¡Gracias a Elena Mitsi (asistente de investigación) y la Hermana Carole Hancock (enfermera de Investigación) y personal del teatro por su contribución a la filmación, y para David Shaw (enfermera de la investigación) por su apoyo con nuestros broncoscopias investigación. Gracias también a nuestra voluntaria Rebecca Dunphy por permitir este procedimiento para ser filmado.

1. Los sujetos son recibidos a su llegada por la Enfermera de Investigación Respiratoria <ol><li> El tema ha estado ayunando durante&gt; 4 horas para alimentos sólidos y 2 h para líquidos claros 1. </li><li> El procedimiento se realiza como un caso de día con los controles pre y post-procedimiento adecuado (según la política del hospital estándar). </li><li> El sujeto lleva una bata de hospital. </li><li> Se inserta una pequeña cánula de calibre (lo ideal es en la mano izquierda) y se mantiene in situ hasta el final del período de recuperación después del procedimiento 1. </li><li> Se toman observaciones previos al procedimiento (presión arterial, frecuencia cardíaca, saturación de oxígeno [SATS]). </li><li> El sujeto se transfiere a la suite de la broncoscopia. </li></ol> 2. El sujeto está preparada para el procedimiento en la suite por una Investigación Clínico Respiratorio Con experiencia en broncoscopia <ol><li> Los equipos de inspección se adjunta incluyendo; 3 derivaciones ECG, oxímetro de pulso 1,10 y esfigmomanómetro. AnesthetNo se necesita apoyo ic incluyendo el consentimiento informado por escrito. </li><li> El oxígeno se puede suministrar a través de una cánula nasal con hasta 4 L / min, para lograr SAT&gt; 90% 1. </li><li> El operador comprueba el broncoscopio, esto incluye asegurarse de succión efectiva mediante la aspiración de solución salina normal estéril. </li><li> La anestesia tópica con lidocaína se consigue en los pasajes nasales (utilizando Instillagel 1) y la mucosa oral (utilizando xilocaína) </li><li> Si la sedación es apropiada y solicitado por el sujeto, el midazolam se administra por vía intravenosa 1. Un agente de inversión apropiado (flumazenil) está disponible inmediatamente. </li><li> El equipo de reanimación debe estar disponible 1,10. </li></ol> 3. El broncoscopio es insertado y posicionado <ol><li> La intubación es por lo general a través de la nariz. Si esto no es posible debido a pólipos nasales, cornetes inflamados, o cualquier molestia entonces el sujeto es intubado a través de la boca (un protector bucal se utiliza para prevenirdaños en el alcance o los dientes del sujeto). </li><li> La anestesia tópica en la laringe se completa utilizando 4% de lidocaína, por lo general se utiliza un total de 4-6 ml. Comúnmente esto causa la tos en la instilación. </li><li> Se pasan las cuerdas vocales, y otros que utilizan la anestesia de la mucosa de 2 ml de lidocaína al 2% en la carina, en la división del lóbulo inferior derecho (RLL) y lóbulo medio derecho (RML) y en la entrada RML. </li><li> El broncoscopio se coloca dentro de la RML, idealmente en el segmento medial, en una posición en la que es suficiente para estar en una posición segura distal pero no demasiado distal de modo que la vía respiratoria se derrumba cuando se aplica succión (&quot;prueba de Wink &#39;utilizando el botón de aspiración ). </li><li> Una buena posición es indicada durante la prueba guiño mediante un broncoscopio que se puede mantener totalmente en posición por el broncoscopista y una vía aérea que no lo hace totalmente cierran inmediatamente una succión suave. </li></ol> 4. El BAL se realiza <ol><li> Cuatro 60 ml jeringas son prelleno con solución salina normal calentada - 60 ml, 50 ml, 50 ml, y 40 ml en jeringas sucesivas. Cuando el sujeto y broncoscopista están listos la primera jeringa de solución salina se instila por el asistente broncoscopia mientras broncoscopista mantiene la posición en la RML. </li><li> Succión suave mano se lleva a cabo a continuación por el asistente utilizando el mismo puerto y 50 ml jeringa. </li><li> Este procedimiento se repite entonces una 3x aún más, con un volumen máximo de 200 ml utilizados en nuestra técnica específica. </li><li> El BAL líquido recuperado se expulsa suavemente en recipientes etiquetados que ya se encuentren en la fusión del hielo. Los recipientes de vidrio pueden ser presiliconized el fin de inhibir la unión de células y maximizar el rendimiento celular. </li><li> El fluido BAL aparece nebuloso contra la luz con las burbujas de jabón de superficie formadas