Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencia (IOS-0920417) (ACL).

1. Construcción de Lentiviral luciferase reporteros Un constructo reportero circadiano de mamíferos por lo general contiene un casete de expresión en la que se fusiona un promotor circadiano con el gen de la luciferasa. Tanto las estrategias de ligación y basadas en la recombinación son comúnmente utilizados para la clonación del ADN. Como ejemplo, aquí se describe un método de Gateway recombinación basada en la clonación para generar una P (Per2)-d reportero Luc lentiviral, en la que la luciferasa desestabilizado (d Luc) está bajo el control del promotor de ratón Per2. <ol><li> Clonación del promotor Per2. El uso de PCR para amplificar el fragmento de promotor de ADN Per2 de 526 pb, aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción de un ratón Per2 clon BAC 9-13, usando un cebador directo (5&#39;-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 &#39;) y un cebador inverso (5&#39; -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 &#39;), y el clon en pENTR5&#39;-TOPO vector (Invitrogen) para generarpENTR5&#39;-P (Per2). </li><li> Clonación de d Luc. La Luc d contiene el gen de la luciferasa de luciérnaga y una secuencia PEST C-terminal de la degradación de proteínas rápida como se ha descrito previamente 21. El uso de PCR para amplificar el fragmento de ADN d Luc, y el clon en pENTR / D-TOPO vector (Invitrogen) para generar pENTR / Dd Luc. </li><li> Construcción del vector reportero. Mezclar los dos plásmidos pENTR, P pENTR5&#39;-(Per2) y Luc pENTR / DD, con el vector lentiviral destino pLV7-BSD (BSD, blasticidin gen de resistencia), y llevar a cabo la reacción de recombinación utilizando Clonase para generar un pLV7-BSD-P (Per2)-d luc (Figura 1). pLV7-BSD es una versión modificada (realizado en nuestro laboratorio) de pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) en el que el virus de la hepatitis de la marmota post-transcripcional elemento regulador (WPRE) 22 secuencias se insertaron inmediatamente aguas abajo de la expresión ca<html> ssette para potenciar la expresión génica. </li></ol> 2. Producción de partículas lentivirales 1. Semillas células 293T (día 1) <ol><li> Grow embrionarias humanas de riñón (HEK) células 293T a 90-100% de confluencia en ordinario DMEM suplementado con FBS al 10% y 1x de penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG) en placas de 10 cm de cultivo. (Rápidamente las células que crecen con el paso número bajo son críticos para la transfección eficiente.) </li><li> Antes de la siembra de las células de las placas de transfección, capa de cultivo de 6 pocillos mediante la adición de 1 ml de 0,001% de poli-L-lisina en PBS a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 20 min. Aspirar la solución y se lava una vez con 1x PBS antes de su uso. </li><li> Disociar las células 293T con tripsina y semilla 0,75 x 10 6 células en cada pocillo de las placas pre-recubiertas con 2 ml de DMEM regular. Swirl las placas a fondo para obtener una distribución uniforme de células en cada pocillo. Cultivar las células en la incubadora a 37 ° C durante la noche. </li></ol>tep &quot;&gt; 2. Transfección transitoria Via Capo 4 / precipitación del ADN (día 2) <ol><li> Observar las células sembradas a partir del día 1. La célula debe alcanzar confluencia de 80-90%. </li><li> Preparar la mezcla de transfección del plásmido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml mediante la adición de 2 g de un ADN plásmido reportero lentiviral (por ejemplo, pLV7-P (Per2)-d Luc; Liu laboratorio) y los vectores de empaquetamiento 3 (1,3 g Gag / Pol, 0,5 g Rev, y 0,7 g VSVG; Invitrogen). Como control de transfección tanto y la posterior infección, que por lo general incluyen un pozo adicional en la transfección de un vector de expresión GFP lentiviral, pLV156-CMV-EGFP (Figura 1A), que alberga aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) bajo el control del promotor CMV como se ha descrito previamente 20. </li><li> Añadir 100 l de 0,25 M de CaCl 2 (diluido con DNasa / RNasa libre ddH 2 O de 2,5 M valores) a la mezcla de plásmido en el paso 2 y mezclar bien. A continuación, añadir 100 ml de solución 2 x BBS (50 mM SERS, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 6,95) y mezclar suavemente pero a fondo. Incubar la mezcla de ADN a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Mientras espera, aspirar