<p class="jove_content"&gt; Nous remercions Nadeshda Wolf, Nadine Eschen et Susanne Delong pour l&#39;élevage excellente. CW a été soutenue par une bourse de doctorat de l&#39;Helmholtz programme<em&gt; BioInterfaces</em&gt; Diplômé de l&#39;école internationale »(BIFIGS). Un soutien supplémentaire a été fourni par une subvention KIT-RISC et par une subvention Marie Curie international réintégration au sein de la 7e Programme-cadre européen de la Communauté (PIRG07-GA-2010-267552) à CG. PAPA a été soutenue par BOLD (biologie du foie et du pancréas et les maladies du développement) - Marie Curie Réseau de formation initiale (238 821). UL a été soutenu par le 7e PC Dopaminet (septième programme-cadre) (223 744).</p&gt;

1. Manipulation des animaux Pour le dosage de l&#39;utilisation Chin 3 larves dpf résultant de croisements entre des groupes homozygote cldnB double transgénique :: GFP / lysC :: DsRed2 et AB (type sauvage) du poisson. Recueillir des embryons par la reproduction naturelle et de les élever à 29 ° C dans un milieu E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, et 0,1% de méthylène bleu, équilibrée à pH 7,0) dans des boîtes de Pétri. Il est essentiel de maintenir une densité d&#39;embryons ne dépassant pas 50-70 par plaque. 2. Tri Larve Vérifiez toutes les larves sous un stéréoscope de fluorescence pour l&#39;expression rapporteur fluorescent, l&#39;inflammation spontanée et le développement liés à l&#39;âge approprié. 3. Préparation moyen de dépistage (Toujours préparer une nouvelle) Préparer le milieu E3 sans bleu de méthylène additionné de DMSO (1% final) et MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Préparation (Toujours préparer une nouvelle) D&#39;abord peser CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) et de préparer une solution stock à 20 mM dans dH 2 O. Préparer 120 um CuSO solution de travail 4 (de 20 solution stock mM) dans E3/DMSO (1%) / MS-222. Protéger CuSO 4 solution de la lumière. 5. La préparation des plaques de 384 puits (Greiner microplaques 384 puits) Pré-ajouter 20 ul de E3/DMSO (1%) / MS-222 à chaque puits avec une pipette inverse. Une augmentation de la pointe de pipette alésage est nécessaire pour traiter les embryons soigneusement sans infliger aucune blessure, ce qui est fait en coupant la pointe de 2 mm alésage. Transfert seule larve dans 74 ul de milieu dans chaque puits (84 pi pour le contrôle non traité). Si nécessaire, les larves d&#39;orienter dans une position latérale à l&#39;intérieur du puits en utilisant une pipette souple Eppendorf Microloader Astuce (Eppendorf; 5242 956.003). Effectuer toutes les étapes suivantes de manipulation des liquides avec un liquide de robotla manipulation poste de travail pour assurer le traitement simultané de toutes les larves. 6. Traitement de la toxicomanie Mélanger des composés de la plaque des stocks de médicaments 5 fois par aspiration et refoulement. Ajouter 16 ul de la plaque de drogue stock de 7,5 x à chaque puits et mélanger 5 fois. Ajustez la position de pointe dans les puits pour prévenir les blessures de larves et de passer le milieu à 10 pi / s. Mélanger moyennes dans les puits 4 fois pour assurer une distribution homogène de la drogue dans le puits. 7. Incubation Incuber plaque de blindage pendant 1 h à 29 ° C recouverts d&#39;une feuille d&#39;aluminium pour protéger les composés ainsi que CuSO 4 de la lumière. 8. Blessures chimique Ajouter 10 ul de 120 uM CuSO 4 solution de travail à chaque puits, sauf pour les contrôles négatifs, mélange 4 fois et incuber à nouveau pendant 1 h à 29 ° C. 9. Lavage Enlever et échanger 80 pi de moi<html> dium de chaque puits deux fois (en 20 étapes ul) pour éliminer les composés et CuSO 4. 10. Acquisition d&#39;image Démarrer l&#39;acquisition d&#39;images sur un microscope inversé automatisé (ex: Olympus scan ^ R) à 90 minutes après traitement au cuivre initial. Première série z-niveau afin que neuromastes de droite et de gauche de la ligne latérale postérieure sont visibles. Image dans chaque puits une fois par heure dans le fond clair canaux, Cy3 et la GFP dans 4 plans focaux (une distance de 50 um) en utilisant un objectif 4x (NA = 0,13). Informations supplémentaires sur l&#39;image et le traitement des données sont disponibles sur demande. 11. Traitement d&#39;image 1. Les données de tri Les images brutes sont traitées avec notre script de logiciels personnalisés LabView. La première opération dans le pipeline de traitement d&#39;image est le tri des images du microscope premières données générées par le dossier de canal, et le temps et une information de point. ove_step &quot;&gt; 2. accent étendue Par la suite, le logiciel crée des images de discussion prolongée de 4 plans focaux pour chacun des canaux. 3. RVB-incrustation Dans une dernière étape, les images de discussion élargie des 3 canaux sont fusionnés pour donner lieu à une finale RGB-superposition d&#39;image. 