<p class="jove_content"&gt; Biz mükemmel hayvancılık için Nadeshda Wolf, Nadine Eschen ve Susanne Delong teşekkür ederiz. CW Helmholtz programın bir doktora bursu ile desteklenmiştir<em&gt; BioInterfaces</em&gt; Uluslararası enstitü &#39;(BIFIGS). Daha fazla destek CG 7. Avrupa Topluluğu Çerçeve Programı (PIRG07-GA-2010-267552) içinde KIT-RISC hibe ile ve Marie Curie Uluslararası Yeniden Entegrasyon Grant tarafından sağlandı. Marie Curie İlk Eğitim Ağı (238.821) - AHS (Karaciğer ve Pankreas Geliştirme ve Hastalık Biyoloji) BOLD tarafından desteklenmiştir. UL Dopaminet FP7 (Yedinci Çerçeve Programı) (223.744) tarafından desteklenmiştir.</p&gt;

1. Hayvan Taşıma Çene tahlil kullanımı 3 dpf&#39;e larva homozigot çift transgenik cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 ve AB (yabani tip) balıklar arasında grup çiftleşmelerin doğan için. Doğal yumurtlama tarafından embriyosu toplamak ve 29 bunları yükseltmek ° Petri kaplarında E3 ortamda C (5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4 ve mavi% 0.1 metilen, pH 7.0 ile dengelenmiş). Bu plaka başına 50-70 geçmeyen embriyo yoğunluğunu korumak için gereklidir. 2. Larva Sıralama Floresan muhabiri ifadesi, spontan inflamasyon ve uygun yaşa bağlı gelişim için bir floresan stereoskop altındaki tüm larva kontrol edin. 3. Eleme Orta Hazırlama (Daima taze hazırlamak) DMSO (1% final) ve MS222 (0.05 g / l) ile desteklenmiş metilen mavi olmadan E3 orta hazırlayın. 4. CuSO4Hazırlama (Daima taze hazırlamak) İlk CuSO 4 tarttın (M r = 159.6 g / mol) dH ve 20 mM stok solüsyon hazırlanır 2 O. E3/DMSO (% 1) / MS-222 120 uM CuSO 4 çalışma çözeltisi (20 mM stok çözeltisinden) hazırlayın. Işıktan CuSO 4 çözümü koruyun. 5.. 384-iyi Plaka Hazırlama (Greiner 384 Şey Mikroplaka) Bir ters pipetle her oyuğa E3/DMSO (% 1) / MS-222 ile 20 ul ön-ekleyin. Artan bir pipet ucu delik herhangi bir yaralama maruz kalmadan dikkatli embriyoların işlemek için gerekli olduğunu, bu delik 2 mm uç kesim tarafından yapılır. Her iyi (tedavi edilmemiş kontrol için 84 ul) orta ve 74 ul tek larva aktarın. Gerekirse, ayrıca içinde bir yanal konuma yönlendirmeye larvalar, esnek bir Eppendorf Microloader pipet ucu (; 5242 956,003 Eppendorf) kullanılarak. Bir robot sıvı ile bütün Aşağıdaki sıvı taşıma adımları gerçekleştirinlarvaların hepsi eşzamanlı tedavi sağlamak için iş istasyonu taşıma. 6. İlaç Tedavisi Aşağı pipetleme tarafından ilaç stok plaka bileşiklerin 5 kez karıştırın. Her bir kuyuya 7.5x ilaç stokunun plakası 16 ul ekleyin ve 5 kez karıştırın. Larva yaralanmasını önlemek ve 10 ul / s orta dağıtmak için kuyu içinde ucu konumunu ayarlayın. De içinde ilacın homojen dağılımını sağlamak için kuyu orta 4 kez karıştırın. 7. Kuluçka 29 1 saat için tarama plakası inkübe ° C ışıktan yanı CuSO 4 gibi bileşiklerin korumak için alüminyum folyo ile kaplı. 8. Kimyasal Yaralama Negatif kontrol, mix 4 kez hariç her kuyuya 120 mM CuSO 4 çalışma çözeltisi 10 ul ekleyin ve 29 1 saat boyunca tekrar inkübe ° C 9. Yıkama Bana 80 ul çıkarın ve alışverişi<html> her birinden fenoksimetilpenisilin de iki kez (20 ul adımlarla) bileşikleri kaldırmak ve CuSO ila 4 seviyesindedir. 