medio de células 293T y cambiar a 2 ml de medio fresco. Volver a la placa de la incubadora durante al menos 10 min para equilibrar el pH del medio antes de la transfección. </li><li> Añadir la mezcla de transfección de la etapa 3 a gota células 293T a gota. Agitar la placa suavemente y observar la formación de partículas con un microscopio. Incubar a 5% de CO 2, 37 ° C durante la noche. (Formación de partículas finas de Capo 4 precipitado / ADN es esencial para la transfección eficiente.) </li></ol> 3. Cosecha de partículas virales (días 3-4) <ol><li> Acerca de 16 horas después de la transfección-(día 3) por el cual las células de tiempo debe alcanzar el 100% de confluencia, aspirar el medio de las células y reemplazar con 2 ml de DMEM fresco ordinario. Incubar a 37 ° C durante la noche. </li><li> El día 4, evaluar la eficacia de transfección mediante la observación de la expresión de EGFP en transfection células control (eficacia de la transfección de 90-100%, con expresión de EGFP alta es un predictor fiable de una preparación viral bueno.) </li><li> Se recoge el medio que contiene secretadas, las partículas virales infecciosas. Centrifugar a&gt; 2.000 xg durante 5 minutos para eliminar las células residuales de 293T y recoger el sobrenadante de virus que contiene. Alternativamente, el medio puede ser limpiado con un filtro de 0,45 micras membrana. Las partículas virales son listos para su uso en la infección. </li></ol> 3. Infección de células 3T3 1. Semillas 3T3 células (día 3) Split y número adecuados de las semillas (~ 12.000) de las células 3T3 en una placa de 12-bien para obtener 20-30% de confluencia por día siguiente. Incubar a 37 ° C durante la noche. 2. Infectar las células 3T3 (día 4) <ol><li> Observar las células sembradas. Confluencia de 20-30% (menos del 50%) es deseable para la infección. </li><li> Añadir polibreno a una concentración final de 5 ug / ml al medio de recogida que contiene viralpartículas. Mezclar bien pipeteando. </li><li> Aspirar medio a partir de células 3T3, y añadir 1 ml de la mezcla anterior viral por pocillo. Incubar a 37 ° C durante la noche. (Polybrene se utiliza para mejorar la eficiencia de la infección, pero no se requiere absolutamente. Como puede ser tóxica para algunas células, de un ensayo previo se recomienda.) </li></ol> 3. Seleccione células infectadas (día 5 en adelante) <ol><li> Veinticuatro horas después de la infección, aspirar el medio que contiene virus y polibreno de las células infectadas, se lava una vez con PBS 1x, y cambiar a un medio fresco. Incubar a 37 ° C durante la noche para la recuperación y el crecimiento. </li><li> Cuando confluente (normalmente 1-2 días más tarde), los trozos de las células y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> El día siguiente, el medio aspirado de células (confluencia &lt;50% se desea) y reemplazar con medio fresco que contiene 10 mg / ml blasticidina para seleccionar para las células transducidas de forma estable. (Blasticidina matar-curva necesita ser determinado empíricamente para una línea celular particular.) </li><li&gt; Cambiar a un nuevo soporte de blasticidina cada 2-3 días para la selección continua de antibióticos resistentes a las células que expresan los periodistas reloj (generalmente 4-6 días en total). </li></ol> 4. La bioluminiscencia Grabación de células Reporter 1. Se siembran las células indicadoras Propagar blasticidina células resistentes a reportero y dividido en placas de cultivo de 35 mm. Incubar a 37 ° C hasta una confluencia. Por lo general, preparar ≥ 3 platos para cada línea celular reportero en cada condición para fenotipificación circadiano. 2. Sincronización y cambio de medio de grabación <ol><li> Aspirar medio de células confluentes reportero, lavar una vez con PBS, y reemplazar con DMEM que contenía 10 mM de forskolina (o 200 nM dexametasona). Incubar a 37 ° C durante 1 hora para sincronizar las células. (Alternativamente, las células pueden ser sincronizados por 23 ciclos de temperatura o choque de suero 24.) </li><li> Mientras espera, preparar registroING medio para células 3T3 como sigue: 1x DMEM (HyClone) que contenía 10% de FBS, 1 x Pen / Strep / Gln, 1 mM de forskolina, 1 mM de luciferina, 25 mM HEPES, pH 7,4. El suero y la concentración de forscolina se puede determinar empíricamente. Para las células muy tenues, libre de rojo fenol medio puede ser utilizado. </li><li> Al final del tratamiento forskolina, aspirar