Estamos muy agradecidos con el Dr. Andrew Hollander, Sara Davis, Shuman Lee, Tim Jenkins, y el Dr. Xu Xiangsheng por su ayuda experta. Queremos agradecer el apoyo de la Dra. Ann Kennedy. BCB contó con el apoyo de la Beca de Formación Radiobiología C5T32CA009677. JFD se apoya en el Premio a la Trayectoria Burroughs Wellcome para Científicos Médicos (1.006.792). JLB contó con el apoyo de la concesión supers (5 R25 CA140116-03). Nos gustaría agradecer al Dr. Steve Hahn, cuyo aliento y apoyo ha contribuido a que nuestra investigación sea posible. También nos gustaría dar las gracias a la Universidad de Pennsylvania Centro de Nano-Bio Interface (NBIC) y el Dr. Dennis Discher para el estímulo y útiles comentarios. Reconocemos el Animalario de imagen pequeña (SAIF) en la Universidad de Pennsylvania para el uso de sus instalaciones centrales de resonancia magnética y óptica / bioluminiscencia. Estas técnicas fueron desarrolladas como parte de los proyectos que recibieron el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (RC1 y K08 CA145075 NS076548-01).

A. Pre-Operativo preparación de células del tumor <ol><li> Transducir células U251 con glioblastoma multiforme con un vector de expresión lentiviral (pGreenFire, Sistema Biosciences) para expresar de forma estable el gen de la luciferasa de luciérnaga. </li><li> Estas células fueron cultivadas en 10 ml de modificación completa de Dulbecco del medio Eagle (DMEM), que consiste en DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 1% penicilina estreptomicina, y 1% de aminoácidos no esenciales en un matraz de tejido T75 cultivo incubando a 5% de C0 2 y 37 ° C. </li><li> Realizar cultivo celular estándar, a partir de lavar las células con tampón fosfato salino (PBS), seguido de tripsinización. </li><li> Se inactiva la tripsina con DMEM completo, transferir la solución a un matraz cónico de 50 ml y determinar la concentración celular utilizando un contador de Coulter. </li><li> Centrifugar las células cosechadas en DMEM completo durante 3 min a aproximadamente 3.000 revoluciones por minuto. </li><li> Después de la centrifugación, de aspirarf los medios de comunicación, dejando sólo un pellet de células en el fondo del matraz cónico de 50 ml. </li><li> Trabajando rápidamente para evitar que las células de la desecación, volver a suspender las células en un volumen de DMEM completo fresco para conseguir la concentración deseada de 50.000 células / l y la transferencia a un vial de 2 ml estériles se colocaron en hielo. </li><li> Las células en hielo debe ser vortex brevemente en un nivel bajo cada ~ 20 min para evitar la adhesión celular. Las células pueden utilizarse con seguridad para implantes intracraneales hasta dos horas después de la colocación en hielo. </li></ol> B. Implantación Xenoinjerto ortotópico <ol><li> Pesar desnudos atímicos NCr ratón (nu / nu) para establecer una línea de base, antes de la implantación de peso. Por lo general, seleccione ratones de 6-10 semanas de edad, con pesos entre 17 y 24 gramos. </li><li> 1 hr antes de la implantación, pre-medicar el ratón con 5 mg / kg del fármaco meloxicam no esteroide anti-inflamatorio por vía subcutánea como un tratamiento para el dolor postoperatorio y la inflamación. </li><li> Anesthetize el animal con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina / xilazina a dosis de 140 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente. </li><li> Confirmar que el ratón es suficientemente anestesiado mediante la evaluación de la respuesta espontánea del animal a una pizca dedo del pie. Si el animal responde a la pizca dedo del pie, retrasar el procedimiento hasta que la anestesia puede tener efecto o considerar la inyección de anestesia adicional (&lt;25% de la cantidad original). </li><li> Prepare el ratón anestesiado para el posicionamiento en el Digital Stoelting Just for plataforma Ratón estereotáctica (Stoelting Inc.) enganchando los dientes del ratón incisivos en la barra de bocado de la inmovilización hocico y apretar la abrazadera nariz sobre el hocico al tiempo que garantiza que la cabeza del ratón está sobre un plano nivelado. </li><li> Transferir el ratón restringida a la plataforma estereotáctica Stoelting, el ajuste de la posición