Name: high throughput danio rerio energy expenditure assay
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
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The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Nota: Este protocolo sigue las directrices de la Universidad de Arizona Oficina para la Realización responsable de la investigación y ha sido aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional 1. cría de pez cebra y mantenimiento de embriones <ol><li> Preparar E3 medio embrión 8. Hacer 60x solución madre, disolver 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, CaCl 2 5,8 g ● 2H 2 O, y 9,78 g de MgCl 2 ● 6H 2 O en 1,95 L ddiH 2 O. Ajustar el pH a 7,2 con NaOH y HCl Ajustar el volumen a 2 L utilizando ddiH 2 O. </li><li> Para preparar el medio embrión 1x E3, diluir 16,5 ml 60x acciones en 1 L ddiH20. Añadir 100 l 1% de azul de metileno. </li><li> Cría <ol><li> Casa Masculino y Femenino cría de valores (7 - 18 meses de edad) por separado para maximizar la fecundidad. </li><li> Apague las luces 1 - 2 horas antes del día anterior se desean huevos. Configurar el apareamiento (1 macho y 1 - 2 hembras) en la cjaulas Rossing anteriormente descritos 9. Cruce de jaulas permiten los huevos para escapar de la depredación a medida que pasan a través de la base perforada de la inserción tanque en el que se llevan a cabo los peces adultos. </li><li> Opcional:. Para la reproducción programada, (como sería necesario para estudios con morfolino inyección), separar el macho y las hembras por un divisor de plástico transparente, Eliminar a esta por la mañana para dar lugar a la colocación oportuna de los huevos y la fertilización. Para morfolino estudios, realizar cálculos de potencia para evaluar el número de peces embrionaria requerido por tratamiento. Sin una estimación de la magnitud del efecto o variación, un ensayo preliminar se puede ejecutar con un n = 8. </li></ol></li><li> Verter los huevos de la jaula de cruce en una placa de Petri (100 - 150 embriones / 10 cm placa de Petri). Permitir que los huevos se depositan en el fondo del plato y verter fuera del agua. Retire cualquier resto de agua utilizando una punta fina transferencia desechables pipeta. Añadir espalda medio E3 embrión hecho en el paso 1.1. </li><li> Hacer afpipeta desechable pulido cojo para el futuro de huevo y la transferencia de los peces. Con unas tijeras, corte una pipeta de transferencia desechable se graduó en la graduación de 0,25 ml. Para eliminar los bordes ásperos, esmalte de la llama de la punta de corte sobre un mechero Bunsen. </li><li> Mantener peces embrionaria hasta 4 días después de la fertilización (dpf) en 10 cm placas de Petri en medio de embrión de pez cebra E3 28.5 ○ C. Dos veces al día, use una llama pulido graduó pipeta de transferencia desechable para eliminar los huevos no fertilizados o embriones muertos (de apariencia blanca opaca). Una vez que cada día, sustituya medio embrión E3. Vierta medio embrión E3, eliminar el líquido restante utilizando una punta fina transferencia desechables pipeta, y añadir de nuevo precalentado (28.5 ○ C) medio embrión E3. </li></ol> 2. Prepare la solución de ensayo <ol><li> Preparar la solución de ensayo de acuerdo con la Tabla 1. solución de ensayo de filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 mM. Antes del ensayo de iniciación, calentar la solución de ensayo estéril en un 28,5 ○ Cbaño de agua. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> % del total </td><td> Volumen (l / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embrión Medio </td><td> 1,667 </td><td> 166.7 </td></tr><tr><td> Doble desionizada (ddi) H 2 0 </td><td> 96.233 </td><td> 9623.3 </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> NaOH 400 mM </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Medio de Ensayo 3. Realizar Ensayo <ol><li> Enjuague embriones de pez cebra 3 veces con medio de embrión E3 filtrada estéril. Combine todos los embriones de pez cebra viables desde el embrague en un vaso. Filtro estéril 75 ml medio embrión E3. Usando una punta fina transferencia desechables pipeta, remover la mayor cantidad de medio de embrión E3 a partir de los embriones de pez cebra como sea posible. Añadir volver 20 ml de medio embrión