Los autores desean agradecer a Tammy Esmaili por su ayuda en la gestión de los consumibles de laboratorio. AA es el beneficiario de una beca de doctorado del Centro de Excelencia para la Investigación de la Enfermedad de Alzheimer y Atención de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Edith Cowan. MC Doctor recibe apoyo financiero del Rotary Club, de Perth. AM, GV, KT, y RNM son financiados por la Fundación de Investigación del Alzheimer del McCusker.

1. Sistema de Mantenimiento <ol><li> El pez cebra se mantienen en un sistema de circulación que continuamente filtros y airea el sistema de agua para mantener la calidad del agua requerida para un medio acuático sano. El sistema de circulación también ayuda a filtrar el exceso de comida y excrementos de peces. Diferentes empresas ofrecen sistemas de pez cebra, pero nosotros usamos sistemas de hábitats acuáticos, Estados Unidos en nuestro laboratorio. La temperatura ambiente o la temperatura del tanque se mantiene generalmente entre 26 a 28.5 ° C y las condiciones de iluminación son 14:10 h (luz: oscuridad). Un sistema de pez cebra de hábitats acuáticos (por ejemplo, sistema de sobremesa) Costos ~ 9.000 USD. Este sistema de mesa con dos estantes puede contener seis 10-litros, doce 3-litros, o veinte tanques 1,5-litros en cada estante. Múltiples líneas de los peces (por ejemplo, transgénico, de tipo mutante y salvaje) también pueden ser alojados en el mismo sistema. </li><li> Un conjunto de diferentes tipos de filtros se utilizan en el sistema. En nuestro sistema, el agua de todos los tanques de paEPE a través de un 120-micras de bloque de filtro, 50-micras cartucho del filtro filtro, biológica, la absorción de filtro de carbón activo y filtro de desinfección UV antes de ser distribuido de nuevo en el tanque. De-chlorinated/aged agua se utiliza en el sistema de pez cebra. El agua puede ser de-clorado por el envejecimiento durante al menos 48 h. En condiciones ideales, el agua debe mantenerse en un depósito con una bomba de circulación del agua para mantener el calor, y acelerar el de-cloración. </li><li> El pH del agua del sistema deberá ser comprobado diariamente y se mantiene entre 6,8 y 7,5. Cuando sea necesario, bicarbonato de sodio debe utilizarse para aumentar el pH. </li><li> Los tanques de peces se debe limpiar con regularidad. Para limpiar un tanque de peces, cerrar el flujo de agua de este tanque, drenar el exceso de agua por la inclinación del tanque hacia atrás y extraer el depósito cuidadosamente del sistema. La suciedad y el crecimiento de algas será evidente en la parte inferior y los lados del tanque. </li><li> Coloque el deflector en el tanque limpio, y llénelo con agua de cloro (también conocido como Sistema water). Transfiera cuidadosamente los peces en este acuario con una red de pesca. Cerrar la tapa y transferir la etiqueta de nombre del tanque. Coloque con cuidado el tanque limpio en el sistema y conectar el suministro de agua. </li><li> Para descontaminar la red de pesca, rociar con un 70% de etanol, enjuague con agua y deje que se seque antes de volver a usarlo. Retire el deflector del tanque sucio y pulverizar las dos partes con 70% de etanol. Enjuague bien con agua corriente y deje que el depósito y el deflector se seque completamente antes de volver a usarlo. </li><li> Los filtros del sistema de circulación tienen que ser revisados ​​y cambiados regularmente para asegurar su correcto funcionamiento. Estos filtros deben ser cambiados regularmente para asegurar un suministro de agua adecuado y limpio para todos los tanques de peces. </li><li> La almohadilla 120 micras de filtro normalmente se vuelve a colocar o reemplazar diariamente; reposicionar hacia el flujo de agua para utilizar