Se prestó apoyo por Becton Dickinson Tecnologías. Las opiniones expresadas en esta presentación son las de los autores y no pretenden reflejar la política oficial del Gobierno de los EE.UU.. La investigación fue realizada en cumplimiento de la Ley de Bienestar Animal y otras leyes federales y reglamentos relativos a los animales y los experimentos con animales y se adhiere a los principios establecidos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Consejo Nacional de Investigación, 1996. La instalación donde se llevó a cabo esta investigación está totalmente acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International.

1. Colección NALT y el cultivo <ol><li> La eutanasia de los ratones con las orientaciones aprobadas IACUC. Evite el uso de anestésicos por inhalación que pueden afectar a NALT. Transferencia de los ratones a una aséptica área de trabajo o gabinete de bioseguridad. Retire la mandíbula inferior del ratón y limpiar la zona del paladar superior con toallitas con alcohol y yodo. </li><li> Use una hoja de bisturí N º 11 en el mango de bisturí para cortar cuidadosamente y los impuestos especiales el paladar superior, siguiendo el contorno interior de los incisivos y molares de ratón. </li><li> Con cuidado retire el paladar con unas pinzas, teniendo cuidado de no romper el paladar. </li><li> Este paso es necesario para reducir la contaminación de los cultivos y está diseñado para procesar múltiples paladares. Paladares Colocar en pocillos individuales en la primera columna de una estéril 48-así placa pre-llenado con 250 l de medio de cultivo completo (37 ° C) consistente en RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%, 100 mg / mL de estreptomicina, 100 IU / ml de penicilina, 50 mg / ml gentamicinay 1 mg / ml fungizona / anfotericina. Medios de comunicación deben ser carbonato de buffer si paladares se cultivan en un 5% de CO 2/95% de humedad aire de la incubadora (37 ° C), o bien, utilizar 10 mM HEPES pH 7,4, por falta de cultura de CO 2. </li><li> Para lavar los paladares, utilizar pinzas para mover los paladares en cada pocillo sucesiva en una fila, tocando con cuidado la placa entre los lavados, hasta que el paladar ha sido objeto de un total de ocho lavados. </li><li> Transferir los paladares en una nueva estéril 48-así placa que contiene 250 l de medio fresco, cultivo completo (37 ° C) en los pocillos. </li><li> Colocar las placas que contienen los paladares en una incubadora a 37 ° C para el cultivo de la duración del estudio. </li><li> Recoger muestras para su análisis por transferencia asépticamente 100 l de medio de los pocillos de cultivo en tubos Eppendorf cada 24 horas, reemplazando con 100 l de fresco 37 ° C medio de cultivo. </li><li> Centrifugar las muestras de medios de cultivo a 380 xg durante 10 minutos, 4 ° C, a los desechos de pellets. </li><li> Transferir el sobrenadante de la muestra se centrifuga a nuevos tubos Eppendorf y almacenar a -20 ° C hasta que esté listo para analizar. </li><li> Antígeno específico de IgG, IgM e IgA, o citocinas se midió en el sobrenadante de cultivo de tejidos por el estándar de ensayos ligados a enzimas (ELISA). </li></ol> 2. La ablación quirúrgica de NALT <ol><li> Hembra BALB / c ratones, 7 a 9 semanas de edad, son temas adecuados, pero otras cepas son también aceptables. Proveer de gel como la comida húmeda de tres días antes de la cirugía para aclimatarse ratón para sustituir los alimentos y el agua que va a ser administrado después de la operación. </li><li> Administrar una gota de medicamento Metacam alivio del dolor (1,5 mg / ml o 0,05 mg / gota) en la cavidad oral antes de la cirugía. </li><li> Anestesiar a ratones con las orientaciones aprobadas IACUC, por ejemplo, con la ketamina, acepromacina, y la mezcla de xilazina (KAX) y aplique una pomada en los ojos Puralube veterinario para prevenir el secado. Evite el uso de anestésicos por inhalación que pueden afectar a NALT. Anesthesia puede ser confirmada por la ausencia de