1. Preparación de los platos <ol><li> Los platos utilizados para el cultivo rebanada son de vidrio de fondo (con un cubreobjetos como la base) (platos Willco). Estos se colocan en el tejido objetivo en un plato de cultivo de tejidos de 6 cm para mantener el fondo de vidrio limpio. </li><li> En el día antes del experimento, se añaden 2 ml de 0,1% de poli-L-lisina solución al plato de vidrio de fondo y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir que el de poli-L-lisina cubrir el fondo de vidrio. </li><li> Quitar poli-L-lisina solución y enjuagar tres veces en agua desionizada, y luego una vez en 70% de etanol. </li><li> Dejar secar durante la noche. Los platos también puede ser secado mediante calentamiento suave en un horno de microondas a baja potencia durante 30-45 segundos. </li></ol> 2. La electroporación de embriones <ol><li> Incubar los huevos a 37 ° C a Hamburger-Hamilton (HH) la etapa 10 (~ 36 horas) (o de otra etapa se desea). </li><li> Antes de comenzar la preparación agujas de vidrio (se utiliza un Flaming / el modelo de Brown p87 extractor microcapilar) y romper la punta de la Needle con una pinza fina bajo un microscopio de disección. El extremo de la aguja debe ser lo suficientemente afilada para perforar el embrión si bien no es tan estrecho que impide la inyección de la solución de ADN. </li><li> Huevos de ventana y electrodos lugar (5 mm de separación) a cada lado del embrión </li><li> Inyectar ADN (~ 0,025 a 0,5 mg / l en agua desionizada coloreada con una pequeña cantidad de verde rápido) en el tubo neural. </li><li> Aplique corriente - 17.12 V tres veces, la longitud de pulso de 50 ms a 950 ms entre pulsos. </li><li> Usamos bajas concentraciones de ADN y los voltajes bajos de electroporación para lograr la expresión del mosaico de modo que puede seguir las células individuales. </li><li> Cubra ventana en la cáscara del huevo con cellotape y asegúrese de que está sellado. </li><li> Permita que los embriones para recuperar durante 3-4 horas o toda la noche a 37 ° C. </li></ol> 3. El colágeno y la rebanada preparación Cultura Medio <ol><li> Prepare la mezcla de colágeno y la rebanada de medio de cultivo alrededor de una hora antes de rebanar. </li><li> Para 300 t lipo de un colágeno añadir 100 ml de solución al 0,1% de ácido acético y 100 l 5 x L15. Mezclar bien después de cada adición. La solución debe tornarse amarilla. </li><li> Ahora agregue 15-20 l de bicarbonato de sodio al 7,5% y mezclar bien. La solución debe ser ligeramente rosa, y el volumen de bicarbonato de sodio requerida para este puede variar. Mantenga en hielo y se forman de nuevo cada vez. </li><li> A 10 ml de medio neurobasal añadir B-27 y suplemento Glutamax, a una concentración de 1 x 10 solución final y gentamicina l. </li><li> Colocar en medio de una incubadora a 37 ° C tamponada con un 5% de CO 2. Dejar la parte superior del contenedor suelta para permitir que se equilibre con el CO 2. </li></ol> 4. Slice Cultura <ol><li> Eliminar embriones de huevo y se lava en medio L15. </li><li> Colocar en un plato de cultivo de tejidos con una capa de Sylgard en la parte inferior y el pin a través de los alrededores de extraembrionarios membranas de manera que se tensa. </li><li> El uso de un micrófonoroknife, embrión de corte lo más recto posible a través de la región de interés. Para la médula espinal, lonchas han de ser entre 1-2 somitas de espesor. Agregar las rebanadas unidas al embrión, mientras que se mire otros embriones para que no perderlos. </li><li> Preparar una punta de micropipeta 200 l cortando aproximadamente 1 mm de la punta y colocar esto a un P2 o P10. Esta punta se utiliza para transferir las rebanadas de la médula espinal a la placa inferior de vidrio. Una propina de 10 l no es lo suficientemente amplio como para recoger las rebanadas. </li><li> Cubra el interior de la punta con el colágeno con la pipeta una mezcla de colágeno l preparado con anterioridad. Dejar reposar 1-2 minutos y luego enjuague con medio L15. Esto evitará que el tejido se adhiera a la parte interior de la punta. </li><li> Separar sector a partir