por tensioactivos. </li><li> El broncoscopio se retira lentamente plenamente. </li><li> El BAL líquido se transporta sin demora en hielo para su procesamiento inmediato. </li></ol> 5. Asunto Recuperación </p&gt; <ol><li> El sujeto se recupera para 2-4 horas por la enfermera de la investigación respiratoria en una sala. </li><li> Durante este tiempo se les permite descansar y sólo comer y beber&gt; 60 min 1 después del procedimiento (cuando su deglución es evaluado como seguro), con el fin de reducir el riesgo de aspiración. </li><li> Observaciones posteriores al procedimiento son controlados y registrados. Un examen clínico se produce antes de la descarga. </li><li> El sujeto se informó predescarga acerca de los efectos secundarios comunes (fiebre, dolor de pecho submamaria derecha leve, dolor de garganta) y se le dio un número de contacto en caso de efectos secundarios significativos se producen 1. </li><li> El sujeto se dio seguimiento en 1-5 días después del procedimiento con un contacto clínico. Esto puede ser o bien por teléfono o en persona. </li></ol> 6. Las células se aíslan en el laboratorio - Realizar el deshielo, cuando sea posible <ol><li> El volumen de líquido de BAL se registra y se filtró a través de una doble capa de gasa estéril hisopopara quitar los tapones de moco en, tubos de 50 ml centrífuga estériles preenfriados. </li><li> Las células se sedimentaron por centrifugación a 500 xg a 4 ° C durante 5-10 minutos y se lavaron por agitación en 50 ml de frío de solución salina normal. Centrifugación se repite una vez. </li><li> Las células se resuspenden en medio de cultivo (RPMI-1640 + suero bovino fetal al 10% + 2 mM de L-glutamina + penicilina [40 UI / ml], estreptomicina [75 UI / ml], y la anfotericina B [0,5 UI / ml]) y recuento diferencial realizado usando un volumen igual de azul de tripano y un hemocitómetro. </li><li> La suspensión celular se normaliza a la densidad requerida (usamos 1 x 10 6 células / ml), introducidos con la pipeta en placas de cultivo tisular adecuada y se incuban a 37 ° C durante 3 horas para permitir la adherencia de macrófagos. 1 ml de esta suspensión celular por pocillo es apropiado para placas de cultivo de 24 pocillos. </li><li> Para el trabajo de linfocitos, después de 3 horas de incubación, el medio de cultivo se pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo de 3 aumentos, y se recoge. Este medio contiene linfocitosy los macrófagos no adherentes y se pueden utilizar para evaluar la función de linfocitos, sino que también se puede utilizar en etapas de purificación, por ejemplo con perlas magnéticas CD14 para eliminar los macrófagos. </li><li> Para el trabajo de los macrófagos, después de 3 h de incubación, el medio se retira cuidadosamente con un mínimo de pipeteo y se reemplaza con medio fresco, caliente sin antibióticos (RPMI 1640 + 10% de suero bovino fetal + 2 mM de L-glutamina). Los macrófagos son adherentes a la placa de cultivo de tejidos (véase la Figura 1). </li></ol>

<ol>
	<li>BTS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+British+Thoracic+Society+Bronchoscopy+Guideline+Committee+-+A+sub-Committee+of+the+Standards+of+Care+Committee+of+the+British+Thoracic+Society.">The British Thoracic Society Bronchoscopy Guideline Committee - A sub-Committee of the Standards of Care Committee of the British Thoracic Society.</a> Thorax. 56 (Suppl I), 1-21 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+recommendations+and+guidelines+for+bronchoalveolar+lavage+(BAL)+report+of+the+European+Society+for+Pneumology+Task+Group.">Technical recommendations and guidelines for bronchoalveolar lavage (BAL) report of the European Society for Pneumology Task Group.</a> Eur. Respir. , 561-585 (1989).</li><li>Gordon, S. B., Irving, G. R., Lawson, R. A., Lee, M. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERS/ATS+statement+on+interventional+pulmonology+European+Respiratory+Society/American+Thoracic+Society.">ERS/ATS statement on interventional pulmonology European Respiratory Society/American Thoracic Society.</a> Eur. Respir. J. 19, 356-373 (2002).</li><li>Ettensohn, D. B., Jankowski, M. J., Duncan, P. G., Lalor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+in+the+normal+volunteer+subject.+I.+Technical+aspects+and+intersubject+variability.">Bronchoalveolar lavage in the normal volunteer subject. I. Technical aspects and intersubject variability.</a> Chest. 94, 275-280 (1988).