E3 filtrada estéril. Retire y reemplace medio embrión E3 3 veces. </li><li> Placa 1 pescado en cada uno de los 93 pozos de un negro de 96 pocillos se puso del lado clara placa inferior. Transferir el pescado embrionaria a la placa mediante la captura individualmente un embrión dentro de una llama pulida pipeta de transferencia de plástico desechable se graduó (paso 1.5) y expulsar suavemente en el pozo. Traslado medio embrión E3 tomado del vaso que contiene el pescado se enjuaga en los 3 pozos en blanco. Esto asegura que los pozos en blanco han sido expuestas a la misma agua exacta que los pocillos que contienen pescado. Ambos pozos que contienen los peces y los pozos en blanco debe ser de al menos ½ completo (200 l) en la conclusión de este paso. </li><li> Reemplace medio embrión E3 con una solución de ensayo en los 96 pozos, incluyendo pozos en blanco. Este paso se debe realizar 1 columna a la vez para cada una de las 12 columnas en una placa de 96 pocillos. Usando una multa punta desechable transfer pipeta, retire medio de embrión E3 a partir de cada pocillo en una columna de la placa (8 pocillos). Tenga cuidado de no tocar el embrión de pez cebra. Añadir 300 l de solución de ensayo a cada pocillo de la que se elimina el agua. Repita la eliminación de medio de embrión E3 y el reemplazo con una solución de ensayo para todas las 12 columnas de la placa. </li><li> Opcional: Para probar el cambio de tasa metabólica en respuesta a un compuesto, hacer una solución que es 100 veces (100X) la concentración de tratamiento deseado. De nota, asegúrese de que la solución 100x no supere el 10% de DMSO para limitar la concentración final de DMSO a no más de 0,1%. Añadir 3 l de la solución 100x para cada uno de los pozos de tratamiento. NOTA: Realizar cálculos de potencia para evaluar el número de pozos de tratamiento. Sin embargo, sin una estimación de la magnitud de la respuesta o variación, un ensayo preliminar se puede ejecutar en 8 compuesto tratado y 8 pocillos de control tratados con el vehículo que contienen pescado. <ol><li> Añadir 3 l de control del vehículo al control (sin drug tratamiento) pozos que contienen peces. Para asegurar que la respuesta fluorescente compuesto es un resultado de las acciones dentro de los peces, aplicar tratamientos farmacológicos y de vehículos para 3 pozos en blanco en una placa de 96 pocillos. </li></ol></li><li> Leer pescado plato lleno de lector de placas fluorescente con la longitud de onda de excitación a 530 nm y longitud de onda de emisión a 590 nm. </li><li> Coloque la placa en la incubadora humidificado establece en 28,5 ○ C (mantener la placa en la oscuridad durante todo el ensayo para evitar photobleaching de la solución de ensayo). El ensayo se puede ejecutar para las duraciones de tiempo que van desde 1 hr a 24 hr. La duración del ensayo depende del objetivo del estudio. Para probar la respuesta a una corta compuesto no estable actuación corta duración puede ser más adecuado. Sin embargo, para las pruebas compuesto estable o pruebas de efectos genéticos, es preferible para explotar las ventajas asociadas con la señal acumulativa maximizar la duración del ensayo. </li><li> En un punto de tiempo predeterminado (consulte el paso 3.6 para ayudar a determinar el momento)leer la fluorescencia de la placa de peces llenos de nuevo con la misma configuración que el paso 3.5. </li></ol> 4. Evaluar el cambio relativo en la fluorescencia asociada con el tratamiento <ol><li> Calcular cambio en la fluorescencia de cada pocillo restando la fluorescencia en el tiempo 0 de la fluorescencia a la conclusión del estudio. Wells sin peces (espacios) deben tener valores cercanos a 0, muy por debajo de los valores de los pozos que contienen peces. Cambio en la fluorescencia = Fluorescencia en la conclusión - de fluorescencia en el tiempo 0 </li><li> Para determinar el cambio relativo en la fluorescencia, calcular el cambio medio en la fluorescencia de los pocillos de control luego dividen el cambio en la fluorescencia de cada pocillo por la variación media de la fluorescencia de los pocillos de control. Es de destacar que los controles podrían ser tanto los controles del vehículo o controles genéticos. <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

