Este trabajo fue apoyado ya CIRM beca predoctoral (EDK), Premio Joven Investigador NARSAD (DK) y el premio NIMH CEREBROS (R01MH087495) (DK).

Anestesia y analgesia: Treinta minutos antes de la anestesia, inyectar a la rata con 0,05 mg de buprenorfina / kg por vía subcutánea para la analgesia. Iniciar la anestesia con 30-40 mg / kg de sodio pentobarbital intraperitoneal. En este punto, también se inyecta atropina para prevenir la insuficiencia respiratoria (0,4 mg / kg, por vía subcutánea) y meloxicam como analgésico adicional (2 mg / kg por vía subcutánea). Si después de 5 minutos, la rata es todavía móvil o sensible a pellizco dedo del pie, administrar dosis posteriores de pentobarbital sódico a 5 mg / kg (intraperitoneal) hasta que la rata es insensible al dolor. Antes de realizar la incisión primero, inyectar lidocaína (5 mg / kg, intradérmica) en el sitio de la incisión para la anestesia local. Seis a ocho horas después de la inyección inicial, inyectar la rata con 0,05 mg de buprenorfina / kg por vía subcutánea para analgesia. La buprenorfina se puede inyectar a partir de entonces cada 6-8 horas si es necesario, aunque esto no suele ser necesario. Es importante señalar que otras formas de anestesia cun interferir con lesiones excitotóxicos. Por ejemplo, aunque la ketamina es una forma comúnmente utilizada de la anestesia en roedores, puede interferir con las lesiones inducidas con NMDA debido a que es un antagonista del receptor NMDA. Es importante seleccionar un método de anestesia que induce que no reduce tamaño de la lesión. Si la anestesia de gas que se desea, la mayoría de dispositivos estereotáxicas, incluyendo los descritos aquí pueden adaptarse a los adaptadores de la careta antigás. Nota: Los materiales se describen con más detalle en la Tabla de los reactivos específicos y equipos de abajo. 1. Preparación de la bomba y Stereotax <ol><li> Llene una jeringa de 10 l Hamilton con agua estéril y montarlo en el carro de una bomba de jeringa de 6 programable. Fijar el extremo del émbolo de la jeringa en el soporte fijada en la bomba. </li><li> Prellenado de gas esterilizada PE20 tubo con agua estéril con una aguja y una jeringa de 1 ml. Deslice el extremo abierto del tubo a la jeringa Hamilton, siendo la atenciónútil para evitar la creación de burbujas de aire en el tubo. </li><li> Sujetar la 30ga, plano de corte, el extremo infusión aguja 1 pulgada de la tubería en el brazo de un dispositivo estereotáxico utilizando un manipulador electrodo barril de estilo. Insertar la aguja de infusión entre la abrazadera y el barril acanalado. Fijar la abrazadera sobre un trozo de tubo que contiene la aguja de metal dentro de ella para evitar el aplanamiento de la tubería y restringir el flujo de fluido. </li><li> Ajustar la velocidad de la bomba de&gt; 5 l / min y encienda la bomba. Una gota de agua debe aparecer en la punta de la aguja de infusión. Compruebe la longitud de la tubería y sus juntas para asegurarse de que no haya fugas. </li><li> Limpie el agua de perlas con un hisopo estéril y ajuste la bomba a retirarse. Retirar una burbuja de aire 2 l. La parte superior de la burbuja debe ser visible en el tubo. </li><li> Sumergir la punta de la aguja de infusión en una disolución de 20 mg / ml de NMDA en estéril 0,1 M PBS y retirar l 4-5. Una burbuja de aire debe ser visible entre el agua estéril y la solución de NMDAen la punta. Es importante señalar que NMDA es una neurotoxina potente y se debe tener cuidado en la preparación y manipulación de esta solución. Los guantes y protección para los ojos se les aconseja en todo momento. </li></ol> 2. Montar la Rata en el dispositivo de estereotaxia <ol><li> La Figura 1 muestra las partes básicas del dispositivo estereotáxico. Después de afeitarse la cabeza de la rata de la línea de los ojos a las orejas, cargue dientes de las ratas en la barra de bocado, con el cuerpo de la rata que descansa sobre una almohadilla térmica en el medio. La lengua debe pasar por debajo de la barra de mordida, con la mandíbula inferior. Si es posible, una retroalimentación de temperatura almohadilla eléctrica sería preferible. Control de la temperatura rectal también sería ideal. </li><li> Sosteniendo el cuello de la rata con el pulgar y el dedo índice, mueva el canal de la oreja derecha de la barra horizontal en la oreja derecha. La barra debe sentir que está descansando en un lugar sólido, no como ahora que se hunde en la cabeza. Manteniendo el lado derecho de la cabeza firme, deslizar