10. Görüntü Alma 90 dakika sonra ilk bakır tedavisi: bir ters otomatik mikroskobu (Olympus tarama ^ R yani) görüntü alımı başlatabilirsiniz. Sağ ve sol posterior lateral hattı neuromasts görünür olması için ilk z seviyesini ayarlayın. Görüntü her yanı bir kez kanallar aydınlık saatte, 4 odak düzlemleri (50 mikron mesafe) Cy3 ve GFP 4x nesnel (NA = 0.13) kullanarak. Görüntü ve veri işleme ile ilgili ek bilgiler talep üzerine mevcuttur. 11. Görüntü İşleme 1. Sıralama Veri Ham görüntüleri bizim özel LabView yazılımı komut ile işlenir. Görüntü işleme hattında ilk operasyon kanalı, iyi ve zaman noktası bilgilerini tarafından mikroskop oluşturulan veri klasörü ham görüntülerin sıralama edilir. ove_step &quot;&gt; 2. Genişletilmiş odak Daha sonra yazılım kanalların her biri için 4 odak düzlemleri uzanan odak görüntüler oluşturur. 3. RGB-bindirme Son bir adım olarak 3 kanal arasından genişletilmiş odak görüntüleri son RGB-bindirme görüntüsüne yol için birleştirilir. 4. Otomatik algılama neuromast Bir örüntü tanıma aracı (LabView Rapid IA prototip aracı) RGB bindirme görüntüleri içinde neuromasts tanımlayan ve neuromasts etrafında bir ilgi ampirik olarak tanımlanan alanı oluşturur. 5.. Niceleme Yaralı neuromasts çevreyi ilgilendiren ampirik olarak tanımlanan alan içinde kırmızı floresan lökositlerin (kırmızı piksel olarak yansıyan) l eukocytes (Paol) tarafından ccupied p ercent bir rea o bir ilköğretim okuma sonuçlanan puanlanır. Ortalama 95,27 ±% 2.11 (FDA1) ve 95,12 ± AçıkKuyular (larva) ve% 1.56 (FDA2) doğru tespit edilmiş ve daha sonra daha fazla veri işleme tabi tutulmuştur. Ham veri çıkışı (her bir tespit için neuromast Paol) bir txt dosyası saklanır ve daha fazla ham verilerin işlenmesi MATLAB komut için veri girişi olarak hizmet vermektedir. 12. Veri İşleme 1. IMAPS Bir renk kodu ham veri çıkışı Paol grafiksel görselleştirme bireysel deneyler başarı değerlendirilmesi sözde inflamasyon haritaları (IMAPS) (Şekil 2) ile gerçekleştirilebilir. Parlak yeşil, yüksek bir başlangıç ​​inflamatuvar indeks yansıtır; siyah bir inflamasyon gösterir. Bu hızlı bakış sonra daha fazla veri analizleri dahil edilebilir başarısız deneyler, hızlı tespiti için izin verir. 2. Kontrollerin ortalama Her deneysel plaka yansıtan 320 bileşikler içerirtek bir veri sırasıyla, bileşik ve zaman noktası yanı sıra 32 pozitif ve negatif kontrollerin başına gelin. 32 kontrol çoğaltır ortalama ve standart sapması hesaplanır vardır. Kontroller için 2 standart sapma içinde, sadece veri noktaları dahildir. 3. Normalleştirme Normalizasyon tablo analiz yapılır. Negatif kontrol olmak DMSO ortalama değeri, 0 olarak ayarlanır ve bakır denetimi için en yüksek ortalama Paol pozitif ve negatif kontrol arasındaki maksimum fark 1 olarak ayarlanır, böylece 1 olarak ayarlanır. Her bir bileşiğin Paol doğrusal enterpolasyon veya deneysel plaka üzerinde ilgili denetimlere extrapolated. 4. Final okuma-out: İnflamatuar endeksi Yeterli tekrarlanan deneyler (yani 15) yapılmıştır sonra, tekrarında deneyler normalize ham veri okuma-out son bir sonuçlanan ortalaması alınır - inflamatuarindex. Bakır kontrol ilk inflamatuvar indeks zaman sıfır noktası için% 100 ile başlar ve görüntü alımı başlangıç ​​zamanı (90 dakika ilk bakır tedavi sonrası) ile doğrudan ilintilidir. 5.. Monoton üstel regresyon uydurma Zamanla iltihap çözünürlüğü dolayı biz kullanarak ilk iltihabı doğru monoton üstel doğrusal olmayan regresyon uydurma gerçekleştirmek <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> - Bir 0 t = 0 azından başlangıçtaki tepkisi için bir ölçüsü olan bir 1 saat boyunca büyüklükte eğimi ile ilgilidir. 