completamente antes de sustituir por uno nuevo. </li><li> El filtro de cartucho se debe cambiar semanalmente. Para cambiar el filtro de cartucho, retire la unidad del filtro girando hormigaiclockwise con una llave o manos. Coloque una lámina de plástico o una toalla debajo para prevenir o absorber los derrames de agua. Reemplace el filtro de cartucho por uno nuevo y colocar la unidad de filtro de nuevo en el sistema, apriete con cuidado con las manos y una llave si es necesario. </li><li> El filtro de carbón debe ser cambiado cada dos semanas (cada dos semanas). Para cambiar el filtro de carbón, retire la unidad del filtro de carbono cuidadosamente con una llave. Desechar el carbono activado usado y sustituirlo por nuevo carbono activado. Vuelva a colocar el soporte de carbono y colocarlo de nuevo en la unidad de filtro. Montar la unidad de filtro de nuevo en el sistema. Encender el sistema y comprobar que el agua fluye hacia el filtro. Si es necesario, lavar un poco de agua a través de las tuberías de limpiar la suciedad en las tuberías antes de colocar el filtro en el sistema. </li><li> El filtro biológico debe limpiarse cada seis meses. Un filtro biológico se encuentra generalmente entre el bote y el filtro de carbono en el sistema de circulación. Para cambiar el filtro biológico, remove la unidad de filtro del sistema. Libere la presión del filtro presionando el botón de liberación de presión. Desenroscar el filtro con una llave. Generalmente se necesitan dos personas para este paso. Retirar la tapa de la unidad de filtro. Vaciar el contenido del filtro en un recipiente tamizaron para separar el siporax del agua. Nota: siporax es una multa de poro bio-filtro medio que tiene la capacidad de realizar tanto la nitrificación y de desnitrificación. </li><li> Si el siporax es muy sucio reemplazarlo con uno nuevo. Llene el filtro con agua del sistema (de-agua clorada), cierre la tapa, devuelva la unidad al sistema de filtro y conecte el suministro de agua. Nota: En un acuario aclimatado, el siporax será el hogar de varias bacterias nitrificantes. Estos microorganismos son críticos para mantener el ciclo del nitrógeno en el acuario, y la eliminación de la carcasa primaria para el filtro biológico (el siporax sucio) podría dar lugar a un pico de amoniaco grave, seguido de un pico, mientras que el nitrito de new filtro biológico (con siporax nuevo) es el restablecimiento. Ambos de estos estados intermedios del ciclo del nitrógeno puede ser tóxico para los organismos acuáticos y puede matar el pez cebra si no respondieron de forma apropiada. Por lo tanto, es importante disponer de un filtro biológico secundario en otro lugar en el sistema de alojamiento pez cebra (por ejemplo, en el depósito de recogida en el sistema de hábitats acuáticos) para permitir la repoblación rápida de estos microorganismos importantes en la siporax nuevo. </li><li> Filtros UV se usan para el control de contaminantes biológicos del sistema (como las bacterias) y debe ser reemplazado cada mes nueve-diez. Debe tenerse en cuenta que tipo de filtro UV dosis desinfección es de ~ 110 mJ / cm 2 en el comienzo de la vida de la lámpara y la tasa de dosis disminuye con el transcurso del tiempo, por lo que es necesario sustituir el globo incluso cuando parece ser aún funcional. </li></ol> 2. Alimentación <ol><li> El pez cebra puede ser alimentado con comida seca (tamaño de la comida de 100 micras para t larvaso 300/400 micras para peces adultos) o alimento vivo (artemias). Artemia (Artemia sp.) Huevos están disponibles en tiendas de animales locales y se puede rayar en el laboratorio, siguiendo los sencillos pasos que se describen a continuación. <ol class="lalpha"><li> Disolver la sal del mar rojo en