el medio y sustituirlo por medio de grabación recién hecho. </li></ol> 3. Bioluminiscencia de grabación de células informadoras <ol><li> Después de cambiar el medio, cubra placas de cultivo de 40 mm cubreobjetos estériles y sellar en el lugar con grasa de vacío para evitar la evaporación. </li><li> Coloque la vajilla en el luminómetro LumiCycle, que se mantiene dentro de una incubadora a 36 ° C sin H 2 O y CO 2. </li><li> Iniciar grabación en tiempo real bioluminiscencia. Por lo general, registrar los ritmos durante 1 semana, seguido de cambio de medio y de grabación continua de una semana segundos (ver Savelyev et al. Para más detalles) 25. (Para la grabación de 96-queplacas ll, Synergy SL2 fue utilizado como dispositivo de grabación, ver Discusión 1.1 para detalles). </li></ol> 5. Análisis de datos y presentación Reportero facilitar células de alta resolución de grabación luminiscencia cuantitativa, fundamental para determinar los efectos fenotípicos sobre la función del reloj circadiano. Para obtener los parámetros circadianos incluyendo fase, la duración del período, amplitud, ritmo y grado de amortiguación, se utiliza el programa de análisis de LumiCycle (Actimetrics) para analizar los datos de bioluminiscencia 5,14. Brevemente, los datos en bruto son línea de base, montado de primera, y la sustracción de línea de base de datos se ajustan a una onda sinusoidal, de la que los parámetros son determinados. Para ver ejemplos que muestran ritmos persistentes, de bondad de ajuste de&gt; 90% se consigue normalmente. Debido a la bioluminiscencia alta transitoria a cambio de medio, por lo general no incluyen el primer ciclo de datos de análisis. Para la presentación de datos, por lo general graficar datos en bruto (bioluminiscencia, cuentas / seg) en contra de time (días). Cuando sea necesario, los datos de línea de base-resta se pueden trazar para comparar la amplitud y fase. 6. Los resultados representativos 1. Fase específica periodistas circadianos El reloj circadiano se basa en un mecanismo de retroalimentación negativa bioquímica 1. El bucle de realimentación núcleo consiste de activadores de la transcripción y BMAL1 reloj, y represores pers y Crys, que actúan sobre los circadianos E / E&#39;-box elementos potenciadores para producir la expresión de genes rítmica (con fase mañana, por ejemplo, Rev-erb α). El lazo de núcleo regula e integra al menos otros dos circadianos cis-elementos, el elemento de unión DBP/E4BP4 (D-box; para la fase de día, por ejemplo, PER3) y el elemento de ROR / REV-ERB unión (RRE; para la fase noche, por ejemplo, Bmal1) 17. Regulación combinatoria de múltiples elementos circadianos puede generar nuevas fases intermedias. Por ejemplo, Cry1 transcripciónes mediada por los tres elementos (elementos circadianos es decir, E / E&#39;de caja y caja D-en el promotor y RRES en el primer intrón del gen Cry1), dando lugar a la distinta Cry1 noche-tiempo de fase 13. En base a estos mecanismos de regulación génica, hemos generado cuatro construcciones indicadoras diferentes: P (Per2)-d Luc y P (Cry1)-D Luc reporteros que contienen tanto E / E&#39;de caja y D-box elementos en la región de regulación 17, 26,27, P (Cry1) - Intron-d Luc representa regulación combinatoria de los tres elementos (es decir, E / E&#39;-box, D-box, y RRE) 13,17, y P (Bmal1)-d Luc regulado exclusivamente por RRE 9,17,19,21. Hemos introducido estos reporteros en células 3T3 para producir las fases previstas distintas de expresión reportero (Figura 2). 2. Gene caída a través de RNAi y farmacológicamente actiVe compuestos Cuando la eficiencia de transfección es alta, ARNsi sintético puede ser transfectados transitoriamente en las células para derribar la expresión génica. Cuando la transfección es técnicamente difícil, un vector de expresión de shRNA puede ser de forma estable en células transducidas mediante infección lentiviral, de modo que shRNA producida por la celda se procesa para siRNA para el gen desmontables (KD). Aquí se presentan los efectos de Kd de Cry1 y Cry2 genes utilizando siRNA en células U2OS (Figura 3A) y shRNA en células 3T3 usando un vector de expresión de puerta de enlace pLL3.7 9 (Figura 3B). Además de las células 3T3, el modelo U2OS ha convertido en un modelo preeminente reloj celular en gran parte porque cumple con los requisitos fundamentales para la selección de alto rendimiento de las bibliotecas siRNA humanos disponibles en el