4. La détection automatique neuromastes Un outil de reconnaissance de formes (LabView rapide IA prototypage de l&#39;outil) identifie neuromastes dans les images de superposition RGB et crée une zone d&#39;intérêt définie empiriquement autour des neuromastes. 5. Quantification Dans la zone d&#39;intérêt définie empiriquement entourant neuromastes blessés rouges leucocytes fluorescentes reflète sous forme de pixels rouges) sont marqués en résulte dans une lecture primaire de p ourcentage un o rea ccupied par eukocytes l (Paol). En moyenne 95,27 ± 2,11% (FDA1) et 95,12 ±1,56% (FDA2) du puits (larves) ont été détectés correctement et ont ensuite été soumis à un traitement ultérieur des données. La sortie de données brutes (Paol pour chaque neuromastes détectée) est stocké dans un fichier texte et sert d&#39;entrée de données pour les scripts MATLAB qui traitent les données brutes en outre. 12. Informatique 1. Imaps Évaluer le succès des expériences individuelles par la visualisation graphique de la sortie de Paol données brutes dans un code de couleur pourrait être réalisé avec des cartes inflammation soi-disant (IMAPS) (Figure 2). Vert clair reflète une haute indice inflammatoire initiale; noire indique l&#39;absence de l&#39;inflammation. Ce rapide survol permet d&#39;identifier rapidement des expériences ratées, qui peuvent ensuite être exclus de l&#39;analyse des données supplémentaires. 2. Calcul de la moyenne des contrôles Chaque plaque expérimentale contient 320 composés reflétant unede données unique point par composé et l&#39;heure du point ainsi que 32 contrôles positifs et négatifs, respectivement. La commande 32 répétitions sont moyennées et l&#39;écart type est calculé. Pour les contrôles des points de données au sein de seulement 2 écarts-types sont inclus. 3. Normalisation La normalisation est faite par analyse de feuille de calcul. La valeur moyenne de DMSO, étant le témoin négatif, est mis à 0 et la plus haute moyenne Paol pour le contrôle de cuivre est mis à 1, de sorte que la différence maximale entre le contrôle positif et négatif est mis à 1. Paol Chaque composé est interpolés ou extrapolés linéairement aux contrôles respectifs sur la plaque expérimentale. 4. Lecture finale: l&#39;indice inflammatoire Après des expériences répétées suffisantes (c.-à-15) ont été menées, normalisées données brutes à partir d&#39;expériences répétées sont en moyenne, entraînant une lecture finale - la réponse inflammatoireindex. L&#39;indice inflammatoire initiale de la commande de cuivre commence à 100% pour le temps du point zéro et est corrélée à l&#39;heure de début d&#39;acquisition d&#39;image (90 minutes après le traitement du cuivre initial). 5. Monotonic raccord de régression exponentielle En raison de la résolution inflammation au fil du temps nous procédons à une monotone raccord exponentielle de régression non linéaire vers l&#39;inflammation initiale à l&#39;aide <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> - Un 0 est une mesure pour la réponse initiale à l&#39;instant t = 0, a 1 est liée à la pente de l&#39;amplitude dans le temps. 6. 2-D parcelle d&#39;espace caractéristique (Figure 4) À générer de l&#39;espace caractéristique, une régression non linéaire est appliquée et un groupe-analyse divise l&#39;espace caractéristique en régions caractéristiques, permettant ainsi l&#39;identification automatique de candidats intéressants à partir de différentes catégories immunitaire-modulateurs (anti-inflammatthéorie, anti-résolution, pro-inflammatoire, pro-résolution). Tous les composés sont affichés dans le tracé 2-D d&#39;après les paramètres a 0 et a 1. 13. Manipulation et stockage des données Nos données routines de gestion créer des pages Web pour visualiser et représenter de dépistage de drogues, assurant ainsi une vue d&#39;ensemble rapide de l&#39;image et de traitement de données des résultats des étapes, ainsi que d&#39;une vue détaillée à la demande de l&#39;utilisateur 10. Liens vers d&#39;autres soft pertinentes bases de données hétérogènes biologiques et chimiques sont intégrés aussi bien pour fournir une ressource précieuse pour les études comparatives et roman 11. Par ces routines, propres normes de données et métainformations sont fixés pour le stockage à long terme de ces données. 14. Les résultats représentatifs Dans un écran de pilote, nous avons analysé une bibliothèque constituée de 640 approuvé par la FDA connus composés bioactifs pour les effets sur l&#39;initiation, la progression ou la résolution d&#39;un Granulocytic réponse inflammatoire. Sur la base des effets observés que nous avons classées 4 types de phénotypes immunomodulateurs qui pourraient être indicatifs des différents modes d&#39;action: anti-inflammatoires (1), anti-résolution (2), pro-inflammatoire (3) et pro-résolution (4) , qui peut être décrite avec les paramètres a 0 et un 1, qui découlent d&#39;une installation de régression non linéaire monotone (e ao ​​+ alx -) vers l&#39;inflammation initiale. Un 0 représente l&#39;amplitude de la réponse inflammatoire tandis qu&#39;une 1 caractérise la pente de la courbe et donc décrit résolution l&#39;inflammation. Affichage tous les composés dans un tracé 2-D fonctionnalité espace (1 une par rapport à un 0) permet une identification automatisée de candidats frappées à partir des différentes catégories modulateurs immunitaires (figure 3). 