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	<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li><li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter/driver+genes+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+engineering.">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545 (2014).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile.">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li><li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish.">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li><li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals.">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li><li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish.">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish, A practical approach. , (2002).</li><li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature.">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li><li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity.">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li><li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost.">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li><li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner.">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li><li>Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li><li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening.">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549 (2012).</li><li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+obesogenic+test:+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity.">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

La contaminación con bacterias u hongos limitará en gran medida la aplicación de este ensayo. El azul de metileno en el medio embrión E3 limita la posibilidad de contaminación por hongos. A lo largo del embrión criando es fundamental que se tenga cuidado para eliminar embriones muertos dos veces al día. Además, es esencial para enjuagar bien los embriones con medio de embrión E3 estéril en el día de la iniciación del ensayo. Estos 2 pasos limitan el potencial para la contaminación bacteriana de los embrione...

El ratón es actualmente el modelo predominante para la investigación de la obesidad. El intervalo generacional corto y herramientas genéticas disponibles en el ratón han sido sin igual hasta la fecha. Sin embargo, el pez cebra también tiene un intervalo de generación corto (3 - 4 meses) y supera incluso el ratón en la facilidad de manipulación genética 1,2. El pez cebra mantiene cerca del 90% de los genes de mamíferos, mientras que muy por encima del ratón en el número de para su uso en pantallas genéticas y drogas 3 potencial y descendencia. Para aprovechar el potencial del modelo de pez cebra para el estudio de la obesidad, los ensayos deben ser desarrollados para investigar los factores que influyen en la regulación del peso corporal, incluyendo el gasto de energía. Como metabolitos se procesan a través de β-oxidación y el oxígeno ciclo de ácido tricarboxílico se consume NADH y 2 se produce. Por lo tanto, NADH 2 es un indicador directo del flujo de metabolitos a través de las vías metabólicas de oxidación (metabolito). En poikilotherms, H + a través de fugas de la membrana mitocondrial interna, que desacopla la oxidación de NADH 2 la síntesis de ATP, es 4 - 5 veces más baja que en homeotermos 4. En consecuencia, en el pez cebra NADH 2 está muy estrechamente vinculada a la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. En este documento, se describe un ensayo que mide NADH 2 la producción en larvas de pez cebra como un proxy para el gasto de energía 5. El consumo de oxígeno es el estándar de oro para medir el gasto de energía. Sin embargo, para aprovechar al máximo el alto potencial de rendimiento del pez cebra, los ensayos de gasto de energía deben ser susceptibles de alto rendimiento. Sistemas de consumo de oxígeno que dependen de una cámara cerrada sistema de circulación están limitadas en el rendimiento por el número de cámaras disponibles 6. Abrir aire consumo de O 2 / CO 2 ensayos de producción también se han aplicado en el pez cebra 5,7. Estos al aire libre de 96 pocillos placa basesistemas d son susceptibles de alto rendimiento. Desafortunadamente, el intercambio de gases con el medio ambiente limita la sensibilidad de estos ensayos. Hemos publicado recientemente la aplicación de un ensayo que monitoriza NADH 2 utilizando el indicador redox alamarBlue 5. Este ensayo supera las limitaciones en el rendimiento y la sensibilidad común a los análisis de consumo de oxígeno en el pez cebra. El pez cebra se está convirtiendo en un modelo cada vez más importante para el estudio de toda la homeostasis de la energía del cuerpo. En parte, porque el pez cebra son susceptibles de uso en pantallas adelante genéticos y las pantallas de drogas. Por otra parte, dirigida manipulación genética, incluyendo caída y knock-in, se puede aplicar rápidamente. Hemos demostrado anteriormente que este ensayo se puede combinar con la aplicación del fármaco bañera y desmontables genética o knockout para identificar compuestos y genes que alteran la tasa metabólica 5. Por otra parte, este ensayo está diseñado para explotar las ventajas de alto rendimiento inherentes al pez cebra. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fine Tip DisposableTransfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Black sided clear bottom 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Manufactured by E&amp;amp;K Scientific Products Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput danio rerio energy expenditure assay