agua envejecido mediante la colocación de un vaso de precipitados con sal en un agitador magnético para una mejor solubilidad. Alternativamente, la sal se puede disolver en agua por aireación con el tubo de aireación. Sal Instant Ocean también se puede utilizar como una solución de eclosión si rojo sal marina no está disponible. Camarones de salmuera puede tolerar un amplio rango de salinidad, sin embargo, que eclosionan nuestro artemia (10-15 g) en 30-35 g / L de agua salada del mar rojo. Nota: En el caso de los huevos de artemia no están fácilmente disponibles en las tiendas locales de mascotas luego encapsulados camarones de salmuera también se puede utilizar después de &quot;destapado&quot; en lotes antes de su inclusión en el criadero de camarones. Esto también podría evitar viajes frecuentes a la tienda de mascotas. </li><li> Llene la nacedora artemia con salt de agua y añadir los huevos de camarones en una concentración de 1,2 cucharadas / litro. Airear la nacedora vigorosamente con una bomba de aire y dejar los huevos de camarones en salmuera para salir del cascarón durante ~ 48 h. Nota: Cabe señalar que un-enriquecido camarón de salmuera perder valor nutricional cada hora después de la eclosión. Por lo tanto, puede ser apropiado para cualquiera de escotilla durante 24 hr o enriquecer más de 48 horas con el fin de obtener el máximo valor nutricional de la gamba de salmuera. </li><li> Agua residual del sistema de eclosión se añade a los residuos de cuarentena a desinfectar con lejía y dispuesta más adelante. </li></ol></li><li> Para recoger los camarones de salmuera, retire el tubo de aire y permitir que la cultura que conformarse con 4-5 minutos pero no más de 10 min. Los camarones de salmuera eclosionados se reúnen en la parte inferior de la Hatcher. <ol class="lalpha"><li> Recoger salmuera camarones utilizando el grifo en la parte inferior de la incubadora. Deseche el flujo inicial, que consiste en un-eclosionados los huevos de artemia. </li><li&gt; Después de desechar los camarones de salmuera no-nacidos, recoger los camarones de salmuera nacidos que serán utilizados como alimento el pez cebra. </li><li> Separe los camarones de salmuera del agua salada, utilizando una red de recolección de artemia (~ 350 micras de malla de nylon). Lavar los camarones de salmuera de la red en un recipiente con agua del sistema. </li></ol></li><li> Las artemias recogidos están generalmente presentes en concentración alta en la parte inferior del recipiente dándole un color más naranja. </li><li> Pase los camarones de salmuera para el pez cebra con una pipeta o un gotero / squeezy. La cantidad de alimento dispensado depende del tamaño de la población de los tanques individuales. La relación comúnmente aceptado para el pez cebra es recibir 4% del peso corporal en los alimentos por día. Pez cebra nunca deben ser sobrealimentadas ya que esto puede aumentar el nivel de nitrato en el agua, posiblemente afectando su reproducción, o la viabilidad, ya que algunos peces pueden morir debido a comer en exceso. <ol class="lalpha"><li> Al inyectar los alimentos en laagua, los peces hambrientos nadar para atrapar a los camarones de salmuera. </li></ol></li><li> Alimentación seca se puede realizar usando un ecosistema acuático del / hábitats acuáticos sencillo resorte basada dispensador de alimento para peces. Alternativamente, alimentación seca también se puede realizar utilizando una cuchara simple o cortando un cuentagotas de plástico diagonalmente con tijeras para dar una apariencia de una pequeña cuchara. </li></ol> 3. Cría <ol><li> Pez cebra iniciar la reproducción en el inicio de la luz. Los huevos fertilizados se puede obtener a través de la cría en el tanque de cría o por