del animal de modo que las puntas de las barras de las orejas son en el extremo caudal del canal del oído. Una vez que el animal craneal a caudal de posicionamiento ha sido adjusted, asegure la barra de bocado para el marco estereotáxico. El ratón debe descansar sobre una placa firme calefacción plástico (Harvard Apparatus) sujeta con cinta a la plataforma Stoelting para proporcionar retroalimentación controlada por regulación de la temperatura durante la cirugía. </li><li> Ajuste la altura de las barras de oído según sea necesario y luego avanzar las barras del oído en la porción caudal del conducto auditivo externo, asegurándolos de tal manera que la cabeza del ratón está en un plano nivelado y se inmovilizan en toque de un dedo. Monitorear cuidadosamente en busca de signos de dificultad respiratoria después de la colocación de las barras de oído. Suelte y vuelva a situar si el animal está en peligro. </li><li> Insertar la punta lubricada de una sonda de temperatura rectal conectado al controlador de temperatura TCAT-2DF (Harvard Apparatus) para controlar la temperatura del animal y para proporcionar control de realimentación para la placa de calentamiento posicionado debajo del ratón para mantener la temperatura corporal del animal a 36 ° C durante el procedimiento. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para los ojos para prevent secado. </li><li> Aplicar solución de betadine a la parte superior de la cabeza del ratón para desinfectar el lugar de la incisión, teniendo cuidado de evitar los ojos. </li><li> Realizar una pizca dedo del pie para confirmar que el ratón es inconsciente, la entrega de una pequeña cantidad de ketamina adicional / xilazina (&lt;25% de la dosis inicial) si es necesario. </li><li> Limpiar el 0,45 mm broca de fresa (Stoelting) unido a la perforación (Foredom microtaladro) utilizando una almohadilla con alcohol y luego esterilizar la broca en un esterilizador de perlas de vidrio (Germinator 500, CellPoint Scientific) durante 15 seg, sumergiendo sólo la broca en las perlas esterilizador. </li><li> El uso de un bisturí estéril practicar una incisión 0,75 cm longitudinalmente en la mitad del cuero cabelludo que se extiende desde el nivel de los ojos en sentido caudal. Confirmar la visualización de la bregma. </li><li> Fije el soporte a la plataforma de perforación Stoelting y colocar un taladro (Foredom microtaladro) con un poco 0,45 mm taladro fresa (Stoelting) en el soporte del taladro, manteniéndola en su posición. </li><li> Coloque la broca exactamente sobre tél bregma y de finalización y la x, y, z de la pantalla estereotáxica digital. Mover la punta de la broca a una posición de 2 mm posterior y 1,5 mm lateral a la bregma en el hemisferio cerebral derecho, y un taladro en el cráneo del animal con el taladro Foredom, perforando sólo el hueso. Una torunda de algodón estéril se puede utilizar para retraer suavemente los bordes de la incisión para facilitar la visualización del cráneo. </li><li> Eliminar el taladro y el taladro de soporte de la plataforma estereotáctica. </li><li> Una el Nanomite inyector bomba de jeringa (Harvard Apparatus) para la plataforma estereotáctica. </li><li> Retire las pilas de hielo y, o bien suavemente vórtice del vial que contiene las células tumorales con breves impulsos o dé golpecitos en el vial para resuspender las células. Elaborar 7 l de la suspensión celular a través de un calibre 30 de 1 &quot;larga aguja de bisel plano adjunto a una jeringa de 10 l (Hamilton jeringa). Evite grandes burbujas de aire en la jeringa. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la inicial de 6 l de fluido which será el volumen total inyectado en el ratón. Las pequeñas burbujas de aire en el resto de 1 l son de ninguna preocupación. Evitar una repetición de drenaje planos de la suspensión de células a ser posible para minimizar el daño a las células. </li><li> Coloque la jeringa cargada en la jeringa del inyector. Uso de una almohadilla de alcohol, eliminar cualquier líquido de la suspensión de células que aparece en la punta de la aguja para evitar la contaminación del sitio de la incisión con células de cáncer que pueden resultar en el crecimiento del tumor en el espacio