6. 2-B özelliği alanı arsa (Şekil 4) Özelliği alanı oluşturmak için bir non-lineer regresyon uygulanır ve küme analizi, böylece farklı immün-modülatör kategoriler ilginç adaylar otomatik tanımlama (anti-inflammat sağlayan karakteristik bölgeye özelliği alanı bölerORY, anti-çözünürlük, pro-inflamatuar, pro-çözünürlük). Tüm bileşikler parametreler bir 0 ve bir 1 göre 2-D plot gösterilir. 13. Veri İşleme ve Depolama Bizim veri rutinleri adımları &#39;sonuçları yanı sıra kullanıcı 10 tarafından talep edilen detaylı bir görünüm işleme hızlı bir görüntünün genel ve veri sağlayarak, uyuşturucu ekranları görselleştirmek ve temsil etmek için web sayfası yaratmak taşıma. Diğer ilgili heterojen, biyolojik ve kimyasal veritabanlarına Yumuşak bağlantıları karşılaştırmalı ve roman çalışmaları 11 için değerli bir kaynak sağlamak için de entegre edilmiştir. Bu rutinleri tarafından, uygun veri standartları ve metainformation bu verilerin uzun süreli saklanması için ayarlanır. 14. Temsilcisi Sonuçlar Bir pilot ekran biz 640 oluşan bir kütüphane analiz FDA granül başlaması, ilerlemesi veya çözünürlüğü üzerindeki etkileri bilinen biyoaktif bileşikler onaylıocytic inflamatuvar yanıt. Biz farklı etki mekanizmaları göstergesi olabilir immun düzenleyici fenotipleri 4 tip sınıflandırılır gözlenen etkileri dayanarak: anti-inflamatuar (1), anti-çözünürlük (2), pro-inflamatuar (3) ve pro-çözünürlük (4) , olduğu bir tekdüze olmayan regresyon uydurma (e ao ​​+ Alx -) kaynaklanan parametreler bir 0 ve 1 ile ifade edilebilir başlangıç ​​enflamasyon doğru. Bir 1 eğrisinin eğimi karakterize ve böylece enflamasyon çözünürlüğü açıklar ise A 0 enflamatuvar yanıt büyüklüğünü temsil eder. 2-B özelliği alanı arsa (a 0 vs 1) tüm bileşikler gösteriliyor farklı immun düzenleyici kategorilerden vurdu adayları (Şekil 3) otomatik tanımlama sağlar. 640 bileşikler dışında 45% 50 veya daha az başlangıç ​​inflamatuvar indeks azaltarak önemli bir anti-inflamatuar etki yapmıştır. Thi içindekategorisindeki biz 6 bileşikler bizim yaklaşımın geçerliliğini doğrulayan non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID), farmakolojik sınıfına ait bulundu. Ancak, NSAİİ en güçlü anti-inflamatuar ilaçlar arasında değildir sırada yer aldı. Dışında NSAİİ ile biz örneğin Anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB), antibiyotik ve proton pompa inhibitörleri gibi birçok ek farmakolojik ilaç sınıfları bulundu. 7 bileşiklerin potansiyel yanlısı çözünürlük ilaçlar için ampirik olarak tanımlanan eşiği kriterlerini karşıladı. 18 ilaç, pozitif kontroller ile karşılaştırıldığında yaralandı neuromasts abartılı lökosit göçünün neden bir pro-inflamatuar etki yapmıştır. Sadece 2 bileşikleri inflamatuvar yanıt zamanında çözünürlük önledi. Pilot ekran Coul birçok hit adayların anti-enflamatuar etkisi (yukarıda belirtilen farmakolojik ilaç sınıfları örnek adayları)d sonraki ikincil Chin testler (veriler gösterilmemiştir) doza bağımlı bir şekilde teyit edilmesi. Birincil ekran olarak uygulanan 4 potansiyel yanlısı çözünürlüklü ilaçların yeniden test eylem belirtilen kipi teyit etmedi. İlaçların 2 daha yüksek konsantrasyonlar (20 uM) hafif bir anti-inflamatuar bir potansiyele sahip olduğunu. 