mercado (por ejemplo, el origen humano, capaz de generar fuertes ritmos circadianos, la función de validación todos los genes conocidos despertador y susceptibles de transfección altamente eficiente ygrabación luminiscencia cuantitativo). En ambos tipos de células, RNAi mediada KD dado lugar a fenotipos de reloj consistentes con ratón knockout anterior (KO) y estudios celulares KD 5,10,11,28. Por ejemplo, Cry1 KD duración del período se acorta y disminuye la persistencia ritmo, mientras que Cry2 KD alarga período. Además, pequeñas moléculas seleccionadas se pueden utilizar para farmacológicamente objetivo y función perturbar proteína (Figura 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig1.jpg" /> Figura 1. El lentivirus de genes mediada por sistema de suministro. (A) Diagrama esquemático de dos lentiviral P (Per2)-D vectores indicadores Luc y una EGFP-CMV construir. Sólo la región para la integración en el genoma de la célula huésped se muestra. En ambas construcciones indicadoras, la transcripción de d Luc está bajo el control directo del promotor Per2. En el pLV7-BSD-P (Per2)-d vector Luc (recombinación basada en la clonación), un gen de blasticidina coexpressed resistencia (BSD) facilita la selección de las células infectadas. En la pLV156-P (Per2)-d Luc vector (ligadura de un clonado), traducción EGFP está mediada por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) aguas abajo de d Luc, lo que permite la observación visual y clasificación de FACS de las células infectadas. Además, un SV40 promotor / terminador (P / T) se utiliza como un aislador (véase la discusión 1,3). En el vector CMV-EGFP control, es la expresión de EGFP bajo el control de un fuerte promotor de CMV. (B) imágenes fluorescentes de GFP-expresando transfectadas y las células infectadas. Típicamente, se logra una alta eficiencia tanto en la transfección transitoria de células 293T y en la infección lentiviral de líneas celulares de nuestro interés, como se indica por la expresión de GFP en estas células. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la figura</a> . <img alt="Figura 2" src = &quot;/ files/ftp_upload/4234/4234fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Fase expresión específica de los reporteros de bioluminiscencia en células 3T3 Los vectores indicadores de lentivirus utilizados en este experimento son pLV7-BSD-P (Per2)-Luc d, P (Cry1)-Luc d, P (Cry1) -. Intrón-d Luc, y P (Bmal1)-d Luc. Cada reportero exhibe una fase distinta de la oscilación, como se indica por las flechas. Mientras que el Per2 y Cry1 bioluminiscencia unidad promotores pico en fases día por la mañana y el promotor de Bmal1 en fase nocturna, la regulación combinatoria por el P (Cry1) - Intron albergar caja E, D-box, y los elementos RRE confiere fase noche de bioluminiscencia pico . <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig3.jpg" /> Figura 3. Perturbación genética y farmacológica de los ritmos circadianos de bioluminiscencia en las células indicadoras. (A) Efectos de Cry1 y Cry2 desmontables por siRNAs sobre los ritmos celulares de las células indicadoras U2OS. El luminómetro LumiCycle fue utilizado para la grabación de la bioluminiscencia de las células en placas de 35 mm. La figura está adaptada de la referencia n º 10, con permiso de Elsevier (2009). (B) Efectos de la caída por Cry2 shRNAs sobre los ritmos celulares de células indicadoras 3T3. Un vector de puerta de enlace que contiene un casete de pLL3.7 U6-shRNA se utilizó para gen desmontables Cry2. shRNA2 tiene una eficacia mejor que shRNA1 desmontables como se determina por análisis de transferencia Western (datos no mostrados). Un luminómetro Synergy fue utilizado para la grabación de la bioluminiscencia de las células en una placa de 96 pocillos. Los ajustes para la grabación son las siguientes: temperatura de la incubadora., 33 ° C, el tiempo de integración, 15 s; intervalo de tiempo, 30 min (C) Efectos de inhibidores de moléculas pequeñas en celritmos lular de células U2OS reportero. Chir99021 y roscovitina son inhibidores dirigidos contra GSK-3 y CDK, respectivamente. El sistema Viewlux (Chir99021 ensayo) y un luminómetro Tecan (roscovitina ensayo) se utilizaron para las grabaciones de bioluminiscencia de las células en 384-y placas. La figura es una adaptación de Referencia # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, EE.UU.). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