la oreja izquierdabar en el canal de la oreja izquierda horizontal de la rata. Se debe sentir como si estuviera descansando en un lugar sólido. El pabellón auricular debería ser simétrica y que parecen estar apoyados en las barras de los oídos. Hacia arriba la quema de pinnas indica la colocación inadecuada de las barras de los oídos. La cabeza no debe oscilar en respuesta a la presión en el cuello. </li><li> Atornillar la barra de la nariz. Sé amable. Los huesos de la nariz es delicado y la barra de la nariz no tiene por qué ser apretado. Compruebe que la rata aún está anestesiado antes de proceder. </li></ol> 3. Preparación de la Rata de Cirugía <ol><li> El uso de un hisopo estéril, coloque suavemente una pequeña cantidad de ungüento oftálmico veterinario lubricante en cada uno de los ojos de las ratas para protegerlos de la desecación y los escombros. </li><li> Concéntricamente desde el sitio de la incisión prevista para el borde de la región afeitado, limpie el cuero cabelludo de la rata con una solución de clorhexidina al 2% seguido de etanol al 70% tres veces. Matorrales clorhexidina también puede ser utilizado si desinfectante más eficaz que se desea.Para terminar, limpiar con una solución de povidona yodada al 10%. El cuero cabelludo está ahora preparado estéril y sólo se debe tocar con los materiales estériles. </li><li> Don guantes estériles para que continúe, porque lo próximo en hacer frente a la zona quirúrgica preparada. </li><li> Colocar un campo estéril de manera que la fenestración expone el sitio quirúrgico. </li></ol> 4. Creación de la ventana quirúrgica <ol><li> Utilizando una cuchilla # 10 escalpelo, hacer una incisión (aproximadamente 2 cm de longitud) a lo largo de la línea media longitudinal del cuero cabelludo. La incisión debe comenzar por detrás de la línea de los ojos. Con el pulgar y el dedo índice de la mano no dominante, sostenga el cuero cabelludo en la tracción perpendicular a la dirección de la incisión. </li><li> Tirar de la fascia que recubre la superficie del cráneo a los bordes de la zona quirúrgica utilizando estériles de algodón puntas. Tomará un poco de fuerza para despejar el cráneo, por lo que se puede ver. </li><li> Utilice cuatro pinzas hemostáticas curvas, estériles para crear una ventana quirúrgica. Fascia abrazadera (no la piel) en EACH lado de las caras anterior y posterior de la incisión y luego poner las abrazaderas junto al animal, con lo que tirando de la incisión abierta y totalmente exponiendo el cráneo. </li></ol> 5. Nivelación de la Calavera y crear el agujero piloto <ol><li> Localizar bregma, el punto anterior donde las tres placas principales del cráneo se encuentran, como se ilustra en la Figura 2. Mueva la aguja de infusión por lo que la punta de la aguja apenas toque el cráneo en el bregma. Tenga en cuenta el dorsal-ventral de coordenadas. La Figura 3 muestra cómo leer las coordenadas en un dispositivo estereotáxico Stoelting. Nota, en este punto, los guantes ya no son estériles y no debe tocar el área de cirugía estéril directamente. Nota: Después de tocar el dispositivo estereotáxico no estéril, el cirujano ya no es estéril y no debe tocar el sitio de la cirugía o las partes del equipo que va a tocar el sitio quirúrgico. </li><li> Busque lambda, el punto posterior, donde los tres platos principales del cráneo se encuentran, como depicted en la Figura 2. Levante la aguja de infusión y moverlo ligeramente hacia atrás a lambda. Baje la aguja hasta que toque el cráneo, en lambda. Leer la coordenada dorsal-ventral. Si el cráneo es nivel, será dentro de 0,1 mm de la lectura bregma. Si es más lejos que esto, mover la aguja hacia arriba (fuera del camino), afloje la barra de la nariz, ya sea subir o bajar la plataforma de barra de bocado, dependiendo de la final de la cabeza es demasiado alto, y luego volver a medir. </li><li> Mueva la aguja de infusión en bregma y registrar las coordenadas antero-posterior y medial-lateral. Calcular donde la aguja debe ser movido sobre la base de las coordenadas del área cerebral de interés de acuerdo con un atlas cerebral 12. Para el BLA, restar 2,8 mm a partir de la coordenada antero-posterior y, o bien sumar o restar 5,1 mm a / desde la coordenada medio-lateral en función de si desea orientar la campaña a la izquierda oa la derecha. Mueva la aguja de infusión a la posición calculada. </li><li> Gire la needle fuera del camino, teniendo cuidado de no perder de vista donde se encontraba y luego perfore un agujero de