de embriones utilizando un microknife y retirar de la cápsula, utilizando un P2 o P10 equipada con una punta de 200 l, y pone a 1 l. Trate de tomar como medio lo menos posible. </li><li> Vortex la mezcla de colágeno y caída de 5-8 l de esto en el plato revestido de poli-l-lisina. </li><li> Immediatamente puesto rebanada de embrión en el colágeno y la posición en el lugar con un par de pinzas finas. Las rebanadas deben colocarse de modo que la cara que se visualiza está a ras con el cubreobjetos. El tejido debe adherirse a la capa de poli-l-lisina en el cubreobjetos. </li><li> Repita esto hasta que tenga varios cortes en el cubreobjetos. Por lo general, se puede colocar 6-9 rebanadas en un plato. </li><li> Una vez que todas las rebanadas están en su lugar, cubrir el plato y permitir que el colágeno para establecer durante 20 minutos. Algunos de los primeros colágeno puesto que ya puede haber comenzado a secarse. Para evitar esto añadir una pequeña cantidad de L15 a éstos antes de cubrir. </li><li> Una vez configurado, añadir con cuidado medio de la cultura 2ml sector que ha sido equilibrada en el 5% de CO 2 a 37 ° C durante al menos una hora. Se debe tener cuidado de no desconectar el colágeno de la cubreobjetos. </li><li> Colocar en un 37 ° / 5% de CO 2 incubadora y permitir rebanadas para recuperar por lo menos 3 horas antes de imágenes. Si no hay humedad, plato lugar en una caja de plexiglás ingenioha poco de pañuelo de papel humedecido en una esquina. </li></ol> 5. Rebanadas de imágenes de embriones <ol><li> Nosotros utilizamos un procesador Core DeltaVision de campo amplio microscopio equipado con una cámara de WeatherStation ambiental a sectores de la imagen. La cámara se mantiene constantemente a 37 ° C, con un aparato de perfusión de CO 2 para mantener la platina del microscopio a 5% de CO 2/95% aire. </li><li> Imagen se lleva a cabo normalmente utilizando un 40 x / 1,30 aceite de NA lente de inmersión y las imágenes son capturadas con una HQ2 CoolSnap enfrió cámara CCD. </li><li> Z-secciones son capturados cada 1,5 micras a través del tejido 45 micras. El tiempo de exposición debe mantenerse tan bajo como sea posible. Normalmente, para exponer 5-50 ms para cada sección Z. Las imágenes se capturan cada 7 minutos y un máximo de nueve cortes se pueden visitar mediante un punto preciso del sistema DeltaVision de visitar la función. </li></ol> 6. Los resultados representativos Un ejemplo de lapso de tiempo la secuencia de una célula de la médula espinal es progenitorse muestra en la fig. 2a y una película correspondiente. Imágenes se inició en una rebanada de la médula espinal de una de dos días de edad (estadio HH 12) embrión. Esta célula se transfectó con un constructo que expresa GFP-αTubulin. Durante esta primera etapa, las células progenitoras neurales progenitoras sufren predominantemente progenitora-divisiones del modo en que las células se multiplican para generar dos células progenitoras más en bicicleta. La figura. Película 2b y la correspondiente figura 2 muestra una célula transfectadas con GFP-GPI (GPI de anclaje GFP), que marca la membrana celular. Esta célula se somete a una división durante el cual el proceso basal se divide en dos y está igualmente heredado por las células hijas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Figura 1. Slice protocolo de cultivo para el time-lapse. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Figura 2. B célulaehavior durante el desarrollo normal de la médula espinal. (a) los marcos seleccionados de la película 1. La célula que expresa GFP-tubulina divide con un plano de escisión que es perpendicular a la superficie apical (2 h 20 min), generando dos células hijas que dividen una vez más (24 h 23 min y 25 min h 54). (B) los marcos seleccionados de la película 2. Celulares transfectadas con GFP-IPG se somete a la división celular durante el cual se divide el proceso basal (flechas blancas) y también heredado por las células hijas. Película 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> . Película 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> .