20 uM - üçüncü bir ilacın 5 arasında değişen konsantrasyonlarda ilaç marjinal bir non-doza bağımlı bir anti-enflamatuar etkisi sergilemiştir. Dördüncü ilaç test edilen konsantrasyonlarda inflamatuvar yanıt üzerine etkisi yoktur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Şekil 1.. Chin testin Workflow. Bireysel bileşik transgenik cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larva (3 dpf) manuel 384-iyi microtiter plakalar dağıtılır. İlaçlar iyi bir Zephyr Kompakt Liquid Handling Workstation kullanarak her aynı anda eklenir. Tahlil plakaların 29 daha sonra 1 saat boyunca inkübe edilirler ° C. CuSO 4 ile muamele </sub&gt; 1 - h yaralanması verir ve akut bir enflamatuvar yanıt başlatır çözeltisi (10 uM son konsantrasyon). Son olarak, bakır çözümleri ve uyuşturucu yıkanır ve otomatik görüntü alma (ilk bakır tedaviden sonra 90 dakika) başlatılır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Şekil 2. . Kanalları sırasıyla Cy3 (solda) ve GFP (sağda), 50 mikron mesafelerde - Genel ham görüntülerin resmi rakam 4 odak düzlemleri (3 Z = 0) ham görüntüleri gösterir. Oklar (Z = 1,2) neuromasts etrafında kümelenmiş lökosit örnek neuromasts, ok uçları (Z = 1,2) noktasına işaret etmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Şekil 3. İnflamasyon Haritalar (IMAPS) bireysel denemelerin başarısı bir renk kodu inflamatuvar yanıt (ham veri) yansıtan IMAPS biçimde tespit edilebilir. Parlak yeşil, yüksek bir başlangıç ​​enflasyon yansıtır<html> mmatory yanıt; siyah bir inflamasyon gösterir timepoint 0 (solda) ve zaman noktası 5 (sağ) IMAPS açıkça bir deney daha fazla veri işleme dahil edilmelidir olmadığını göstermektedir.. DMSO kontrolü kuyular (satır 1 ve 12), koyu yeşil veya siyah görünür, oysa Bakır kontrolleri (satır 13 ve 24), yeşil tonlarda değişen gösterilmez. Zaman noktası 5 anda, inflamasyon hemen şimdi yeşil veya siyah koyu tonlarda gösterildiği, bakır kontrolleri giderildi. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Şekil 4. FDA 320 bileşiklerin 2-D özelliği, uzay komplo kütüphane ve kendi kontrolleri onayladı. Tüm bileşik kuyular doğrusal olmayan bir ortaya çıkan parametreleri 0 ve 1, dayalı bir 2-D özelliği, uzay komplo görüntülenebilir regresyon uydurma (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; ilk inflamasyon doğru / Denklem 1 &quot;&gt;). Bu özellik alanı arsa ilaçların göstergesi olabilir aşağıdaki 4 immün-modülatör kategorilerden birine ait ilginç adayların otomatik tanımlama sağlar eylem &#39;modu:. anti-inflamatuar (1), anti-çözünürlük (2), pro-inflamatuar (3) ve pro-çözünürlük (4) <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakamı görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<p class="jove_content"&gt; Burada bir bütün hayvan bağlamda immün-modülatör bileşiklerin tanımlanması sağlayan tam otomatik yüksek verimli tarama strateji sunmak. Akut inflamatuvar yanıt Böylece izin izleme<em&gt; In vivo</em&gt; Ve gerçek zamanlı olarak.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Biz yaraları lökosit istihdamı konusunda ilaç etkileri tamamen işlevsel bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi bağlamında göreli kolaylıkla okudu olabilir, çünkü ilaç keşfi veya ilaç repurposing çabaları için değerli bir model organizma olarak zebrabalıkları uygulamak için bir protokol sağlar. Bizim yaklaşım benzersiz bir avantaj kimyasal yaralama ve böylece yüksek verimlilik formatında otomasyon ve tarama izin, manuel larva manipülasyon eskimiş işler olmasıdır.