</li><li>Ettensohn, D. B., Jankowski, M. J., Redondo, A. A., Duncan, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+in+the+normal+volunteer+subject.+2.+Safety+and+results+of+repeated+BAL,+and+use+in+the+assessment+of+intrasubject+variability.">Bronchoalveolar lavage in the normal volunteer subject. 2. Safety and results of repeated BAL, and use in the assessment of intrasubject variability.</a> Chest. 94, 281-285 (1988).</li><li>De Brauwer, E. I., Jacobs, J. A., Nieman, F., Bruggeman, C. A., Drent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+fluid+differential+cell+count.+How+many+cells+should+be+counted.">Bronchoalveolar lavage fluid differential cell count. How many cells should be counted.</a> Anal. Quant. Cytol. Histol. 24, 337-341 (2002).</li><li>Mtunthama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malawians+permit+research+bronchoscopy+due+to+perceived+need+for+healthcare.">Malawians permit research bronchoscopy due to perceived need for healthcare.</a> J. Med. Ethics. 34, 303-307 (2008).</li><li>Pereira, W., Kovnat, D. M., Snider, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+cooperative+study+of+complications+following+flexible+fiberoptic+bronchoscopy.">A prospective cooperative study of complications following flexible fiberoptic bronchoscopy.</a> Chest. 73, 813-816 (1978).</li><li>Huang, Y. C., Bassett, M. A., Levin, D., Montilla, T., Ghio, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+phase+reaction+in+healthy+volunteers+after+bronchoscopy+with+lavage.">Acute phase reaction in healthy volunteers after bronchoscopy with lavage.</a> Chest. 129, 1565-1569 (2006).</li><li>Gritzfeld, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Human+Pneumococcal+Carriage.">Experimental Human Pneumococcal Carriage.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li></ol>

Andrea M. Collins está financiado por la Fundación Bill y Melinda Gates, y no hay posibles conflictos de intereses. Ella ha recibido fondos de Merck (MSD) y GSK para asistir a conferencias y honorarios por conferencias. 50 LBA de investigación realizaron de forma independiente. Jamie Rylance está financiado por el Wellcome Trust, y no tiene ningún conflicto de intereses. Ha recibido ningún otro fondo. 70 LBA de investigación realizaron de forma independiente. Daniel G. Wootton está financiado por una beca de doctorado NIHR, y no tiene ningún conflicto de intereses. 40 LBA de investigación realizaron de forma independiente. Angela D. Wright no tiene potenciales conflictos de intereses. Asistido con más de 100 LBA investigación. Adam KA Wright no tiene potenciales conflictos de intereses. Él ha procesado más de 50 muestras de BAL. Duncan G. Fullerton </strong&gt; No tiene potenciales conflictos de intereses. 100 LBA de investigación realizaron de forma independiente. Stephen B. Gordon no tiene potenciales conflictos de intereses. Él ha recibido fondos de Merck (MSD) y Novartis para asistir a conferencias. 400 LBA de investigación realizaron de forma independiente.

Con el fin de lograr buenos resultados los siguientes son útiles: <ol><li> Bueno Anesthetisation en la base de la lengua y la orofaringe posterior. Esto es importante, ya que mejora la tolerancia de procedimiento del sujeto y la comodidad general. </li><li> Cualquiera de una pediátrica (diámetro exterior 3.4-3.6 mm) o broncoscopio adulto (4.8 a 5.9 mm de diámetro exterior) se pueden utilizar. </li><li> Si hay cualquier incomodidad durante la intubación nasal, se prefiere intubación oral. En general la intubación nasal es ya sea una técnica sencilla o debe ser abandonada. </li><li> Después de la instilación inicial de lidocaína a la orofaringe, el sujeto puede preferir el broncoscopio para ser retirado a la espera de la aparición de la anestesia, especialmente si el broncoscopio se inserta por vía oral. </li><li> Asegúrese de por lo menos 10 x 10 ml jeringas están precargadas con sólo 2-4 ml de lidocaína. El aire debe ser dejado en las jeringas que permiten una mejor prestación de la anestesia directamente sobre los cables y muco endobronquialsa. </li><li> Desde la tos durante el procedimiento reduce significativamente BAL rendimiento; utilizando solución salina caliente y tener buenas anestesia de la mucosa son importantes para reducir esto. </li><li> Las jeringas de 50 ml deben ser precargadas con solución salina calentada. Es común para los primeros 50 ml de solución salina normal para producir inculcado entre 10-20 ml debido a la pérdida del espacio muerto