aproximadamente 2 mm de diámetro en ese lugar con una moto-herramienta de Dremel con una broca dental estéril adjunta. Taladre cuidadosamente como cuando la perforación se rompe a través del cráneo, se tienden a tirar hacia abajo, dañando posiblemente la duramadre y el tejido cerebral por debajo. Escariar el agujero para verla en grande. </li><li> Absorber la sangre con un hisopo de algodón estéril. </li></ol> 6. La infusión de la neurotoxina <ol><li> Gire la aguja de nuevo en su posición. Baje la aguja hasta que toque la superficie del cerebro. Graba la coordenada dorsal-ventral. Este es el nivel de la duramadre. Reste el valor apropiado para llegar a la región del cerebro de su interés. Para la amígdala basolateral, restar 6,7 mm. </li><li> Baje la aguja de infusión para el nivel calculado lentamente. Luego se levantaría nuevamente, muy por encima del cráneo. Utilizar una jeringa Hamilton de alambre de limpieza para desatascar la punta de la aguja de infusión, teniendo cuidado de no touch el extremo del alambre que entra en contacto con la aguja de infusión con guantes no estériles. </li><li> Haga funcionar la bomba a&gt; 5 ml / min y asegúrese de ver una gota de líquido sale de la aguja de infusión. Si no es así, destapar con el cable y vuelva a intentarlo. </li><li> Baje la aguja de perfusión a la que desee dorsal / ventral nivel lentamente. </li><li> Establezca la velocidad de la bomba de infusión a 0,1 l / min y iniciar la infusión. Infundir durante 2 min. </li><li> Una vez que la infusión se ha iniciado, marcar los dos extremos de la burbuja de aire en el tubo con un marcador negro. Si ambos extremos no se mueven, que la aguja está obstruido. Detener la infusión, levantar la aguja, destapar con el cable, verifique que el flujo con un caudal alto, volver a bajar la aguja y vuelva a intentarlo. </li><li> Una vez que la infusión es completo, detenga la bomba y esperar 5 minutos para el NMDA para difundir lejos de la punta de la aguja. </li><li> Levante la aguja de 0,5 mm, e infundir de nuevo durante 1 min. Esperar 2,5 min para el NMDA a difundirse fuera de la punta de aguja. Esta infusión extra queLPS asegurar todo el BLA está cubierto por la infusión. Si esto es necesario para otras regiones del cerebro debe determinarse experimentalmente. </li><li> Elevar la aguja fuera del cerebro lentamente y gire el brazo estereotáxica fuera del camino. </li></ol> 7. Cierre de la incisión <ol><li> Don nuevos guantes estériles para cerrar la incisión. </li><li> Limpie cualquier exceso de sangre en el cráneo con las puntas de algodón estériles y quitar las abrazaderas de la fascia. </li><li> Con unas pinzas de Londres, empujar a los dos lados de la incisión juntos. Los bordes interiores de la piel debe cumplir y el borde exterior de la piel no se debe permitir que se enroscan en la incisión. Mientras presiona se cierra la incisión, se aplican los clips de la herida para cerrar la protuberancia con firmeza. Continuar para empujar la piel juntos y grapas a lo largo de la longitud de la incisión. Esto generalmente toma 3-5 clips de la herida. </li><li> Después de colocar todos los clips de la herida, utilice las pinzas para apretar las grapas de nuevo, asegurándose de que son seguros. El t más seguroque los clips, es menos probable que una rata se los saque antes de que la herida ha sanado. </li><li> Limpie la incisión con grapas con una solución de povidona yodada al 10% y volver a la rata a su jaula y el monitor hasta que se restablezca la movilidad (generalmente 1-2 horas después de la anestesia, el tiempo quirúrgico total de la inducción al cierre de estar 30-45 minutos). En este punto, la rata puede ser devuelto a la sala de colonia. Después de una semana, quite las grapas con una herramienta removedor de grapas bajo anestesia con isoflurano. </li><li> Use un esterilizador de cuentas en caliente para esterilizar las superficies de punta de todos los instrumentos antes de su uso en la rata que viene. Los instrumentos deben ser sumergidos en las cuentas por no más de 15 segundos, o pueden llegar a ser demasiado caliente para manejar. Los instrumentos deben ser completamente fría antes de utilizarse en otro animal. </li></ol> 8. Recuperación <ol><li> Es posible que las ratas se muestran actividad de ataques en los días posteriores a la lesión. Dependiendo de la región del cerebro comportamientos dañados, tales como el consumo de alimentos o GROoming puede verse afectada. Es importante que los animales ser controlados sobre