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ayrıca, olumsuz veya toksik ilaç etkilerinin yanı sıra güçlü off-hedef etkilerini kolayca kurulum önerilen ile değerlendirilebilir. FDA onaylı kütüphane Ancak verilen tarama konsantrasyonlarda herhangi bir toksik bileşikler içermiyordu. Bununla birlikte, test kütüphanesi aynı farmakolojik madde sınıfı mevcut üyeleri arasında mevcut veri kümesi (örneğin immun düzenleyici fenotip, ilaç konsantrasyonu) karşılaştırmak için belirgin toksik bileşikler için öneriyoruz. Ihtiyaç olması aksi takdirde gelecek vaat eden bir immun düzenleyici fenotipi gencin bir madde ailesi, toksik üyeleri, düşük konsantrasyonlarda yeniden test edilebilir.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Biz onların uyguladığı immün-düzenleyici etkisine göre otomatik olarak kategorize ilaçların olasılığını göstermiştir. , Anti-inflamatuar bileşiklerin kategoriye ait olan ilaçların bağımsız deneyin, doza bağımlı bir şekilde etkileri uygulamakla bileşiklerin çoğu geçerliliği olabilir. Potansiyel yanlısı çözünürlük ilaçlar olarak saptadığı dört bileşikler şimdiye kadar gibi teyit edilemedi. Yalnızca çözünürlüğü etkilemeden hiçbir ilaç ana kadar literatürde tarif edilmiştir yana Aynı zamanda, bu özel bağışıklık modülatör kategorisi tarif etmek zor olduğunu gösterir. Bununla birlikte, 4 yeniden test ilaçların 3 molar yüksek konsantrasyonlarda anti-inflamatuar bir eğilimi göstermiştir. Ampirik olarak tanımlanan eşik kriterleri optimize yanlış pozitiflerin sayısını azaltmak için yardımcı olmalıdır.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ayrıca, sunulan teknik lökosit göç davranışlarını etkileyen genlerdeki mutasyonların belirlenmesi için kullanılmak üzere imkanı sunuyor<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Sonuç, önerilen yöntem kolaylaştırmak ve ilaç toleransı, toksisite, dozaj yanı sıra potansiyel off-hedef etkileri hakkında hazır bilgi ile potansiyel yeni lider yapılar verimli çabaları repurposing ilaç keşfi veya ilaç hızlandırabilir. Bu nedenle, ilaç geliştirme erken aşamalarında basit, maliyet ve zaman tasarrufu sağlayan bir strateji olarak hizmet vermektedir.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Bakır (II) sülfat susuz </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDA onaylı ilaç kütüphanesi </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 kuyucuk plakası olmayan bağlama, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> siyah </td></tr><tr><td> Olympus tarama ^ R </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Kompakt Liquid Handling İstasyonu </td><td> Kaliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

Zebrafish larvaları, küçük boyutu ve işleme ve gözlem göreceli olarak kolay ve aynı zamanda, bir verildiğinde sadece bileşiklerin banyo su ilave edilebilir ve kolaylıkla emilir olması nedeniyle küçük molekül ekranlarını 1,2 tüm hayvanlar için özellikle uygundurlar &lt;% 1 DMSO çözüm. Zebra balığı larva ve lökositlerin floresan proteinleri transgenik hatlarının durumu optik netlik nedeniyle, zebrabalıkları in vivo akut inflamatuvar yanıt izleme benzersiz bir avantaj sunuyoruz. Sonuç olarak, yüksek verimlilik ile immün-modülatör bileşiklerin tanımlanması amaçlayan yüksek içeriği küçük molekül ekranlar için zebrabalıkları kullanan, inflamasyon indüksiyon senaryoları fin dokusunda lokalize