El pez cebra son un importante organismo modelo con ventajas inherentes que tienen el potencial de hacer que el pez cebra un modelo ampliamente aplicado para el estudio de la homeostasis energética y la obesidad. El pequeño tamaño del pez cebra permite ensayos con embriones que se llevan a cabo en un formato de placa de 96 o 384 pocillos, tecnologías basadas Morfolino y CRISPR promueven facilidad de manipulación genética, y el tratamiento de drogas mediante la aplicación del baño es viable. Por otra parte, el pez cebra son ideales para pantallas adelante genéticos que permitan la novela de descubrimiento de genes. Dada la relativa novedad del pez cebra como modelo para la obesidad, es necesario desarrollar herramientas que explotan plenamente estos beneficios. En este documento, se describe un método para medir el gasto de energía en miles de pez cebra embrionarias simultáneamente. Hemos desarrollado una plataforma de microplacas animal completamente en que utilizamos placas de 96 pocillos para aislar peces individuales y evaluar la producción acumulada NADH 2 mediante el cultivo de células viabilidad re disponible en el mercadoagente alamarBlue. En poiquilotermos la relación entre NADH 2 la producción y el gasto de energía está estrechamente vinculado. Este ensayo gasto de energía crea el potencial para cribar rápidamente manipulaciones farmacológicas o genéticas que alteran directamente el gasto de energía o alteran la respuesta a un fármaco aplicado (por ejemplo, sensibilizadores a la insulina).

Solución de ensayo no aumenta la fluorescencia en ausencia de peces embrionario (Figura 1). Sin embargo, el ensayo es altamente sensible a pequeños cambios en la tasa metabólica dentro del pozo. Un solo pez dentro de un pozo crea una señal significativamente diferente de los pozos en blanco dentro de 1 h (P &lt;0,0001). La Figura 2 proporciona una representación visual de las señales generadas por los peces embrionario después de 24 h de incubación. Para el propósito de esta im...

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High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Ensayo gasto energético

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

12.6K vistas.  Vanderbilt University Medical Center. Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery. 

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Alimentación dieta alta en grasas y alto rendimiento Triacylglyceride ensayo en Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Investigación

Genética

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamiento

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Un ensayo de alimentador de microplacas de alto rendimiento para la cuantificación del consumo en Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

Ensayo de alto rendimiento para medir la ingesta de alimentos y la esperanza de vida de Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autor destacado: Explorando la relación entre la lipotoxicidad y la HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Ensayo de Alto Rendimiento para el Examen de Preferencias de la puesta de huevos individual<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neurociencias

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

Un ensayo rápido de preferencia alimentaria en Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

High Throughput

Resumen

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Alimentación dieta alta en grasas y alto rendimiento Triacylglyceride ensayo en Drosophila Melanogaster

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Un ensayo de alimentador de microplacas de alto rendimiento para la cuantificación del consumo en Drosophila

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

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Ensayo de Alto Rendimiento para el Examen de Preferencias de la puesta de huevos individual

Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

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La medición de la tasa metabólica en