parejas. Mientras que en el tanque de cría es más mano de obra eficiente y se aplica para la recolección de embriones habitual en nuestro laboratorio, la cría de pares se prefiere cuando los genes o mutaciones deben ser examinados de cada pez. </li><li> Para la cría en el tanque, instale el reproductor en el tanque y soltar lentamente en el tanque de peces después de la aparición de la luz. Por otra parte, en el tanque de cría de configuración se puede dejar toda la noche en la pecera. </li><li> Lalero del obtentor en el tanque para alrededor de 15 min para permitir que el pescado para aparearse antes de retirar el criador de la cubeta y la recogida de los huevos. </li><li> Cría por parejas normalmente se establece por la tarde después de comer. </li><li> Montar el tanque de cría y llenarlo con agua del sistema envejecido. </li><li> Transferir una hembra y un macho, a lados opuestos del tanque de cría. Las hembras se pueden distinguir de los hombres, debido a su bajo vientre más grande. Los hombres también se pueden distinguir de las hembras, ya que son más delgados y de color más oscuro que las hembras. Por otra parte, los machos tienen coloración más amarilla de la aleta anal en comparación con las mujeres (ver Figura 1). Cuando está en duda para el aspecto ovipositor en el pez cebra hembra (ver Figura 4). </li><li> Eliminar el divisor de la mañana siguiente, poco después de la aparición de la luz. Permitir el acoplamiento a ocurrir en reposo durante 20 min o hasta que un número suficiente de embriones se colocan en la parte inferior del tanque. </li><li> Después de la reproducción,volver a los peces a sus tanques. Recoge los huevos usando un colador. </li><li> Lavar los embriones a fondo con agua del sistema. </li><li> Transferir los embriones a una placa de Petri de un enjuague del filtro con medio de embrión; tcc EM3 (NaCl, 13,7 mM; KCl, 0,54 mM; MgSO 4, 1,0 mM; CaCl 2, 1,3 mM, Na 2 HPO 4, 0,025 mM; KH 2 PO 4, 0,044 mM; NaHCO 3, 4,2 mM). </li><li> Los embriones pueden ser observados bajo el microscopio. Los huevos fertilizados se separan entonces de los huevos no fertilizados utilizando una aguja y una pipeta (véase la Figura 3). </li></ol> 4. Cría de larvas <ol><li> Los huevos fertilizados se mantuvieron en un incubador (~ 28,5 ° C) durante 72 horas hasta que las larvas se incuban. </li><li> Ahora son las larvas del corion y nadar libremente están listos para transferirse a una pecera principal. Las larvas necesitan ser alimentados de 5 días después de la fertilización (dpf) y se mantienen en medio de embriones (composición descrita en elParte 3, 10) o sistema de agua. Las larvas pueden mantenerse en placas redondas con ~ 50% o más de agua en el mismo cambia sobre una base diaria. El cambio de agua debe incluir la eliminación de larvas muertas o enfermas y cualquier otros desechos. </li><li> Transferir las larvas suavemente en un tanque que contiene un deflector de tamaño pequeño (de alrededor de 300-400 micras). Larvas muertas y enfermas deberán ser retirados y unos pocos mililitros de agua se debe agregar lentamente sobre una base diaria. </li><li> Después de 14 días, los tanques de larvas puede ser archivado en el sistema, y ​​se suministra con una pequeña corriente de agua ciclismo (1-2 gotas por segundo). Como las larvas crecen, el flujo de agua puede ser aumentado. Diferentes tamaños de deflectores se pueden utilizar dependiendo del tamaño de las larvas (por ejemplo, tamaño deflector 300-400, 500, 700-750, y micras 1000) y un deflector de plástico normal se debe utilizar para los peces adultos. </li><li> Por lo general, tarda de 3 meses para que los embriones se conviertan en adultos sexualmente maduros. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