nickler örneğin bir sarısı yüzeyine yönlendirilmiş lazer hasarı düşündüren, 3-6 öne sürülmüştür embriyoların 7 veya tailfin amputasyon 3,5,6. Bu yöntemlerin ana dezavantajı, ancak idimanuel larva manipülasyon gereksinimi dolayısıyla yüksek verimli tarama önlenmesi, yaralama ikna etmek. Kimyasal yolla oluşan inflamasyon (Chin) testi 8 tanıtılması bu engelleri ortadan kaldırdı. Yaralama verdirdiler olduğundan kimyasal aynı anda tedavi edilebilir embriyo sayısı neredeyse sınırsızdır. Bakır sülfat ile zebrabalıkları larva Geçici tedavi seçici yanal çizgi sistemi ve yaralı neuromasts hızlı granülosit işe sonuçları saç hücrelerinde hücre ölümüne neden olur. Inflamatuvar yanıt bileşik transgenik cldnB :: GFP / lysC :: neuromast hücrelerin yanı sıra kırmızı floresan proteini etiketleme granülositler bir yeşil floresan proteinini ifade DsRED2 6,9 zebrabalıkları larvaları kullanılarak gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Hem yüksek-içeriği ve yüksek verimlilik analizleri izin verecek bir tarama stratejisi hazırlamak için biz robot sıvı taşıma ve kombine otomatik MICR tanıttıözel geliştirilen yazılım komut ile oscopy. Bu script yaralı yeşil floresan neuromasts çevreleyen ampirik tanımlanan alan içinde kırmızı floresan lökositler tarafından işgal yüzde alanı puanlama inflamatuvar yanıtın otomatik ölçümü sağlar. Ayrıca, otomatik veri işleme, taşıma, görselleştirme ve depolama tüm MATLAB ve Python geliştirilen özel dayanmaktadır. Kısaca, bir granülositik inflamatuvar yanıt başlaması, ilerlemesi veya çözünürlüğü üzerindeki etkisi için kimyasal bileşiklerin test sağlayan otomatik bir HC / HT ekranı tanıtmak. Bu protokol, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının orkestrasyon yer uyuşturucu mekanizmaları ve yolların daha derinlemesine analizler için iyi bir başlangıç ​​noktası sunmaktadır. Gelecekte, ilaç keşfi önceki aşamalarında dayanılmaz toksik ya da off-hedef etkilerin belirlenmesi yardım ve böylece ilaç gelişimi için prosedürel riskleri ve maliyetleri azaltabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish at JoVE.com

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Burada immün-modülatör biyoaktif bileflikler tanımlanmasını amaçlayan bir roman yüksek içeriği kimyasal yolla oluşan inflamasyon testi açıklar. Biz başarıyla inflamatuvar yanıt olarak daha fazla veri işleme, analiz, madencilik ve depolama otomatik ölçümü sağlayan özel geliştirilmiş yazılım komut ile otomatik mikroskopi birleştirdik.

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.0K Görüntüleme.  Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany. Burada immün-modülatör biyoaktif bileflikler tanımlanmasını amaçlayan bir roman yüksek içeriği kimyasal yolla oluşan inflamasyon testi açıklar. Biz başarıyla inflamatuvar yanıt olarak daha fazla veri işleme, analiz, madencilik ve depolama otomatik ölçümü sağlayan özel geliştirilmiş yazılım komut ile otomatik mikroskopi birleştirdik.

Video: Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

Gelen Yumurta kullanma<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Bir şekilde<em&gt; In vivo</emHelmint bağlı Akciğer iltihabı ve&gt; Model

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

bir<em&gt; In vitro</emTüberküloz Lezyonlarında İlaç Penetrasyonunu Öngören Caseum Bağlanma Testi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...