<ol>
	<li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord.">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li><li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning,+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube.">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li><li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis.">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).</li><li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord.">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li><li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis.">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58 (2011).</li><li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li><li>Conchello, J. -. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. , (2006).</li><li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii:+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy.">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li><li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy.">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li><li>Biggs, D. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Deconvolution+Microscopy.">3D Deconvolution Microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2001).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+Opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Presentamos aquí una novela de lapso de tiempo de ensayo de imágenes para vigilar el comportamiento de células en cultivo rebanada de embriones de pollo. Este ensayo permite imágenes de alta resolución del tejido vivo para un máximo de 70 horas, aunque los plazos entre las 24-48 horas son más fáciles de capturar. El uso de un objetivo de aceite de NA y los intervalos relativamente cortos entre los puntos de tiempo permite la adquisición de imágenes en alta resolución, así como lo que nos permite monitorear el comportamiento de células, que a menudo se produce rápidamente, y puede ser fácilmente perdido durante el tiempo convencional de imágenes a intervalos utilizando confocal microscopía. La principal ventaja de este ensayo es la capacidad de las células de la imagen durante largos períodos de tiempo. El uso de gran campo 6 en vez de láser confocal de barrido microscopio 7 es fundamental para esto. La microscopía confocal tradicionalmente ha ofrecido una serie de ventajas sobre todo la microscopía de campo, incluyendo la capacidad de tomar secciones ópticas y eliminar la información de atención directa <sup&gt; 7, pero el uso de un agujero conduce a una pérdida de la luz al detector 8, excluyendo una cantidad significativa de información, y que requiere largos tiempos de exposición. Wide microscopía de campo, por el contrario, utiliza iluminación de campo completo y toda la luz que pasa a través del objetivo se envía al detector. Esto, junto con una alta eficiencia cuántica se enfrió (CCD) de la cámara garantiza imágenes con una elevada relación señal-ruido en comparación con la microscopía confocal 9, con tiempos de exposición muy rápidos. En nuestra aplicación, debemos la imagen durante largos períodos, registro de las pilas en 3D y en última instancia, resolver los pequeños-cerca de difracción de estructuras limitadas. Aunque microscopio confocal evita fuera del foco de luz de cada vez que llega al detector y por lo tanto reduce significativamente fondo en gruesos, densamente-etiquetados muestras 7, 8, sólo se logra una utilizable relación señal-ruido con entrada de luz mucho más grande que amplio microscopía de campo 10. Para sparsel muy sensible a la luzmuestras y marcados como los cortes electroporated de la médula espinal, por lo tanto, toda la microscopía de campo se comporta mejor que la microscopía confocal. Cuando se combina con la restauración de imágenes por deconvolución, que elimina la información de atención y mejora el contraste de campo amplio es entonces particularmente bueno para la detección de objetos pequeños, débiles 11. Si bien no es apropiado para todos los experimentos de imagen del tejido, este enfoque ha sido muy eficaz para nuestra aplicación en directo imágenes de células. La elección de la proteína fluorescente es un factor importante que puede influir en la supervivencia celular. Nos parece que los mejores resultados se obtienen a partir de construcciones que utilizan la proteína verde fluorescente (GFP) 12 como un marcador. Actualmente estamos evaluando una serie de proteínas fluorescentes rojas que pueden ser utilizados eficazmente en combinación con las buenas prácticas agrarias para el canal de doble lapsos de tiempo. Hay una variedad de tales proteínas disponibles 13. Aunque muchas proteínas son estables como fusiones con una proteína fluorescente, Algunas proteínas pueden volverse inestable por fusión, dando como resultado la viabilidad celular reducida. En tales casos, el uso de construcciones que contienen un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) es útil para separar la proteína de interés a partir de la proteína fluorescente. Cuando las rebanadas de imágenes de la médula espinal, se debe tener cuidado para minimizar la exposición a la luz fluorescente. Los oculares del microscopio debe ser utilizado sólo con luz transmitida (campo claro) para localizar y posición de las rebanadas. Imágenes fluorescentes siempre deben ser adquiridas utilizando el software de microscopio utilizando el mínimo tiempo de exposición. Estos deben mantenerse en el intervalo de 5-50 ms y el uso de filtros de densidad neutra se debe experimentar. A pesar de los tiempos de exposición más largos al principio puede producir imágenes más nítidas, los efectos de la exposición fototóxicas luz fluorescente puede conducir a la muerte celular. Los primeros 5-10 micras de tejido que está más cerca del cubreobjetos no debe ser reflejado ya que esta región contiene tejido que pueden haber sufrido daños durante elrebanar. Aunque los ejemplos presentados aquí son de embriones en la etapa electroporadas HH 10 y fotografiado 6-7 horas más tarde, este método puede ser utilizado para los embriones hasta HH etapa 18. En etapas posteriores, el tejido de la médula espinal es mucho más grande y por lo tanto es difícil de cortar con la mano. En estos casos, la incorporación de los embriones en el bajo punto de fusión de agarosa, y se seccionó con un vibratome puede producir mejores resultados. A pesar de que presentan este ensayo como un método para células de imagen en la médula espinal en desarrollo, este enfoque también ha sido modificado para la imagen de otros tejidos embrionarios, incluyendo la sensorial placodas 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Willco Dish </td><td> Willco Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> poli-l-lisina </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> 0,1% en Tris </td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato capilares </td><td> Instrumentos de Harvard </td><td> GC100-10 </td><td> Diámetro exterior de 1,0 mm, Diámetro interior 0.58mm </td></tr><tr><td> Electrodos (Genetrodes ovo, en forma de L </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5 mm chapada de oro </td></tr><tr><td> ECM 830 cuadrada del generador de impulsos </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> en electroopration ovo </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> El colágeno tipo I de rata </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> Medio L-15 (en polvo) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2,76 g / l en agua destilada para solución 5x </td></tr><tr><td> De bicarbonato de sodio </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> 7,5% de solución </td></tr><tr><td> Medio Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> sin rojo fenol </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> Solución de 100x </td></tr><tr><td> B-27 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> L15 (líquido 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 grados de inclinación </td></tr><tr><td> Inoxidable pasadores de acero sin cabeza </td><td> Watkins y Doncaster </td><td> E6871 </td><td> Tamaño A1 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 elastómero </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> Core DeltaVision sistema de microscopio </td><td> Applied Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 cámara CCD </td><td> Fotometría </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution live imaging of cell behavior in the developing neuroepithelium