45 sur 640 composés exercée significative effet anti-inflammatoire par la réduction de l&#39;indice inflammatoire initiale à 50% ou moins. Dans this catégorie nous avons trouvé 6 composés appartenant à la classe pharmacologique des non-stéroïdiens anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), confirmant la validité de notre approche. Toutefois, les AINS classé pas parmi les plus puissants anti-inflammatoires. Outre les AINS, nous avons trouvé plusieurs autres classes de médicaments pharmacologiques tels que par exemple pour les bloqueurs de récepteurs de l&#39;angiotensine (ARA), des antibiotiques et des inhibiteurs de la pompe à protons. 7 composés satisfait aux critères de seuil empiriquement définies pour d&#39;éventuels pro-résolution de la drogue. 18 médicaments ont exercé un effet pro-inflammatoire, ce qui entraîne le recrutement des leucocytes exagérée à neuromastes blessés par rapport à des témoins positifs. Seulement 2 composés empêché la résolution en temps opportun de la réponse inflammatoire. L&#39;effet anti-inflammatoire des candidats ont frappé plusieurs (candidats exemplaires mentionnés ci-dessus à partir de classes de médicaments pharmacologiques) de la coul écran piloted être confirmé d&#39;une manière dose-dépendante dans les prochains essais Chin secondaires (données non présentées). Répétition de 4 potentiels pro-résolution des médicaments n&#39;a pas confirmé le mode d&#39;action comme indiqué exercée dans l&#39;écran principal. 2 des médicaments a eu un léger potentiel anti-inflammatoire à des concentrations plus élevées (20 uM). Un troisième médicament présentait un marginal non dose-dépendante effet anti-inflammatoire à des concentrations de médicaments allant de 5 à 20 uM. Le quatrième médicament n&#39;a eu aucun effet sur la réponse inflammatoire aux concentrations testées. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Figure 1. Flux de travail de l&#39;essai Chin. Individuel composé transgénique cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 larves (3 dpf) sont distribués manuellement dans des plaques de microtitration à 384 puits. Les médicaments sont ajoutés simultanément à chaque puits en utilisant un Zephyr station de travail compacte Liquid Handling. Plaques d&#39;essai sont ensuite incubées pendant 1 h à 29 ° C. Le traitement avec CuSO 4 </sub&gt; - Solution (10 uM de concentration finale) pendant 1 h inflige la blessure et déclenche une réponse inflammatoire aiguë. Enfin, une solution de cuivre et de médicaments sont éliminés par lavage et d&#39;acquisition d&#39;image automatique est démarré (90 minutes après le traitement du cuivre initial). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Figure 2. . Aperçu image des images brutes La figure montre les images brutes de 4 plans focaux (Z = 0 - 3) à des distances de 50 um dans les canaux Cy3 (à gauche) et de la GFP (à droite), respectivement. Les flèches (Z = 1,2) indiquent neuromastes exemplaires, pointes de flèches (Z = 1,2) points à leucocytes groupés autour de neuromastes. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Figure 3. Cartes Inflammation (IMAPS) Le succès des expériences individuelles peuvent être évalués en imaps reflétant la réponse inflammatoire (données brutes) dans un code de couleur: vert clair. Reflète une inflation initiale élevée<html> réponse mmatory; noire indique l&#39;absence de l&#39;inflammation imaps à timepoint 0 (à gauche) et le temps du point 5 (à droite) montrent clairement si une expérience doit être inclus dans le traitement ultérieur des données.. Contrôles de cuivre (la ligne 13 et 24) se présentent dans différents tons de vert, tandis que le DMSO puits de contrôle (ligne 1 et 12) apparaissent en vert foncé ou noir. Au moment du point 5, l&#39;inflammation est presque résolu dans les contrôles de cuivre, maintenant indiqué dans les tons sombres de vert ou noir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Figure 4. 2-D parcelle d&#39;espace caractéristique de 320 composés d&#39;une bibliothèque et approuvé par la FDA leurs contrôles respectifs. Tous les puits composés peuvent être affichées dans une parcelle de 2-D fonction d&#39;espace sur la base des paramètres d&#39;un 0 et un 1, qui découlent d&#39;une non-linéaire Raccord de régression (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; l&#39;équation 1 &quot;/&gt;) vers l&#39;inflammation initiale. Cette parcelle d&#39;espace caractéristique permet l&#39;identification automatisée des candidats intéressants appartenant à l&#39;un des 4 suivantes immunitaire modulateurs catégories qui peuvent être indicatifs des médicaments «mode d&#39;action:. anti-inflammatoire (1), anti-résolution (2), pro-inflammatoire (3) et pro-résolution (4) <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