respuesta refleja a un pellizco suave de los dedos de los pies. </li><li> Administrar 1 ml de solución salina (0,9% de cloruro de sodio inyectable USP) por vía subcutánea entre los omoplatos utilizando una aguja de calibre 22-28 y una jeringa para evitar la deshidratación potencial del ratón después de la cirugía. También se administran 0,1 ml de Respiram por vía subcutánea entre los omoplatos utilizando una aguja de calibre 22-28 y una jeringa para promover la respiración saludable durante y después de la cirugía. </li><li> Proporcionar apoyo térmico para el ratón en todas las manipulaciones posteriores. </li><li> Coloque el ratón anestesiado en posición supina, y utilizan dos circuitos independientes de sutura quirúrgica alrededor de los incisivos superiores e inferiores para sacar suavemente la boca abierta, dejando al descubierto el paladar superior. </li><li> Utilizar un N ° 11 cuchilla quirúrgica para hacer una incisión de aproximadamente 3 mm de longitud por la línea media del paladar superior en el sitio de la NALT. </li><li> Insertar un microcurette de 0,5 mm en la incisión y raspe suavemente debajo de los bordes ainterrumpir el NALT. </li><li> Cauterize la incisión para detener la hemorragia con un lazo directo bien en una unidad de cauterio térmico. </li><li> Continuar con el apoyo térmica, mientras que el ratón se recupera a la plena conciencia y la actividad. </li><li> Proporcionar al ratón con solución salina por vía subcutánea hasta tres veces al día, 1 ml por inyección entre los omóplatos, para prevenir la deshidratación, como medicamentos para el dolor necesario y por vía oral una vez al día durante 3 días después de la cirugía. Determinar la deshidratación mediante la realización de una prueba de tienda de la piel para verificar la turgencia de la piel. Sujetar la piel y el pelo entre las cuchillas hombros de modo que quede levantada. Si la piel vuelve rápidamente a la posición normal, anterior, el ratón no está deshidratado. Si la piel permanece elevada y se mueve lentamente, el ratón está en un estado de deshidratación y requiere solución salina. Proporcionar alimento húmedo durante al menos tres días después de la cirugía para permitir el tiempo suficiente para la recuperación. </li><li> Antes de cualquier procedimiento experimental, observar los ratones durante 8-10 días mediante el seguimiento de la ganancia de peso. La recuperación del peso deficientepor lo general indica la curación paladar incompleto, y estos ratones deben ser retirados de estudios. </li></ol> 3. Preparación NALT de Histología y evaluar el éxito de la cirugía NALT <ol><li> El éxito de la cirugía NALT debe ser comprobada por histología como se describe a continuación. Después de completar todos los estudios experimentales, preparar los ratones de las colecciones del cráneo por la eutanasia con las orientaciones aprobadas IACUC. Evite el uso de anestésicos por inhalación que pueden afectar a NALT. </li><li> Sujete la parte posterior del cuello del ratón sacrificado. Retire la mandíbula inferior del resto del cráneo cortando con tijeras a través de los procesos condilares con unas tijeras a ambos lados. </li><li> Comenzando por la nuca del cuello, retirar la piel y el pelo de la cabeza lentamente pelar y cortar hacia el lado ventral del cráneo. </li><li> Retire con cuidado la piel alrededor de la zona nasal y cortar la piel de la punta del hocico hasta eliminar por completo. </li><li> Separe el cráneo del ingenio vértebrasha recorte de las tijeras. </li><li> Inserte las tijeras dentro del foramen magno y cortar hasta la mitad del cráneo a lo largo de la línea media para permitir la penetración de formol en los tejidos blandos durante la fijación. </li><li> Fijar cráneo en 10% formalina tamponada neutra (MNB) durante 24 horas a temperatura ambiente. </li><li> Para descalcificar, ponga la muestra y el cassette independiente, envuelto en una gasa para evitar Rexyn de tocar el hueso, en la botella con la mezcla de ácido fórmico. Incubar