extracraneal. </li><li> Ajustar la bomba de inyector para suministrar 6,0 l a una velocidad de 0,5 l / min. El 1 l de suspensión celular queda en la jeringa después de la implantación asegura que las burbujas de aire que con frecuencia se acumulan en la jeringa no se inyectan en el animal. La inyección de burbujas de aire podría resultar en una embolia de aire fatal. </li><li> Avanzar la aguja de la jeringa en el orificio de trepanación mantener la aguja perpendicular (90 grados) con el cráneo. Una vez que la aguja ha atravesado el cráneo, cero fuera de los coordinAtes de la pantalla estereotáctica digital y luego avanzar lentamente la punta de la aguja durante un periodo de 4 min hasta que se alcanza una profundidad de 2,5 mm. La aguja pasa a través de la corteza y las porciones del hipocampo posterior. El x, y, z las coordenadas de implantación estereotáxica fueron elegidos para generar un tumor lateralmente colocada dentro del hemisferio cerebral evitando lesiones a las estructuras cerebrales críticas tales como el tálamo y la proximidad a los ventrículos, reduciendo así la probabilidad de sembrar el líquido cefalorraquídeo con células tumorales que puede dar lugar a indeseables tumores vertebrales. Una ubicación posterior con respecto a la bregma fue seleccionado para reducir la probabilidad de un tumor grande, localmente avanzado ulcerosas en la órbita. Pausa con la aguja a una profundidad de 2 min y luego iniciar la implantación de células. </li><li> Durante la implantación, se seca el cráneo repetidamente con una lanza esponja microquirúrgica para eliminar cualquier fluido que contiene tumor que pueden haber reflujo de la trepanación duranteimplantación. Evite interrumpir la aguja con la esponja microquirúrgica. La eliminación de este líquido debería reducir la probabilidad de tumor que crece en el espacio extracraneal. </li><li> Después de completar la inyección, deje la aguja en el cerebro durante aproximadamente 2 min y luego, lentamente, retirar la aguja durante un periodo de 3-4 min. </li><li> Afloje las barras de oído y restrictores hocico y retire el ratón del aparato estereotáxico. </li><li> Cierre el orificio de trépano en el cráneo con cera ósea estéril depositado por el roce de cera de ida y vuelta a través del orificio de trepanación del final de madera de un estéril con punta de algodón aplicador. Continuar aplicando cera de hueso hasta que el orificio está completamente sellado y la cera de hueso sellar el orificio de trépano está alineado con el cráneo adyacente. </li><li> Re-aproximados los bordes de la incisión con hisopos de algodón estériles y aplicar pegamento tejido veterinaria para sellar la herida, teniendo cuidado de evitar la exposición de pegamento a los ojos del animal. </li><li> Por último, coloque el cursor sobre una almohadilla térmica a 37 °C hasta que el animal recupera la consciencia. Traslado al animal de vuelta a su jaula original una vez que el ratón está alerta y preparado. </li></ol> C. bioluminiscente de imágenes (BLI) para controlar el crecimiento tumoral y la respuesta al tratamiento Guía rápida para seguir para obtener imágenes bioluminiscentes. <ol><li> Anestesiar los ratones implantados previamente con tumor en una cámara con isoflurano 2% y oxígeno. </li><li> Mientras que los ratones se anestesian, les inyectan por vía subcutánea o por vía intraperitoneal con 60 l de sal de potasio de D-luciferina diluido en PBS a una concentración de 50 mg / ml. </li><li> Encender el flujo de la anestesia a los conos de ojiva en el escáner de imágenes bioluminiscentes y transferir rápidamente a los ratones para el escáner colocando sus hocicos en los conos de ojiva. </li><li> Coloque divisores negras entre los ratones para limitar el sangrado de señal bioluminiscente de un tumor con alta intensidad de señal a un tumor adyacente con señal mucho menor. </li><li> Usoel software Image Living, tomar frecuentes exposiciones de serie para una duración total de hasta 30 min después del tiempo de inyección de D-luciferina. Estamos a favor de establecer el tiempo de exposición a &quot;Auto&quot; para limitar la probabilidad de una imagen bajo o sobre expuestas. No sola exposición debe ser&gt; 5 min. </li><li> Realizar repetir bioluminiscente