una base diaria para asegurar que permanezcan sanos durante la recuperación. La atención de apoyo, tales como alimentos líquidos, alimentos ricos en calorías, o analgesia adicional puede ser requerida. La mortalidad debida a la anestesia se produce en un bajo porcentaje de ratas, por lo general menos de 5%. La mortalidad debida a otras causas (infección, hemorragia) es extremadamente rara. Todos los signos de sufrimiento después de la recuperación de la anestesia puede ser causa de exclusión de los estudios futuros, pero son extremadamente raros. La figura 4 muestra la pérdida de peso durante los primeros días después de la cirugía, ya que se debe esperar. El peso corporal debe recuperarse dentro de 1 semana. </li></ol> 9. Los resultados representativos Una semana o más después de la infusión de NMDA, la lesión puede ser visualizado usando un colorante de contraste cresil violeta y microscopía de campo claro. Los cerebros se perfundieron con hielo frío paraformaldehído al 4%, equilibrada en 30% de sacarosa 0,1 M en PBS y Frozen. A continuación, debe ser cortado en lonchas en 30-60 micras, en una serie de 1:6 a 1:12 y están montados en portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina antes de someterse a un estándar de contraste violeta de cresilo. La lesión debe corresponder a una &quot;calva&quot; o un área de color violeta disminución de cresilo manchas debido a la muerte celular tras la lesión. Figuras 5A y B muestran una lesión representante de la BLA y CEA. Esta imagen fue obtenida usando un escáner de superficie plana con una alta resolución de escaneo (1200 dpi). Para visualizar la lesión, que ayuda a contratinción una serie de secciones a través de la mayor parte del tejido que rodea el área de destino para una lesión fuera de lugar puede ser localizado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig1.jpg" /> Figura 1. Configuración estereotáxica. Esta figura muestra el estereotáxica en ratas con las partes pertinentes etiquetados. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig2.jpg" /> Figura 2. Bregma y lambda en el SKU de ratall. Esta ilustración muestra las localizaciones de bregma y lambda. Todas las coordenadas se miden en relación a bregma. Lambda se utiliza para asegurar que el cráneo está nivelada. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig3.jpg" /> Figura 3. Lectura de las coordenadas estereotáxicas. Este dibujo representa una lectura estereotáxica estándar. Para obtener los dígitos a la izquierda del punto decimal, utilizar los marcadores en el lado derecho. El dígito de la etiqueta se corresponde con el lugar de las decenas (por ejemplo, 1 = 10, 2 = 20). Las marcas de control entre los dígitos marcados corresponden a las unidades individuales (1-9). La línea de cero indica a que el número entero stereotax se establece. Aquí, la línea de cero es entre el 10 y 11 marcadores, lo que indica que el valor está entre 10 y 11. Para determinar los números a la derecha de la coma decimal, utilice los marcadores en el lado izquierdo. Las marcas de control de la izquierda están numerados del 0 al 10, con cada uno de hash sin etiqueta que representa una diferencia de unidad deaquellos junto a él. Cualquiera de las marcas de control en las líneas de la izquierda mejor hasta con las marcas de control de la derecha indica el primer decimal de la lectura de coordenadas. En este caso, la marca de hash en el izquierdo correspondiente al número 9 líneas arriba con la mejor de las marcas de control del lado derecho por lo que la cifra decimal es 9. La lectura final es de 10,9 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig4.jpg" /> Figura 4. El cambio de peso después de la cirugía. Este gráfico muestra la media (± SEM) de peso de las ratas que se sometieron a la cirugía estereotáxica (n = 17) o no someterse a cirugía (n = 6). El día 0 es el día de la cirugía. Después de la cirugía, el peso de las ratas disminuyó durante 2-3 días después de la cirugía y luego se incrementó alrededor de 5-6 días. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig5.jpg" /> Figura 5. Ejemplo de lesión excitotóxica. A) Esta imagen muestra una violeta de cresilo contratinción sobre una rebanada 30 m coronal con el calvo &quot;in situ &quot;de la lesión de NMDA de la amígdala basolateral. Las flechas blancas delinear la lesión. Se puede comparar con el lado contralateral de la corte de cerebro que no tiene ninguna lesión. B) Una lesión similar de la central de la amígdala núcleo.