No hay conflictos de interés declarado.

1. Modificaciones al Protocolo actual 1.1 Los dispositivos de grabación y consideraciones de rendimiento Debido a su disponibilidad comercial, la LumiCycle (Actimetrics) se ha convertido en el dispositivo más utilizado luminómetro automatizado para grabación en tiempo real 4,5,9,19,29-31. El LumiCycle emplea tubos fotomultiplicadores (PMT) como detectores de luz, que proporcionan una sensibilidad extremadamente alta y bajo ruido 14, y por lo ...

<table border="1"><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> HyClone </td><td> SH30243FS </td><td> Para el crecimiento celular normal </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td> Para luminometría </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep / Gln (100x) </td><td> HyClone </td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferina </td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Millipore </td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td> Forskolin </td><td> Sigma </td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td> Todos los otros productos químicos </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> Incubadora de cultivo de tejido </td><td></td><td></td><td> 5% de CO2 a 37 ° C </td></tr><tr><td> Tejido capucha cultura </td><td></td><td></td><td> BSL-2 certificado </td></tr><tr><td> Light &amp; microscopio fluorescente </td><td></td><td></td><td> Fase opcional contraste </td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters

En los mamíferos, muchos aspectos del comportamiento y la fisiología como los ciclos de sueño-vigilia y el metabolismo del hígado son regulados por relojes circadianos endógenos (revisado 1,2). El tiempo circadiano de mantenimiento de sistema es una estructura jerárquica multi-oscilador red, con el reloj central situado en el núcleo supraquiasmático (SCN) sincronizar y coordinar los relojes extra-SCN y periférico en otra parte 1,2. Las células individuales son las unidades funcionales para la generación y el mantenimiento de los ritmos circadianos 3,4, y estos osciladores de diferentes tipos de tejidos en el organismo una proporción notablemente similar mecanismo bioquímico de retroalimentación negativa. Sin embargo, debido a las interacciones a nivel de red neuronal en el SNC y por medio de señales rítmicas, sistémicas a nivel de organismos, de los ritmos circadianos en el nivel organismal no necesariamente son células autónomas de 5-7. En comparación con los estudios tradicionales de actividad locomotora in vivo y ex vivo explantes SCN, Cell-basado en los ensayos in vitro permiten el descubrimiento de células autónomas defectos circadianos 5,8. Estratégicamente, modelos basados ​​en células son más experimentalmente tratable para la caracterización fenotípica y rápido descubrimiento de los mecanismos de reloj básicas 5,8-13. Debido a que los ritmos circadianos son dinámicas, las mediciones longitudinales con alta resolución temporal son necesarios para evaluar la función del reloj. En los últimos años, grabación en tiempo real utilizando bioluminiscencia luciferasa de luciérnaga como reportero se ha convertido en una técnica común para el estudio de los ritmos circadianos en mamíferos 14,15, ya que permite el examen de la persistencia y la dinámica de los ritmos moleculares. Para supervisar células autónomas ritmos circadianos de la expresión génica, luciferase reporteros se pueden introducir en las células a través de la transfección transitoria 13,16,17 o transducción estable 5,10,18,19. Aquí se describe un protocolo de transducción estable utilizando lentivirus mediada por la entrega de genes. Tsistema de vector lentiviral que es superior a los métodos tradicionales tales como la transfección transitoria y transmisión de línea germinal debido a su eficiencia y versatilidad: permite una entrega eficaz y la integración estable en el genoma huésped de tanto que se dividen y no se dividen las células 20. Una vez que una línea celular reportera se ha establecido, la dinámica de la función de reloj se pueden examinar a través de grabación de bioluminiscencia. En primer lugar, describimos la generación de P (Per2)-D líneas Luc reportero, y luego se presentan datos de este y otros reporteros circadianos. En estos ensayos, los fibroblastos 3T3 de ratón y células de osteosarcoma humano U2OS se utilizan como modelos celulares. También se discuten las diversas formas de utilizar estos modelos en estudios reloj circadiano. Los métodos descritos aquí se pueden aplicar a una gran variedad de tipos de células para estudiar la base molecular y celular de los relojes circadianos, y puede resultar útil en la lucha contra los problemas en otros sistemas biológicos.

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Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.

Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.1K vistas.  The University of Memphis. Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.

Video: Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático Usando una<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasa SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

La detección de Intracelular expresión génica en células vivas de murino, humano y porcino Origen Utilizando nanopartículas fluorescencia marcado

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...