de imágenes a intervalos apropiados. Formación de imágenes semanal de serie es una opción razonable para muchos experimentos longitudinales evaluar la respuesta al tratamiento. </li><li> Después de la adquisición de imágenes, usar el programa de software Image Living para analizar los tumores mediante la elaboración de una región de interés (ROI) alrededor de cada tumor en cada imagen adquirida durante la sesión de formación de imágenes bioluminiscentes. Aplicar una segunda región, más pequeña de interés para el flanco inferior de cada ratón en cada imagen como una región de fondo de interés para corregir la señal bioluminiscente del tumor en función del grado de intensidad de señal de fondo bioluminiscente. Nosotros preferimos usar el &quot;Radiance&quot; en lugar de &quot;ajuste de cuenta&quot; como la salidavalores de señal bioluminiscente. </li><li> Exportar los resultados de ROI en Excel y determinar el máximo fondo ajustado señal bioluminiscente para cada ratón. </li><li> Repita imágenes bioluminiscentes, como se indica para la monitorización seriada de crecimiento del tumor. En nuestros experimentos, se realiza semanalmente BLI. Nosotros preferimos la determinación de la máxima señal de BLI para una sesión de imágenes obtenido tomando exposiciones frecuentes sobre 5 - 30 min después de la inyección de D-luciferina. </li></ol> D. Representante Resultados Esta técnica de implantación estereotáxica se asocia con un éxito tumor tasa de absorción de 90-100% y con baja mortalidad perioperatoria que es por lo general menos de 5%. El riesgo de efectos secundarios no deseados es también bajo con esta técnica, incluyendo las complicaciones tales como la siembra de la médula espinal a partir de células tumorales implantadas en los ventrículos, o el crecimiento del tumor extracraneal de cualquiera de siembra de la incisión con células tumorales o el cierre inadecuado de la trepanación unguientes tumor intracraneal para expandirse a través de la abertura en el cráneo. Análisis ex vivo de xenoinjertos de tumores demostraron áreas que se espera de la hipoxia, el aumento de la expresión del VEGF, y necrosis. Microscopía de fluorescencia de la proteína verde fluorescente (GFP) estable expresado por nuestra línea celular GBM revelaron la naturaleza infiltrante de estos xenoinjertos. La Figura 1 muestra los resultados de una implantación estereotáxica típico con éxito de células de GBM en el cerebro de un ratón. Este es un escáner cerebral ponderada en T2 MRI de un cerebro de ratón realizó con un imán de 9,4 Tesla 21 días después de la implantación con la técnica aquí descrita. Figura 1 revela un único foco de tumor en el hemisferio derecho (contorneada en rosa) medición de 19 mm 3 que se localiza en las coordenadas precisas del sitio de implantación. La Figura 2 muestra los resultados de formación de imágenes bioluminiscente usando el techn<html> iques descrito aquí por un grupo de 10 ratones con tumores implantados estereotácticamente que estaban uniformemente estratificada basada en la intensidad máxima de la señal bioluminiscente para recibir irradiación craneal (4 x 4 Gy fracciones diarias) o ningún tratamiento en absoluto. En este experimento, bioluminiscente de imágenes muestra que la terapia de radiación inhibe la proliferación de los tumores implantados, lo que resulta en ningún aumento en la señal detectada bioluminiscente, mientras que la señal aumenta sustancialmente en los tumores de control mock-irradiados, debido a la proliferación descontrolada de las células cancerosas. Figura 1 (Video). Coronal secciones de IRM de un cerebro de ratón que contiene un tumor glioblastoma multiforme U251 con el contorno del volumen del tumor (en color rosa). El análisis se ha realizado mediante un spin eco ponderada protocolo T2 en un escáner 9.4 Tesla. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4089/4089movie1.m4v" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> . RE 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. 