<p class="jove_content"&gt; Ici, nous présentons une stratégie de dépistage entièrement automatisé à haut débit permettant l&#39;identification du système immunitaire modulateurs composés dans un contexte animal entier. Surveillance permettant ainsi d&#39;une réponse inflammatoire aiguë<em&gt; In vivo</em&gt; Et en temps réel.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nous fournissons un protocole à appliquer le poisson zèbre comme un organisme modèle précieux pour la découverte de médicaments ou de drogues efforts donner un nouveau but, car les effets des drogues sur le recrutement des leucocytes dans les blessures peuvent être étudiés avec une relative facilité dans le cadre d&#39;un système entièrement fonctionnel immunitaire innée. L&#39;avantage unique de notre approche réside dans le fait qu&#39;une blessure chimique rend la manipulation manuelle des larves obsolètes, ce qui permet l&#39;automatisation et de dépistage dans un format à haut débit.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En outre, les effets indésirables ou toxiques ainsi que de fortes effets hors-cible peut être facilement évaluée par le projet de set-up. La bibliothèque approuvé par la FDA n&#39;a toutefois pas contenir de composés toxiques à des concentrations de dépistage. Néanmoins, nous proposons pour apparentes composés toxiques pour comparer l&#39;ensemble des données disponibles (par exemple phénotype modulateur immunitaire, la concentration du médicament) entre les membres de la même présent substance pharmacologique de classe dans la bibliothèque testée. Membres d&#39;une famille toxiques substance, qui exerce par ailleurs un phénotype modulateur immunitaire prometteuse, pourrait être testés à des concentrations plus faibles, si besoin est.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nous avons démontré la possibilité de catégoriser automatiquement les médicaments en fonction de leur exercée immunitaire modulateur effet. Médicaments appartenant à la catégorie des composés anti-inflammatoires pourraient être validés dans des expériences indépendantes, la plupart des composés qui exercent leur effet d&#39;une manière dose-dépendante. Quatre composés identifiés comme potentiels pro-résolution des médicaments pourrait donc bien ne pas être confirmé en tant que telle. Il indique également que cette catégorie particulière de l&#39;immunité modulateur est difficile à décrire, car aucun médicament affectant uniquement la résolution ont jusqu&#39;à présent été décrit dans la littérature. Cependant, 3 des 4 médicaments ont réanalysé ont montré une tendance anti-inflammatoire à de plus hautes concentrations molaires. Optimiser les critères de seuil empiriquement définies devrait contribuer à réduire le nombre de faux positifs.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Par ailleurs, la technique présentée offre la possibilité d&#39;être utilisé pour l&#39;identification de mutations dans les gènes qui affectent le comportement migratoire des leucocytes<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; En conclusion, la méthode proposée peut faciliter et accélérer la découverte de médicaments ou de drogues réorientation des efforts en cédant potentiels des structures de plomb nouvelles informations disponibles sur la tolérance au médicament, la toxicité, la posologie ainsi que des éventuels effets hors-cible. Par conséquent, servant une stratégie simple, des coûts et gain de temps aux premiers stades de développement de médicaments.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Cuivre (II) sulfate anhydre </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> Approuvé par la FDA bibliothèque de médicaments </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 microplaques non-contraignant, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> noir </td></tr><tr><td> Olympus scan ^ R </td><td> Olympe </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr station de travail compacte Liquid Handling </td><td> Caliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

