+and+a+quadrupole/time-of-flight+mass+spectrometer.">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li><li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Mediante la combinación de etiquetado de isótopos estables y de alta resolución de la espectrometría de masas en una manera resuelta en el tiempo, el método de paleo-timecourse permite un análisis dinámico de la generación de productos peptídicos. El ensayo se puede utilizar para generar péptidos marcados con isótopos estables para estudios de proteómica cuantitativos y cualitativos, y para evaluar la cinética por el que los péptidos proteotípicos se generan. Además, paleo-timecourse está diseñado para...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> PepClean C-18 spin columnas </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI tablilla de puntería </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Materiales <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Alfa ciano-4-hidroxicinámico </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Yodoacetamida (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Conversión de la endotelina enzima-1 (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Tripsina Oro </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Water-18 O, 97% atómico 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Se añadió ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Normas Kit Misa para la calibración de AB Sciex TOF / TOF instrumentos </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

Los isótopos estables son herramientas esenciales en la espectrometría de masa biológica. Históricamente, 18 O-isótopos estables se han utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos catalíticos de enzimas proteolíticas 1-3. Con el advenimiento de la espectrometría de masas basado proteómica, la incorporación catalizada enzimáticamente de 18 átomos de O de agua estable enriquecido isotópicamente se ha convertido en un método popular para comparar cuantitativamente los niveles de expresión de proteína (revisado por Fenselau y Yao 4, Miyagi y Rao 5 y Ye et al. 6). 18 O-etiquetado constituye una alternativa simple y de bajo costo a los productos químicos (por ejemplo, iTRAQ, ICAT) y metabólicos (por ejemplo SILAC) técnicas de marcado 7. Dependiendo de la proteasa utilizada, 18 O-etiquetado puede dar lugar a la incorporación de hasta dos 18 átomos de O en el grupo carboxilo C-terminal del producto de escisión 3 </sup&gt;. La reacción de marcaje se puede subdividir en dos procesos independientes, la escisión del enlace peptídico y la reacción de oxígeno intercambio carboxilo 8. En nuestro Paleo (p rotease-a e l Abeling ssisted mploying 18 O agua enriquecida) la adaptación enzimática de 18 O-etiquetado, se utilizó 50% 18 O enriquecida con agua para producir firmas isotópicas distintivas. En combinación con la alta resolución de láser asistida por matriz de ionización de desorción tiempo de vuelo espectrometría de masas tándem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), los sobres de isótopos característicos se puede utilizar para identificar los productos de escisión con un alto nivel de especificidad. Anteriormente ha utilizado el paleo-metodología para detectar y caracterizar proteasas endógenas 9 y controlar las reacciones proteolíticas 10-11. Desde Paleo codifica la esencia misma de la reacción de escisión proteolítica, el montaje experimental es enri sencillo y bioquímicospasos chment de productos de escisión se puede evitar. El paleo-método se puede extender fácilmente a (i) experimentos de tiempo de los cursos que controlan la dinámica de las reacciones de escisión proteolítica y (ii) el análisis de la proteólisis en muestras biológicas complejas que representan las condiciones fisiológicas. Paleo-timecourse experimentos ayudan a identificar limitación de la velocidad de procesamiento y pasos intermedios de reacción en situaciones complejas de reacciones proteolíticas vía. Además, el paleo-reacción nos permite identificar las enzimas proteolíticas tales como la tripsina proteasa de serina que es capaz de volver a enlazar sus productos de escisión y catalizar la incorporación de un segundo átomo de O 18. Tales &quot;doble etiquetado&quot; enzimas se pueden utilizar para postdigestion 18 O-etiquetado, en la que los péptidos están etiquetados exclusivamente por la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo. Nuestra tercera estrategia se extiende etiquetado empleando 18 O agua enriquecida más allá de las enzimas y utiliza las condiciones ácidas de pH para introducir 18 O-isótopo estable signoturas en péptidos.

Se utilizó el flujo de trabajo de paleo-timecourse para controlar dinámicamente la incorporación de 18 O-isótopos estables en productos de división de péptidos generados por las enzimas proteolíticas. El enfoque que se presenta es una herramienta versátil para estudiar comparativamente las vías proteolíticas procesamiento de sustrato diferente y combinaciones de la proteasa. Mediante el muestreo de reacciones proteolíticas repetidamente en el transcurso de la reacción, el experimento paleo-timecou...