durante 12 horas a temperatura ambiente, luego enjuague continuamente bajo agua del grifo durante aproximadamente 20 minutos. </li><li> Recortar la muestra al tabique y órbitas pasadas del ojo con una cuchilla de afeitar. </li><li> Muestra y el cassette se pueden almacenar a corto plazo en 10% MNB. </li><li> Colocar la muestra en un procesador de tejidos para su procesamiento durante la noche. Esto se hace para eliminar el agua de la muestra en preparación para la inclusión en parafina. </li><li> Quitar el tejido procesado, integrar en un bloque de parafina con el hocico hacia abajo, y deje que se enfríe. </li><li> Recorte rough 15 micras, las secciones transversales del bloque con un microtomo automatizado, acercándose a la localización aproximada del NALT, entonces continuar cortando en 5 secciones micras para el montaje en portaobjetos de vidrio en un 44,3 ° C baño de agua. </li><li> Hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción histológica debe ser utilizado para evaluar la ablación NALT. </li></ol> 4. Recolección de muestras biológicas procedentes de ratones 4.1 Suero <ol><li> Con cuidado, elevando la temperatura del cuerpo con una lámpara de calor se incrementa el flujo sanguíneo. Recoger la sangre por cortes en la vena lateral de la cola con una cuchilla quirúrgica. Permitir que la sangre gotee libremente en un tubo Microtainer separador de suero. </li><li> Aplique una leve presión con el nick con material absorbente, como una gasa o una toalla, para detener el flujo de sangre. </li><li> Permita que la sangre se coagule en las Microtainers durante 30 minutos y después centrifugar entre 6.15 x 1000 g por lo menos 90 segundos. </li><li> Transferencia separa el suero de Microtainer en un tubo Eppendorf limpio dealmacenamiento a -80 ° C. </li></ol> 4.2 La saliva <ol><li> Sostenga el ratón anestesiado verticalmente, mientras que pipeteo 20-30 l fosfato estéril (PBS) entre la mejilla y la encía. Recoger la saliva diluida dirigiendo punta de la pipeta entre la mejilla y la encía. </li><li> Transferir la saliva diluida a un tubo fresco que contiene 10 l de inhibidor de la proteasa 2x y almacenar a -20 ° C. </li></ol> 4.3 Las secreciones nasales <ol><li> La eutanasia del ratón antes de recoger las secreciones nasales, utilizando aprobado de guiado IACUC. Evite el uso de anestésicos por inhalación que pueden afectar a NALT. </li><li> Al pasar el cursor vertical, cuidadosamente pipetear 30 L de PBS estéril en una fosa nasal y recoger de enjuague de la otra fosa nasal. </li><li> Transferir enjuague a un tubo fresco que contiene 10 l de inhibidor de la proteasa 2x y almacenar a -20 ° C. </li></ol> 4.4 Las secreciones vaginales <ol><li> Insertar la punta de una micropipeta en la abertura de ªe vulva de un ratón de la eutanasia, lavar la vagina con 50 l de PBS estéril y recoger todo el líquido por la micropipeta. </li><li> Transferir enjuague a un tubo fresco que contiene 10 l de inhibidor de la proteasa 2x y almacenar a -20 ° C. </li></ol> 5. Antígenos específicos de anticuerpos o citoquinas en las muestras recogidas se puede medir por ELISA u otro método cuantitativo. 6. Los resultados representativos La Figura 1 proporciona un esquema general de los pasos implicados en el procesamiento del tejido que contiene NALT para el análisis ex vivo. En la Figura 2 (A, B), el tamaño del paladar se muestra, así como la ubicación de la incisión durante la cirugía de ablación (A), como se indica por la línea punteada. La ubicación de NALT están indicadas por flechas en la zona premolar en un extirpados hematoxilina-manchado paladar en la Figura 2 (C), mostrando los tejidos paralelas. Figura 3presenta pasos de la cirugía interrupción NALT, mostrando la exposición del paladar superior para el acceso a NALT (A, B), la ablación (C), y cauterización final de la incisión (D). Un típico H y E sección transversal de la zona que rodea el seno nasal NALT antes de la cirugía se muestra en la Figura 3E, mientras que una imagen de