Larves poisson zèbre sont particulièrement favorables à l&#39;animal entier petite molécule écrans 1,2 en raison de leur petite taille et la facilité relative de la manipulation et l&#39;observation, ainsi que le fait que les composés peuvent être simplement ajoutés à l&#39;eau de baignade et sont facilement absorbés lorsqu&#39;ils sont administrés dans un &lt;solution à 1% DMSO. En raison de la clarté optique des larves de poisson zèbre et la disponibilité de lignes transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les leucocytes, le poisson-zèbre offrent l&#39;avantage unique de suivi d&#39;une réponse inflammatoire aiguë in vivo. Par conséquent, en utilisant le poisson zèbre pour haute teneur écrans de petites molécules visant à l&#39;identification du système immunitaire modulateurs composés avec un débit élevé a été proposé 3-6, suggérant des scénarios d&#39;induction par exemple l&#39;inflammation dans les tissus localisés pseudos fin, dommage laser dirigé vers la surface jaune d&#39; embryons 7 ou amputation tailfin 3,5,6. L&#39;inconvénient majeur de ces méthodes a toutefois étél&#39;exigence de la manipulation manuelle larve pour induire la blessure, empêchant ainsi criblage à haut débit. Introduction de l&#39;inflammation induite chimiquement (Chin) dosage 8 éliminé ces obstacles. Depuis blessure est infligée chimiquement le nombre d&#39;embryons qui peuvent être traitées simultanément est pratiquement illimitée. Traitement temporaire des larves du poisson zèbre avec du sulfate de cuivre induit sélectivement la mort cellulaire dans les cellules ciliées de la ligne latérale et les résultats en matière de recrutement de granulocytes rapide à neuromastes blessés. La réponse inflammatoire peut être suivie en temps réel en utilisant composé transgénique cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 6,9 larves du poisson zèbre qui expriment une protéine fluorescente verte dans les cellules neuromastes, ainsi que quelques rouges fluorescentes granulocytes d&#39;étiquetage de protéines. Afin de concevoir une stratégie de dépistage qui permettrait aux deux analyses de haut-contenu et à haut débit, nous avons introduit robotique de manipulation de liquide et combinée micr automatiséoscopy avec un script un logiciel développé sur mesure. Ce script permet de quantifier automatisé de la réponse inflammatoire en marquant la zone occupée par pour cent rouges fluorescentes leucocytes dans une zone définie de manière empirique entourant blessés verts fluorescents neuromastes. En outre, nous avons automatisé le traitement des données, la manipulation, la visualisation et de stockage tout fondé sur la coutume développé MATLAB et des scripts Python. En bref, nous introduisons un système automatisé HC / HT écran qui permet de tester des composés chimiques pour leur effet sur l&#39;initiation, la progression ou la résolution d&#39;une réponse inflammatoire granulocytaire. Ce protocole sert un bon point de départ pour plus de des analyses en profondeur des mécanismes de drogue et les voies impliquées dans l&#39;orchestration d&#39;une réponse immunitaire innée. Dans l&#39;avenir, il peut aider à identifier les intolérables effets toxiques ou hors cible lors des phases antérieures de la découverte de médicaments et de réduire ainsi les risques et les coûts de procédure pour le développement de médicaments.