La médula espinal de embriones consta de ciclismo células progenitoras neuronales que dan lugar a un gran porcentaje de las células neuronales y gliales del sistema nervioso central (SNC). Aunque se sabe mucho sobre los mecanismos moleculares que el patrón de la médula espinal y provocan la diferenciación neuronal 1, 2, carecemos de una comprensión profunda de estos primeros eventos en el nivel de comportamiento de las células. Por tanto, es fundamental para estudiar el comportamiento de los progenitores neuronales en tiempo real que sean sometidos a la neurogénesis. En el pasado, imágenes en tiempo real de tejido embrionario temprano ha visto limitado por la viabilidad celular / tejido en cultivo, así como los efectos fototóxicas de imagen fluorescente. Aquí se presenta un nuevo ensayo para el tejido de imágenes tales durante largos períodos de tiempo, utilizando un ex vivo novela rebanada protocolo de cultivo y de campo amplio microscopía de fluorescencia (Fig. 1). Este enfoque logra a largo plazo de lapso de tiempo de seguimiento de los embriones de pollo sPinal de células progenitoras de la médula con alta resolución espacial y temporal. Este ensayo puede ser modificado a la imagen de una gama de tejidos embrionarios 3, 4 Además de la observación de los comportamientos celulares y subcelulares, el desarrollo de la novela y periodistas altamente sensibles para la actividad de los genes (por ejemplo, la señalización de Notch 5) hace que este ensayo una poderosa herramienta con la que comprender cómo se regula la señalización comportamiento de las células durante el desarrollo embrionario.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium at JoVE.com

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Tisular embrionario en tiempo real es un reto durante largos períodos de tiempo. Aquí presentamos un ensayo para el seguimiento de los cambios celulares y subcelulares en la médula espinal de pollo durante largos periodos con alta resolución espacial y temporal. Esta técnica puede ser adaptado para otras regiones del sistema nervioso y embrión en desarrollo.

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K vistas.  University of Dundee, Dundee, UK. Tisular embrionario en tiempo real es un reto durante largos períodos de tiempo. Aquí presentamos un ensayo para el seguimiento de los cambios celulares y subcelulares en la médula espinal de pollo durante largos periodos con alta resolución espacial y temporal. Esta técnica puede ser adaptado para otras regiones del sistema nervioso y embrión en desarrollo.

Video: High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Investigación

Neurociencias

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

De alta resolución Magnética Funcional por imágenes de los métodos de resonancia cerebro medio humano

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta resolución<em&gt; En Vivo</em&gt; Protocolo Segmentación Manual for Human hipocampo subcampos Usando 3T Imágenes por Resonancia Magnética

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de la médula espinal de ratón

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

De alta resolución de imagen de resonancia magnética estructural del subcorteza Humano<I&gt; En Vivo</I&gt; Y Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uso de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...