El pez cebra se originan en el río Ganges en el norte de la India y se están volviendo populares en la investigación, tanto en su estado adulto como larvario 2, revisado por Spence et al. 3. Pez cebra tienen varias ventajas sobre otros modelos animales tales como alta fecundidad, la facilidad de mantenimiento, limpieza óptico de embriones, el desarrollo embrionario rápida y bajo costo de mantenimiento. Son susceptibles de manipulación genética 6 y adecuado para la detección de drogas de alto rendimiento de 4,5. Su fertilización es externa que es ventajoso para su uso por los biólogos del desarrollo. Debido a estas características favorables, el pez cebra están ganando popularidad en genética 7, 8 farmacológico, y la investigación del comportamiento 9,10. Hay una serie de retos para el mantenimiento de una instalación de pez cebra y la cría de pez cebra para obtener embriones. Aquí, describimos nuestras experiencias y recomendaciones para hacer frente a estos retos y oSQUEMA un protocolo para el mantenimiento del sistema, la alimentación y crianza de las larvas. Mantenimiento del sistema Para mantener el pez cebra en un estado saludable, es importante proporcionarles un entorno limpio en un sistema de acuario que funcione correctamente. Una parte importante de este sistema está cambiando filtros regularmente de modo que todos los tanques de recibir el flujo de agua adecuado y agua limpia. Es de vital importancia para evitar fallos en el suministro de agua para cada tanque de ciclismo debido a las tuberías del sistema bloqueado. Los tubos se pueden limpiar con un flujo mayor que la presión normal del agua y si el bloqueo se produce. Idealmente, alrededor de 10% de agua del sistema debe ser reemplazado a diario para mantener la buena calidad del agua. Alternativamente, el agua puede ser reemplazado mientras se cambia el cartucho o filtro de carbono. Esto asegura que la suciedad depositada en las tuberías que conectan estos filtros se retira. La calidad del agua debe ser confirmada en una base regular. Parámetros tales como la alcalinidad, pH, temperatUre, dureza, amoniaco, oxígeno disuelto, salinidad, conductividad y deben ser considerados como factores importantes en la representación de la calidad del agua del sistema (véase la Tabla 2 para más detalles). En el nitrato menos, pH, y temperatura deben ser monitorizados sobre una base regular para asegurar buena calidad de agua para el pez cebra vivienda. Ideal nitrato (NO 3 -) niveles son &lt;50 mg / L 11, de ser alto de estos niveles puede ser reducido mediante la sustitución del agua en el sistema de circulación con el sistema de agua fresca. En ocasiones, los filtros no se ajustan bien y fuga por lo que se recomienda comprobar que no haya fugas después de un cambio de filtro. Si el flujo de agua desde el depósito principal está bloqueada o bien después de cambiar la bomba de agua o de cambiar un filtro, el flujo de agua puede ser restituido por aflojar o retirar el filtro durante unos segundos para liberar cualquier vacío que se genera en las tuberías. El tiempo requerido para cambiar los filtros puede variar dependiendo de varios factores tales como carga total o biológican el sistema, la limpieza de los filtros de otros, y la suciedad depositada en las tuberías. Por lo tanto, los filtros deben cambiarse inmediatamente si están sucias o si todos los tanques no están recibiendo el suministro de agua adecuado. También se recomienda que la red de pesca puede limpiar con 70% de etanol, y se enjuagaron en agua para descontaminar, y se deja secar antes de volver a utilizarlos. Secado asegura la evaporación de etanol que de otro modo es tóxico para los peces. La mayoría de los sistemas de uso de pez cebra de-agua clorada del grifo, sin embargo, algunos sistemas utilizan agua desionizada. Es importante mantener la conductividad del agua del sistema de entre 300 y 1.500 mS ~ ya que esto reduce la energía que el pez necesita para mantener las sales del cuerpo. Por lo tanto, el pez cebra no se puede mantener en agua desionizada a menos sales se añaden a mantener los niveles de conductividad óptima. Existe el riesgo de posibles altas concentraciones de cobre en el agua del sistema si se utiliza agua corriente, porque el filtro de carbón no eliminar el cobre. Por lo tanto, uSERS debe comprobar si las concentraciones de cobre y tuberías de cobre evitar en lo posible. Alimentación Pez cebra nunca deben ser sobrealimentadas ya que esto puede aumentar el nivel de nitrato en el agua, afectando posiblemente su crianza 11 o viabilidad, ya que algunos peces pueden morir debido a comer en exceso. Se recomienda no proporcionar más alimentos durante cualquier alimentación de un que un tanque de peces puede terminar en 10 minutos. Es muy importante para eliminar la sal de la salmuera camarones antes de alimentar a los peces cebra como la concentración