interrupción por el NALT microcurette directamente después de la cirugía aparece en la Figura 3F. Dar suficiente tiempo para la recuperación de la cirugía, las incisiones se cierran y la cavidad nasal carece de NALT (Figura 3G). Típicos resultados experimentales obtenidos mediante el uso de estas técnicas se muestran en la Figura 4, comparando los sobrenadantes de cultivo de tejidos y muestras biológicas de un estudio de una vacuna subunidad estafilocócica (STEBVax). Los ratones se les administró por vía intranasal STEBVax (IN) o intraperitoneal (IP). La vacuna se formuló con un adyuvante que activa el receptor tipo Toll-4 vía de 3,1<html> 4, y los controles se les dio sólo solución salina o una vacuna sin adyuvante. NALT cultivadas obtenidas de los grupos experimentales secretada antígenos específicos de inmunoglobulinas en el medio de que se podía medir por ELISA. En este ejemplo (Figura 4A), los resultados indican que las mayores cantidades de IgA fueron liberados por NALT obtenido a partir de ratones vacunados con una vacuna EN subunidad combinada con adyuvante. Las muestras biológicas (tales como la saliva suero, secreciones nasales, secreciones vaginales) adquiridos a partir de ratones de control o NALT libres se puede utilizar para perfilar la in vivo la respuesta inmune a los antígenos nasales para la comparación con los resultados de cultivo de tejidos. En la Figura 4B, IgA e IgG respuestas en materia de vacunación se redujo significativamente, sin NALT funcional. Los niveles de antígeno específico de IgA fueron generalmente mayores que la IgG en las secreciones mucosas (saliva, lavados nasales) de los ratones vacunados. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esquema de recogida NALT y el cultivo ex vivo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> Figura 2. Visualización del paladar ratón que indica la posición de incisión NALT y cirugía. El tamaño y la ubicación de paladar superior con la incisión de la cirugía indicada por la línea de puntos (A); paladar superior eliminado (B) o teñidas en hematoxilina (C) para ver el NALT en paralelo en el área premolar de la boca (manchas de color púrpura oscuro en la parte anterior del paladar ). NALT indicado por las flechas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Figura 3. Interrupción NALT quirúrgica. Las etapas clave de la cirugía de interrupción NALT: vista en posición supina del paladar superior del ratón antes de la cirugía (A); incisión longitudinal realizado en el paladar superior para acceder a la NALT (B); sonda microcurette inserta a través de incisión mediana para romper la estructura de NALTtegridad (C); la cauterización de la incisión en la conclusión de la cirugía (D). Las imágenes microscópicas de las cavidades nasales, manchadas H &amp; E, antes de la cirugía (E); inmediatamente después de la cirugía (F), y un éxito sanado, NALT sin ratón (G). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Figura 4. Vacunas de anticuerpos específicos de NALT culta, la saliva y las secreciones nasales recogidas de los ratones vacunados. El control de ratones libres de NALT o normal, o fueron vacunados en IP con STEBVax, y las muestras biológicas fueron recolectados. Los niveles de anticuerpos de muestras por triplicado fueron medidos mediante ELISA. (A) NALT fueron removidas de ratones de control (no manipulados quirúrgicamente) y se cultivan para examinar las respuestas de anticuerpos. La respuesta a la vacuna-IgA específica en la cultura de en los ratones vacunados fue estadísticamente diferente de los controles (Student t-test, p ≤ 0,01, en comparación con ningún adyuvante o la vacuna no). (B) La perturbación NALT reducido sustancialmente las respuestas de anticuerpos específicosque en la vacunación. Hubo diferencias significativas entre los niveles de anticuerpos específicos de NALT y NALT + grupos (sin cirugía, o cirugía de control) para todas las comparaciones excepto la saliva resultados de IgG (t de Student-test, p ≤ 0,05).