10 ratones con tumores implantados estereotácticamente glioblastoma multiforme fueron tratados con radioterapia de haz externo a 16 Gy en fracciones de 4 o ningún tratamiento. Los ratones fueron imágenes con imágenes bioluminiscentes antes del tratamiento y cada semana después del inicio del tratamiento. El gráfico presenta bioluminiscencia relativa calculada como cambio de la mediana pliegue donde se define el cambio veces como la relación del valor de la corriente máxima BLI a pre-tratamiento máximo valor BLI.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+monitoring+of+intracranial+glioblastoma+xenograft:+response+to+primary+and+salvage+temozolomide+therapy.">Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de implantación estereotáctica de las células cancerosas en ratones descritos en este documento genera reproduciblemente tumores que razonablemente recapitular el modelo de infiltración y rápido crecimiento del glioblastoma multiforme clínico 2, 6-8. Esta técnica está especialmente bien adaptado a los experimentos que estratifican ratones uniformemente a distintos grupos de tratamiento donde los tumores reproducibles de tamaño comparable y las propiedades biológicas y, en determinadas loc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Descripción </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Just for Digital Ratón instrumento estereotáxico </td><td> Stoelting </td><td> 51730D </td><td> Estereotáctica plataforma para la implantación del ratón </td></tr><tr><td> La ketamina / xilazina </td><td></td><td></td><td> Anestesia inyectable </td></tr><tr><td> Puralube ungüento Veterinario (oftálmica) </td><td> Amazon.com </td><td></td><td> Para prevenir la sequedad en los ojos del ratón </td></tr><tr><td> perforar soporte para la plataforma estereotáctica </td><td> Stoelting </td><td> 51681 </td><td></td></tr><tr><td> Taladro eléctrico Micromotor </td><td> Stoelting </td><td> 51449 </td><td> Para taladrar a través del cráneo </td></tr><tr><td> 0.45 mm carburo broca </td><td> Stoelting </td><td> 514551 </td><td></td></tr><tr><td> Hisopos de algodón estériles </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cuenta de vidrio seco esterilizador (Germinator 500) </td><td> Braintree Scientific </td><td> GER-5287 </td><td> Para esterilizar los instrumentos quirúrgicos metálicos </td></tr><tr><td> Ratón sonda rectal </td><td> Braintree Scientific </td><td> RET-3-ISO </td><td> Compatible con el controlador de temperatura </td></tr><tr><td> Controlador de temperatura (TCAT-2DF) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 727561 </td><td> Controlador de temperatura para mantener la temperatura del animal durante cirugía </td></tr><tr><td> Pequeña placa calefactora </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 727617 </td><td> Para el uso con controlador de temperatura para calentar ratón durante la cirugía. La placa de calefacción se ajusta debajo del ratón en la plataforma estereotáxica. </td></tr><tr><td> Escalpelos desechables </td><td> BD Bard-Parker </td><td> 2015-11 </td><td> # 10 bisturí </td></tr><tr><td> 10 microlitros jeringa </td><td> Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td> Para la inyección de las células tumorales </td></tr><tr><td> Agujas de calibre 30, de 1 &quot;de largo, con punta plana </td><td> Hamilton </td><td> Vario </td><td> Debe ser compatible con la jeringa 10 l </td></tr><tr><td> Nanomite bomba de jeringa programable </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 704507 </td><td> Digital jeringa motorizada inyector para dispositivo estereotáxico </td></tr><tr><td> Celulosa estériles esponjas quirúrgicas lanza </td><td> Ultracell </td><td> 40410 </td><td> Para secar el campo quirúrgico </td></tr><tr><td> Bone cera </td><td> Ethicon </td><td> W31 </td><td> Para sellar el orificio de trepanación </td></tr><tr><td> Tissumend II adhesivo sintético tejido absorbible </td><td> Laboratorios de Productos Veterinarios </td><td> 3002931 </td><td> Para sellar la incisión </td></tr><tr><td> Bomba de agua caliente con cubierta térmica de colchón </td><td> Gaymar </td><td> TP-650 </td><td> Calienta ratones en el postoperatorio </td></tr><tr><td> IVIS Lumina II </td><td> Caliper Life Science </td><td></td><td> Bioluminiscente de imágenes </td></tr><tr><td> D-luciferina de potasio sal </td><td> Oro Biotecnología </td><td> SUERTE-1 </td><td> Luciferina para bioluminiscente de imágenes </td></tr></tbody></table>

stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme

El glioblastoma multiforme (GBM) es un cáncer de alto grado primario del cerebro con una supervivencia media de sólo 14,6 meses en los seres humanos a pesar estándar tri-modalidad de tratamiento consiste en la resección quirúrgica, post-operatorio la radioterapia y la quimioterapia temozolomida 1. Nuevos enfoques terapéuticos se evidencia la necesidad de mejorar la supervivencia del paciente y la calidad de vida. El desarrollo de estrategias más efectivas de tratamiento se vería favorecida por los modelos animales de GBM que recapitular la enfermedad humana todavía permiten obtener imágenes en serie para controlar el crecimiento del tumor y la respuesta al tratamiento. En este trabajo, describimos nuestra técnica para la implantación estereotáxica precisa de bio-células capaces de formar imágenes GBM cáncer en el cerebro de ratones desnudos que resulta en xenoinjertos de tumores que recapitulan las principales características clínicas de la MBG 2. Este método produce tumores que son reproducibles y están situadas en localizaciones anatómicas precisas al tiempo que permite imágenes in vivo bioluminiscente para supervisar serie intrael crecimiento de xenoinjertos craneal y respuesta a los tratamientos 3-5. Este método es también bien tolerado por los animales con baja morbilidad y mortalidad perioperatorias.

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Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Se describe un método integrado para la implantación precisa, estereotáctica de las células de glioblastoma multiforme en el cerebro de ratones desnudos y posterior serie<em&gt; In vivo</em&gt; Formación de imágenes para controlar el crecimiento y la respuesta al tratamiento de los xenoinjertos resultantes.

La implantación estereotáctica intracraneal y<em&gt; En vivo</em&gt; Radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

stereotactic-intracranial-implantation-vivo-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

25.5K vistas.  University of Pennsylvania. Se describe un método integrado para la implantación precisa, estereotáctica de las células de glioblastoma multiforme en el cerebro de ratones desnudos y posterior serie In vivo Formación de imágenes para controlar el crecimiento y la respuesta al tratamiento de los xenoinjertos resultantes.

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Investigación

Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

En vivo doble sustrato bioluminiscentes imagen

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

La implantación intracraneal con posterioridad 3D En Vivo Bioluminiscentes imagen de gliomas murino

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Un modelo murino de la implantación de un stent en la arteria carótida para el Estudio de la reestenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Una novela de alta resolución<em&gt; En vivo</em&gt; Técnica de escaneo para el Estudio de la respuesta dinámica de estructuras intracraneales al crecimiento del tumor y Terapéutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

Crear anatómicamente exactos y reproducibles intracraneal xenoinjertos de tumores cerebrales humanos

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

La implantación estereotáctica intracraneal y

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