de exceso de sal causa la muerte. Si más huevos de pez cebra son necesarios, los peces pueden ser alimentados tres veces al día. Limpieza de los tanques de peces reproductores diario también mejora los niveles de producción de huevos. Cuando se alimenta en los sistemas de hábitats acuáticos que solemos apagar la bomba de agua y bomba de aire para permitir a los peces a comer la comida durante 10 min. Esto disminuye la cantidad de comida que se lava en los filtros. Sin embargo, los usuarios deben tener cuidado de remascua para encender las bombas de nuevo más tarde. Cría El pez cebra son por lo general en condiciones de cría óptima entre ~ 3 y 18 meses de edad. Por parejas de cría no debe realizarse durante dos días consecutivos 11, sin embargo, en el tanque de cría se puede realizar a diario como un tanque puede contener muchos peces que reduce la posibilidad de que el mismo par de peces que se crían durante dos días en una fila. El servicio debe de llevarse a cabo a intervalos regulares, incluso si los huevos no son necesarios. Este proceso asegurará que el ciclo de reproducción de los peces se mantiene. Se recomienda que haya más mujeres que hombres en una cría de puesta a punto. Pez cebra macho cambiar sus parejas femeninas en un 12 a diario que apoya esta recomendación. Además, en nuestro laboratorio que inicialmente tuvieron problemas con la cría, sin embargo, con más mujeres que hombres en la crianza de configuración ayudado a resolver el problema. Por otra parte, la alimentación con una proteína de alto content dieta y artemia dos o tres veces al día, mezclar el pescado de los tanques de padres diferentes (distintos), manteniendo la temperatura de la cría de configuración entre 27 y 28 ° C, y apretando los vientres de las hembras con ovarios tubos bloqueados utilizando suave masaje mejora aún más la producción de huevos. Se recomienda llevar un registro de las líneas de peces / origen para evitar la endogamia entre hermanos. Esto mejora la producción de embriones. Llevar un registro del número de embriones fijados por los peces de cada tanque también es recomendable. Esto ayuda a mantener un registro de los mejores tanques de cría de peces y tomando medidas para mejorar la reproducción en los peces no poner huevos. El aumento de las larvas La alimentación de las larvas debe comenzar a partir del 5 dpf (fertilización días después). Las larvas jóvenes pueden ser alimentados con comida seca de ~ 100 micras de tamaño (por ejemplo, ZM100) o alimentos vivos tales como paramecio y rotíferos (que estimula el crecimiento). El tamaño de la comida lenta se puede aumentara 200 micras (por ejemplo ZM200) o 300/400 micras (por ejemplo ZM300). Una población de peces adultos debe estar alrededor de 7.6 peces por litro de agua. Esta práctica se recomienda para un mejor mantenimiento de DBO (demanda biológica de oxígeno) a los tanques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td> El pez cebra sistema de circulación </td><td> Hábitats Acuáticos, USA </td><td> Acab independiente, sistemas de sobremesa </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de Sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Pez dispensador de comida / alimentador alimento seco </td><td> Hábitats Acuáticos, USA </td><td> AH19 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> SZX12 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentos secos </td><td> ZM comida de pescado, Reino Unido </td><td> ZM100, ZM200, ZM300 </td><td></td></tr><tr><td> Huevos de artemia </td><td> Salt Creek, Inc., EE.UU. </td><td> Premium Grade </td><td></td></tr><tr><td> En-tanque criadores</td><td> Hábitats Acuáticos, USA </td><td> ITSTS-A </td><td></td></tr><tr><td> Carbón activado </td><td> Penn-Plax Pro-cangrejo, EE.UU. </td><td> PBC3MF </td><td></td></tr><tr><td> Tanques de cría </td><td> Hábitats Acuáticos, USA </td><td> SBTANK (1L) Criador Tank-2 (2L) </td><td></td></tr><tr><td> Red de sal marina </td><td> Red de sal marina, EE.UU. </td><td> Tienda de mascotas local / <a href="http://www.redseafish.com" target="_blank">www.redseafish.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Filtros (Canister, almohadillas del filtro y UV) </td><td> Hábitats Acuáticos, USA </td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Siporax Medios </td><td> Hábitats Acuáticos, USA </td><td> BF 820 </td><td></td></tr><tr><td> Salmuera red camaronera </td><td> Hábitats Acuáticos, USA </td><td> BSN1 </td><td></td></tr><tr><td> Salmuera nacedora camarón </td><td> Hábitats Acuáticos, USA </td><td> BS252 </td><td></td></tr><tr><td> Pantallas </td><td> Hábitats Acuáticos, USA </td><td> <a href="http://www.aquatichabitats.com" target="_blank">aquatichabitats.com</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Tabla de reactivos y equipos específicos utilizados en este protocolo. </td></tr></tbody></table>

regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: an introduction

Este protocolo describe el cuidado regular y el mantenimiento de un laboratorio de pez cebra. Pez cebra están ganando popularidad en la genética, la investigación farmacológica y conductual. Como un vertebrado, la cuota de pez cebra considerable similitud de secuencia genética con los humanos y están siendo utilizados como un modelo animal para diversos estados de enfermedad humanos. Las ventajas de pez cebra en comparación con otros modelos de vertebrados comunes incluyen alta fecundidad, bajo costo de mantenimiento, los embriones transparentes, y un rápido desarrollo. Debido al calor del interés por la investigación pez cebra, la necesidad de establecer y mantener un centro de pez cebra vivienda productiva también está aumentando. Aunque la literatura está disponible para el mantenimiento de un laboratorio de pez cebra, un protocolo de vídeo concisa que falta. Este video ilustra el protocolo para la vivienda, la alimentación, la reproducción y la crianza de larvas de pez cebra. Este proceso ayudará a los investigadores a entender el comportamiento natural y las condiciones óptimas de zebrafish cría y por lo tanto solucionar problemas experimentales que se originan en las condiciones de cría de peces. Este protocolo será de gran ayuda para los investigadores planean establecer un laboratorio de pez cebra, y también a los estudiantes graduados que tengan intención de utilizar el pez cebra como modelo animal.