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No hay conflictos de interés declarado.

Hemos presentado los métodos colectivos para el desarrollo de un modelo animal, la obtención de muestras biológicas, y los ensayos para el examen de NALT asociados a la respuesta inmune 1-4. Hay factores adicionales a tener en cuenta durante la realización de estos métodos. Norma técnicas estériles para cirugía y cultivo de tejidos deben ser seguidas. Una combinación de agentes antibacterianos y antifúngicos utilizados durante el aislamiento y cultivo, así como el mantenimiento de los instrumentos esterilizados, área de trabajo y paladares desinfectadas se reduce el riesgo de contaminación. La saliva, lavados nasales y similares muestras de la secreción de la mucosa debe ser inspeccionado por la posible contaminación con sangre, como los anticuerpos en suero se encuentran generalmente en concentraciones más altas. Además, las secreciones mucosas sólo debe ser ligeramente diluido para el análisis porque concentraciones más bajas de anticuerpos están presentes en estas muestras en comparación con el suero. Los ratones deben mantenerse caliente directamente después de la cirugía previaventilar potencial de la anestesia inducida por la hipotermia. Alterne los ratones de descanso en sus caras durante la recuperación después de la cirugía para reducir al mínimo la respiración irregular. El procedimiento quirúrgico es más eficaz con tres individuos que trabajan juntos para completar estas tareas: una realización de la cirugía, uno para ayudar a mantener la boca abierta, y para proporcionar una atención postquirúrgica, como los ratones a recuperarse de la anestesia. Es necesario el uso de la tinción H &amp; E de las secciones transversales del cráneo al final de todos los procedimientos experimentales o estudios para verificar el éxito de la cirugía para cada ratón. Posibles resultados de cirugía son: la ablación completa NALT y bilaterales, la ablación incompleta, o NALT intacto. Debido a que no todas las cirugías se traducirá en una pérdida completa de la NALT, los animales con NALT residual o intacta puede ser utilizado como controles internos. Otro posible resultado es que el paladar no se cura por completo, dejando una abertura que conecta el nasal y la cavidad bucal. Incompletola curación del paladar dará lugar a su bajo peso y retraso del crecimiento, y que deberán ser retirados de los estudios. Al examinar las respuestas de la vacuna en primer lugar con el modelo de ratón servirá para establecer el papel de NALT en el resultado del estudio previsto (respuesta de anticuerpos, la supervivencia, etc.) La extirpación quirúrgica de la NALT facilita la determinación de las contribuciones nasales a la inmunidad local y sistémica. El abordaje quirúrgico se describe aquí es el método más directo para la obtención de un modelo de ratón carente de NALT. Seleccione knock-out modelos de ratón han sido reportados a NALT la falta, pero estos animales también son deficientes en citocinas o quimiocinas esenciales para el desarrollo de otros tejidos linfoides secundarios, y pueden albergar otros defectos 12,13. Además, los métodos descritos aquí se han desarrollado para examinar varios aspectos de la respuesta inmune se originan dentro de los conductos nasales. Los resultados experimentales se basan en estudios que utilizan el Palat toda la parte superiore desde el ratón para cultivo de tejidos, aunque es posible que las secciones pueden ser utilizados. Finalmente, el modelo NALT cultivadas es útil para realizar experimentos completamente en cultivo de tejidos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> De acero inoxidable estériles hojas quirúrgicas, N º 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Mango del cuchillo, N º 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> 48 y placas de cultivo celular </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal, inactivado </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Conc. final: 10% en volumen en medios de cultivo </td></tr><tr><td> Sulfato de estreptomicina </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Conc. final: 100 mg / mL </td></tr><tr><td> Penicilina </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Concentración final: 100 UI / ml </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10ML </td><td> Conc. final: 50 mg / mL </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Conc. final: 1 mg / mL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Conc. final: 10 mM </td></tr><tr><td> Tubos Eppendorf Microcentrífuga </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-gel de la cereza de Alimentos del Ratón Mojado Sabor </td><td> Bio-Serve </td><td> S4798-BANDEJA </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> Una gota de 1,5 mg / ml suspensión oral </td></tr><tr><td> La ketamina </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Co finalNC: 6,06 mg / ml </td></tr><tr><td> Acepromazina </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Conc. final: 0,061 mg / ml </td></tr><tr><td> Xilacina </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Concentración final: 0,667 mg / ml </td></tr><tr><td> Puralube Ungüento Veterinario </td><td> Pharmaderm Sanidad Animal </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% de cloruro sódico Inyección USP </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Unidad de cauterio térmico </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> TCU Punta de repuesto, lazo fino recto </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras quirúrgicas </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% de formalina neutra tamponada </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Pescador </td><td> A119P-4 </td><td> Mezclar 426 ml de ácido fórmico en 1047 mL de agua corriente, a continuación, añadir 45 ml Rexyn 101 (H) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Pescador </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micrótomo rotatorio </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina de Mayer </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Gill N º 1 hematoxilina </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer separadores de suero </td><td> BD Médico </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino </td><td></td><td></td><td> 100 mM de NaH 2 PO 4, 140 mM de NaCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Cóctel de inhibidores de la proteasa, EDTA libre </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