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No hay conflictos de interés declarado.

El método que aquí se presenta estereotáxica permite la lesión excitotóxica de áreas específicas del cerebro a través de la infusión de NMDA. Los métodos estereotáxicas básicos pueden ser adaptados para infundir una variedad de agentes farmacológicos y biológicos de una manera específica del sitio. También puede ser adaptado para apuntar a una variedad de áreas del cerebro, que se define por sus coordenadas estereotáxicas en un atlas cerebral 12. La adaptación a otras especies tales como ra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> N-metil-D-aspártico Acido 98% </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32919-0500 </td><td></td></tr><tr><td> Doble estándar de laboratorio estereotáxica w/45 grados. Bares del oído </td><td> Stoelting </td><td> 51653 </td><td> Alternativa proveedor: Kopf * nota de precaución: asegurar la compatibilidad de los accesorios estereotáxicas si la compra de varios proveedores </td></tr><tr><td> 10ul SYR ESPECIAL (* / * / *) </td><td> Hamilton </td><td> 701SN </td><td></td></tr><tr><td> Dremel Moto-Tool </td><td> Stoelting </td><td> 58600 </td><td> Alternativa proveedor: Kopf </td></tr><tr><td> Fresas de metal duro, pieza de mano de HP, tamaño 2 </td><td> Schein Dental </td><td> 2284578 </td><td></td></tr><tr><td> Stoelting 6 Programa de JeringaLa bomba programable </td><td> Stoelting </td><td> 53140 </td><td> Alternativa proveedor: Kopf </td></tr><tr><td> Tubos de acero inoxidable 316 hipodérmica pared regular calibre 30 .0123 &quot;OD x .00625&quot; x 0.003 &quot;de la pared (aguja de infusión) </td><td> Piezas pequeñas </td><td> HTXX-30R-06-05 </td><td></td></tr><tr><td> Intramedic PE 20 tubos (tubo de infusión) </td><td> VWR </td><td> 63019-025 </td><td></td></tr><tr><td> Clips Reflex, 9 mm, no estéril </td><td> Kent Scientific Corp. </td><td> INS500346 </td><td> Alternativa proveedor: Herramientas de Bellas Ciencia </td></tr><tr><td> Aplicador de clips Reflex para los clips de 9mm </td><td> Kent Scientific Corp. </td><td> 12031-09 </td><td> Alternativa proveedor: Herramientas de Bellas Ciencia </td></tr><tr><td> Curva pinza hemostática Hartman </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 13003-10 </td><td></td></tr><tr><td> Londres pinza </td><td> Herramientas de Bellas Sceince </td><td> 11080-02 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 2% de clorhexidina solución </td><td> Allivet </td><td> 30159 </td><td> Alternativa proveedor: PetSolutions </td></tr><tr><td> 10% de povidona solución de yodo </td><td> CVS </td><td> SKU # 739575 </td><td></td></tr><tr><td> Hot cordón esterilizador </td><td> Aparato de Harvard </td><td> 610183 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tabla de reactivos y equipos específicos.

stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat

Muchas de las funciones de comportamiento en los mamíferos, incluyendo roedores y seres humanos, están mediadas principalmente por las regiones cerebrales discretas. Un método común para discernir la función de diversas regiones del cerebro de comportamiento u otros resultados experimentales es la implementación de una ablación localizada de la función. En los seres humanos, las poblaciones de pacientes con lesiones cerebrales localizadas se estudian a menudo los déficits, con la esperanza de revelar la función subyacente de la zona dañada. En los roedores, uno experimental puede provocar lesiones de regiones específicas del cerebro. Lesión se puede lograr de varias maneras. Lesiones electrolíticas pueden causar daños localizados pero dañará una variedad de tipos de células, así como fibras que atraviesan de otras regiones del cerebro que pasan a estar cerca del sitio de la lesión. Inducible utilizando técnicas de genética de células de tipo promotores específicos también puede permitir que el sitio específico de la orientación. Estas técnicas son complejas y no siempre prácticos, dependiendo del área cerebral de destino. Excitotlesión óxico usando cirugía estereotáxica, por el contrario, es uno de los métodos más fiables y prácticos de lesioning neuronas excitadoras sin dañar las células gliales locales o atravesando las fibras. Aquí, se presenta un protocolo para la infusión estereotáxica de la excitotoxina, N-metil-D-aspartato (NMDA), en el complejo basolateral amígdala. Utilizando indicaciones anatómicas, aplicamos las coordenadas estereotáxicas para determinar la ubicación de nuestra región del cerebro de destino y bajar una aguja de inyección en el lugar justo encima de la meta. A continuación, infundir nuestro excitotoxina en el cerebro, resultando en la muerte excitotóxica de neuronas cercanas. Si bien nuestro sujeto experimental de elección es una rata, los mismos métodos se pueden aplicar a otros mamíferos, con los ajustes apropiados en el equipo y las coordenadas. Este método se puede utilizar en una variedad de regiones del cerebro, incluyendo la amígdala basolateral 1-6, otro núcleos amígdala 6, 7, 8 hipocampo, entorhinal 9 y la corteza prefrontal 10. También se puede utilizar para infundir compuestos biológicos tales como vectores virales 1, 11. La técnica estereotáxica básico podría adaptarse también para la implantación de más bombas osmóticas permanentes, permitiendo la exposición más prolongada a un compuesto de interés.

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Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

La ablación selectiva de la región específica del cerebro (s) mediante la infusión de una excitotoxina utilizando las coordenadas estereotáxicas se describe. Esta técnica también se podría adaptar para la infusión de otros productos químicos en el cerebro de rata.

La cirugía estereotáxica para la lesión excitotóxica de áreas específicas del cerebro en la rata adulta

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.2K vistas.  University of California Berkeley. La ablación selectiva de la región específica del cerebro (s) mediante la infusión de una excitotoxina utilizando las coordenadas estereotáxicas se describe. Esta técnica también se podría adaptar para la infusión de otros productos químicos en el cerebro de rata.

Video: Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Cirugía estereotáctica de roedores y mejoras del bienestar de los animales de resultados para la revista Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Investigación

Neurociencias

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación o inyección estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Evaluación de la inducción a largo plazo de la depresión en rodajas de cerebelosores adultos

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the neurosciences. Phylogenetically, these animals are much closer to humans than rodents. They also display complex behaviors, including a wide range of vocalizations and social interactions. Here, an effective stereotaxic neurosurgical procedure for implantation of recording electrode arrays in the common marmoset is described. This protocol also details the pre- and postoperative steps of animal care that are required to successfully perform such a surgery. Finally, this protocol shows an example of local field potential and spike activity recordings in a freely behaving marmoset 1 week after the surgical procedure. Overall, this method provides an opportunity to study the brain function in awake and freely behaving marmosets. The same protocol can be readily used by researchers working with other small primates. In addition, it can be easily modified to allow other studies requiring implants, such as stimulating electrodes, microinjections, implantation of optrodes or guide cannulas, or ablation of discrete tissue regions.

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

This work presents a protocol to perform a stereotaxic, neurosurgical implantation of&#160;microelectrode arrays in the common marmoset. This method specifically enables electrophysiological recordings in freely behaving animals but can be easily adapted to any other similar neurosurgical intervention in this species (e.g., cannula for drug administration or electrodes for brain stimulation).