Vivienda pez cebra y el mantenimiento es más fácil y más barato que los modelos de roedores tradicionales. Varios miles de pez cebra puede ser alojado en un pequeño laboratorio. Como resultado de este protocolo, los investigadores serán capaces de manejar una instalación de pez cebra que proporcionará condiciones saludables para el pez cebra. Además, las ilustraciones siguientes ayudará a identificar los huevos fertilizados, el pez cebra adultos, y su comida. Una ilustración de un pez cebra macho (Figura 1A) y el pez cebra hembra (Figura 1B y 1C) se muestra para ayudar a los investigadores distinguir entre un macho y una hembra de pez cebra para la cría de propósito Figura 2 representa una vista microscópica de;. Artemias a 12X (figura 2A), un camarón de salmuera solo a 90X (Figura 2B), y un óvulo no fertilizado en salmuera camarón 90X (Figura 2 C). Esto le ayudará a entender la diferencia entre camarones de salmuera no fertilizados y fertilizados para proper fines de alimentación animal. Los huevos fertilizados y sin fertilizar se muestra en la Figura 3. Figura 3A ilustra una vista microscópica de embriones fertilizados y no fertilizados. Embriones fertilizados son generalmente opacos y / o con ruptura de célula (s) en el interior del corion (negro flecha) mientras que los embriones fertilizados aparece intacta y creciente al estado de división celular siguiente (para la lectura detallada de las diferentes etapas de embriones de pez cebra ver 1). Superior vista ampliación de una figura fecundado un óvulo no fertilizado y se muestra en la Figura 3B y 3C, respectivamente. 4 ilustra ovipositor un pez cebra hembra para ayudar a los investigadores distinguir entre un macho y una hembra de pez cebra. Varios críticos problemas que se pueden producir en un laboratorio de pez cebra incluyen el bloqueo del suministro de agua a individuo / todos los tanques del sistema de vivienda, la calidad deficiente del agua y las fugas en las tuberías o reservorios del sistema de circulación. Además,problemas en la obtención de embriones de cría podría ser otro motivo de preocupación. Solución de problemas de estas cuestiones se discuten a continuación. <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Una ilustración de un pez cebra macho (A) y hembra pez cebra (B, C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Una vista microscópica de salmuera camarones a 12X (A), un camarón de salmuera sola en 90X (B), y un huevo no fertilizado en el camarón de salmuera 90X (C). <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Vista microscópica (16X) de huevos fertilizados y sin fertilizar, donde sólo dos huevos no fertilizados, los huevos no fertilizados se indican con flechas negras (A). Mayor aumentoVer (90X) de un. fertilizado (B) y un óvulo no fertilizado (C) <img src="/files/ftp_upload/4196/4196fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Un pez cebra hembra ovipositor (indicado con la flecha negro) Ilustración. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Parámetro </td><td fo:width="3in"> Rango óptimo </td></tr><tr><td> Alcalinidad </td><td> 50-150 mg / L CaCO 3 </td></tr><tr><td> pH </td><td> 06.08 a 07.05 (6,0-8,5 tolerada) </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> 26-28.5 ° C </td></tr><tr><td> Dureza </td><td> 50-100 mg / L CaCO 3 </td></tr><tr><td> El amoníaco no ionizado </td><td> &lt;0,02 mg / L </td></tr><tr><td> El nitrato (NO 3 -) </td><td> &lt;50 mg / L </td></tr><tr><td> Nitrito (NO 2 -) </td><td> &lt;0,1 mg / L </td></tr><tr><td> El oxígeno disuelto </td><td> &gt; 6,0 mg / L </td></tr><tr><td> Salinidad </td><td> 0.5-1 g / L </td></tr><tr><td> Conductividad </td><td> 300 -1 500 mS </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Parámetros de calidad del agua. Parámetros de calidad del agua. Rango óptimo de los parámetros ambientales en el acuario de pez cebra 11.

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Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Este protocolo describe un mantenimiento regular y el cuidado para mantener las condiciones óptimas para la cría de peces cebra. El vídeo muestra el protocolo para el mantenimiento del sistema, la vivienda, la alimentación, la reproducción, y la crianza de larvas de pez cebra.

Cuidado y mantenimiento regulares de un pez cebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorio: Introducción

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

88.4K vistas.  Edith Cowan University. Este protocolo describe un mantenimiento regular y el cuidado para mantener las condiciones óptimas para la cría de peces cebra. El vídeo muestra el protocolo para el mantenimiento del sistema, la vivienda, la alimentación, la reproducción, y la crianza de larvas de pez cebra.

Video: Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

La disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en adultos de pez cebra ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Investigación

Biología

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

La disección del corazón en las larvas, juveniles y adultos de pez cebra, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Ensayo gasto energético

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

El mantenimiento de una<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Jaula Población

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Detección de ligandos estrogénica en productos de Cuidado Personal con una pantalla de estrógeno levadura optimizado para el laboratorio de enseñanza de pregrado

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

Crecimiento anaerobio y mantenimiento de líneas de células de mamífero

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Establecimiento y Mantenimiento de Cucarachas Americanas Gnotobiotic (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.