Los tejidos de la nasofaringe linforreticulares-asociados (NALT) que se encuentran en los seres humanos, roedores y otros mamíferos, contribuyen a la inmunidad en los senos nasales 1-3. El NALT dos paralelas en forma de campana estructuras localizadas en las fosas nasales por encima del paladar duro, y generalmente se considera que los componentes secundarios del sistema linfoide asociado a las mucosas 4-6. Situado dentro del NALT son compartimentos discretos de linfocitos B y T intercaladas con células presentadoras de antígeno dendríticas 4,7,8. Estas células están rodeadas por una capa de células epiteliales intercaladas con M-células que son responsables de la recuperación de antígenos de las superficies mucosas de los conductos de aire 9,10. Naive linfocitos que circulan a través de la NALT están preparados para responder a los primeros encuentros con patógenos respiratorios 7. Mientras que NALT desaparecen en los seres humanos a la edad de dos años, los órganos del anillo de Waldeyer y estructurado de manera similar linfáticos persisten ºroughout la vida 6. En contraste con los humanos, ratones retener NALT durante toda la vida, proporcionando así un modelo animal conveniente para el estudio de las respuestas inmunes originarios dentro de los senos nasales 11. Los cultivos de una sola célula de suspensiones de NALT no son prácticos debido a los bajos rendimientos de células mononucleares. Sin embargo, la biología NALT pueden ser examinadas mediante el cultivo ex vivo del órgano intacto, y este método tiene la ventaja adicional de mantener la estructura de tejido natural. Para los estudios in vivo, los modelos genéticos knock-out que presentan defectos limitados a NALT no están disponibles en la actualidad, debido a una mala comprensión de la vía de desarrollo. Por ejemplo, mientras que la linfotoxina-alfa ratones knock-out se han atrofiado NALT, las placas de Peyer, ganglios linfáticos periféricos, las células dendríticas foliculares y otros tejidos linfoides también se alteran en estos ratones genéticamente manipulados 12,13. Como una alternativa a los ratones knockout de genes, p ablación quirúrgicaermanently elimina NALT de la fosa nasal, sin afectar otros tejidos. El modelo de ratón resultante se ha utilizado para establecer relaciones entre las respuestas NALT e inmune a las vacunas 1,3. Recolección de serie del suero, saliva, lavados nasales y secreciones vaginales es necesaria para establecer la base de las respuestas del huésped a la vacunación, mientras que las respuestas inmunes procedentes directamente de NALT se puede confirmar mediante cultivo de tejidos. Los procedimientos siguientes se describen las intervenciones quirúrgicas, cultivo de tejidos y toma de muestras necesarias para examinar locales y sistémicos respuesta inmune humoral a intranasal (IN) la vacunación.

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Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Métodos para examinar las contribuciones de los tejidos nasofaríngeos linforreticulares-asociados (NALT) a la respuesta inmune sistémica nasales y de los ratones a las vacunas intranasales se describen. Se demuestra un procedimiento quirúrgico para establecer un modelo de ratón NALT-dependiente y<em&gt; Ex vivo</em&gt; Culturas de NALT extraídos.

Análisis de la importancia del tejido linforreticular nasofaríngeo asociado (NALT) en las respuestas de ratón a las vacunas

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

25.4K vistas.  U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. Métodos para examinar las contribuciones de los tejidos nasofaríngeos linforreticulares-asociados (NALT) a la respuesta inmune sistémica nasales y de los ratones a las vacunas intranasales se describen. Se demuestra un procedimiento quirúrgico para establecer un modelo de ratón NALT-dependiente y Ex vivo Culturas de NALT extraídos.

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

La visualización de Contracciones Motilidad y caracterización del papel de la<em&gt; Pilg</em&gt; en<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Un modelo de ratón IL-8 transgénicamente transgéni-<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoreo a Largo Plazo de las Respuestas Inflamatorias

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Inmunización de pez cebra adulto para la evaluación preclínica de vacunas basadas en ADN

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...