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Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Estables flujos de trabajo que emplean isótopos de etiquetado<sup&gt; 18</sup&gt; O-agua enriquecida (Leo-flujos de trabajo) son herramientas versátiles para estudios de proteómica cuantitativa y cualitativa. En los flujos de trabajo asistidas proteasa-(paleo),<sup&gt; 18</sup&gt; Átomos de O son introducidos por la escisión proteolítica y carboxilo reacciones de intercambio de oxígeno mediada por proteasas. En el catalizada por ácido (Aleo) flujo de trabajo,<sup&gt; 18</sup&gt; Átomos de O son introducidos por intercambio de oxígeno carboxilo a pH bajo.

Proteasa y el ácido catalizado-Flujos de trabajo de rotulación Emplear<sup&gt; 18</sup&gt; O-agua enriquecida

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

11.9K vistas.  Boston Biomedical Research Institute. Estables flujos de trabajo que emplean isótopos de etiquetado 18 O-agua enriquecida (Leo-flujos de trabajo) son herramientas versátiles para estudios de proteómica cuantitativa y cualitativa. En los flujos de trabajo asistidas proteasa-(paleo), 18 Átomos de O son introducidos por la escisión proteolítica y carboxilo reacciones de intercambio de oxígeno mediada por proteasas. En el catalizada por ácido (Aleo) flujo de trabajo,

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Investigación

Biología

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

Agua Morris laberinto Experimento

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases, which is what we do during our quality control procedures. In this assay, casein acts as a substrate. When the protease we are testing digests casein, the amino acid tyrosine is liberated along with other amino acids and peptide fragments. Folin and Ciocalteus Phenol, or Folin's reagent primarily reacts with free tyrosine to produce a blue colored chromophore, which is quantifiable and measured as an absorbance value on the spectrophotometer. The more tyrosine that is released from casein, the more the chromophores are generated and the stronger the activity of the protease. Absorbance values generated by the activity of the protease are compared to a standard curve, which is generated by reacting known quantities of tyrosine with the F-C reagent to correlate changes in absorbance with the amount of tyrosine in micromoles. From the standard curve the activity of protease samples can be determined in terms of Units, which is the amount in micromoles of tyrosine equivalents released from casein per minute.
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Sigma&#039;s Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases.

No específico de Sigma Ensayo de actividad de la proteasa - La caseína como sustrato

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Marcaje fluorescente de Drosophila Estructuras del Corazón

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

El uso del kit de la proteasa detección fluorescente para determinar la actividad de la proteasa

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

GC-basado en la detección de ácido Aldononitrile acetato derivado de glucosamina y murámico de la determinación de residuos microbiana en el suelo

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Flujos de trabajo TEM, análisis de resultados y gestión de datos mediante un enfoque de visión artificial

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate thousands of images with numerous parameters that require time-consuming and complicated analysis. AXON synchronicity is a machine-vision synchronization (MVS) software solution designed to address the pain points inherent to TEM studies. Once installed on the microscope, it enables the continuous synchronization of images and metadata generated by the microscope, detector, and in situ systems during an experiment. This connectivity enables the application of machine-vision algorithms that apply a combination of spatial, beam, and digital corrections to center and track a region of interest within the field of view and provide immediate image stabilization. In addition to the substantial improvement in resolution afforded by such stabilization, metadata synchronization enables the application of computational and image analysis algorithms that calculate&#8239;variables between images. This calculated metadata can be used to analyze trends or identify key areas of interest within a dataset, leading to new insights and the development of more sophisticated machine-vision capabilities in the future. One such module that builds on this calculated metadata is dose calibration and management. The dose module provides state-of-the-art calibration, tracking, and management of both the electron fluence (e-/&#197;2&#183;s-1) and cumulative dose (e-/&#197;2) that is delivered to specific areas of the sample on a pixel-by-pixel basis. This enables a comprehensive overview of the interaction between the electron beam and the sample. Experiment analysis is streamlined through a dedicated analysis software in which datasets consisting of images and corresponding metadata are easily visualized, sorted, filtered, and exported. Combined, these tools facilitate efficient collaborations and experimental analysis, encourage data mining and enhance the microscopy experience.

Autor destacado: Un enfoque de visión artificial para los flujos de trabajo de microscopía electrónica de transmisión, el análisis de resultados y la gestión de datos  

Here, we present a protocol to utilize machine-vision software to stabilize dynamic processes during TEM imaging, while concurrently indexing multiple streams of metadata to each image into a navigable timeline. We demonstrate how this platform enables automated calibration and mapping of the electron dose over the course of an experiment.