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Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Nous décrivons ici un roman à forte teneur en test l&#39;inflammation induite chimiquement visant à l&#39;identification du système immunitaire modulateurs bioactifs. Nous avons réussi à combiner la microscopie automatisée avec des scripts logiciels développés permettant la quantification automatique de la réponse inflammatoire ainsi que la poursuite du traitement des données, l&#39;analyse, l&#39;exploitation minière, et le stockage.

Drug faciliter la découverte: Un test automatisé inflammation Haute-contenu chez le poisson zèbre

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.0K vues.  Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany. Nous décrivons ici un roman à forte teneur en test l'inflammation induite chimiquement visant à l'identification du système immunitaire modulateurs bioactifs. Nous avons réussi à combiner la microscopie automatisée avec des scripts logiciels développés permettant la quantification automatique de la réponse inflammatoire ainsi que la poursuite du traitement des données, l'analyse, l'exploitation minière, et le stockage.

Vidéo: Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

En utilisant des oeufs de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; En tant que<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de l&#39;inflammation pulmonaire induite par les helminthes

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Recherche

Immunologie et infection

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Les tests pour l&#39;identification de nouveaux antiviraux contre la fièvre catarrhale Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d&#39;expression de types I et III sous-types d&#39;interféron

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

L&#39;induction d&#39;une réponse inflammatoire dans les cultures hépatocytes primaires de souris

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...