y el resto se ejecuta en las vías aéreas terminales. Otras partes alícuotas de devolver una cantidad mayor proporción de fluido. </li><li> El operador siempre debe comprobar el broncoscopio antes de la intubación, incluida la garantía de succión efectiva mediante la aspiración de solución salina normal estéril. Pérdida de succión puede ocurrir comúnmente debido a la formación de cocas en el tubo o fugas alrededor de las conexiones con el broncoscopio o dispositivo de succión. </li><li> Durante la aspiración manual, idealmente la vía aérea no debería colapsar. Si succión colapsa de forma recurrente de las vías respiratorias, los rendimientos BAL se reducen a un mecanismo de válvula, y la inflamación y el sangrado local es más probable: esto a su vez hace que las vías respiratorias mmineral irritable y tos más probable. Por lo tanto, La elección de la rama subsegmental RML más apropiado y el uso de bajas presiones de succión son a la vez importantes. </li><li> Cuando el aire se aspira constantemente vuelva a comprobar la conexión de la jeringa para el broncoscopio y también la posición del broncoscopio en la vía aérea distal. Si se trata de un problema recurrente, post-procedimiento asegúrese de que no hay agujeros en el propio broncoscopio. </li><li> BAL de los fumadores a menudo es más oscuro debido a la presencia de partículas intracelulares. Los fumadores pueden tolerar la broncoscopia menos bien, y tienen aumento de la tos. </li><li> El preferible rendimiento de volumen BAL es&gt; 100 ml. Se obtuvo un rendimiento de&gt; 150 ml es excelente. No hemos tenido ningún rendimiento&gt; 170 ml. No existe una relación lineal entre el rendimiento celular y el rendimiento de volumen BAL. </li><li> Los rendimientos de &lt;100 ml son, en nuestra experiencia, más probabilidades de dar lugar a efectos secundarios tales como tos, dolor en el pecho y fiebre. Aconsejamos que los sujetos con rendimientos de &lt;100 ml Sea recoVered en la posición de lateral izquierdo, esto puede ayudar al drenaje de cualquier líquido pulmonar restante. </li><li> Contacto clínico debe hacerse con el sujeto dentro de 1-5 días para asegurar sin efectos secundarios. </li><li> Sedación midazolam se utiliza para el &lt;50% de los sujetos en el Reino Unido y &lt;5% en Malawi. El midazolam no parece mejorar directamente la tolerabilidad, algunos operadores consideran que la sedación a veces puede ser contraproducente en el mantenimiento de un diálogo coherente (y tranquilizador) con el tema. </li><li> En nuestra experiencia, hay una curva de aprendizaje significativa con esta técnica. Por ejemplo la coordinación entre el médico y la enfermera toma tiempo y los rendimientos son a menudo más bajos al comienzo del proceso de aprendizaje. </li><li> En sujetos VIH positivos, utilizamos los antibióticos de manera profiláctica prebronchoscopy. </li></ol>

Fondo La fibrobroncoscopia fue desarrollado para la práctica clínica, sino que es ampliamente utilizado tanto en el diagnóstico y terapéutica 1,2. El lavado broncoalveolar (BAL) elimina las células no adherentes y de pulmón fluido de recubrimiento de la superficie de la mucosa; biopsia se utiliza para muestrear tejidos de la mucosa y de la submucosa. En entornos de investigación, BAL permite respuestas de muestreo de innata (macrófagos pulmonares 3-5), celular (-B y las células T 6), y humorales (inmunoglobulina 7) en el pulmón. BAL está internacionalmente aceptado para fines de investigación 8 y desde 1999 la técnica se ha realizado en&gt; 1.000 sujetos en el Reino Unido y Malawi por nuestro grupo. Utilizamos esta técnica en el estudio de la respuesta inmune innata, celulares y humorales al antígeno de neumococo incluidos experimental carro humana neumocócica 9,17, biomasa humo 5, VIH y vacunación, y Stu tratamiento complementariomuere en la recuperación de una neumonía. Nuestra técnica utiliza una succión suave de mano de fluido instilado; este está diseñado para maximizar el volumen BAL devuelto y aplicar fuerza de corte mínima en el epitelio ciliado con el fin de preservar la estructura y función de las células dentro del fluido BAL. En un contexto de investigación BAL utiliza una técnica diferente de la practicada por los médicos de atención respiratoria e intensivas (a menudo denominado lavado bronquial, lavados, lavado, o BAL) que aspiran a obtener un beneficio diagnóstico o terapéutico. La técnica de investigación está diseñado para cosechar las células y preservar la viabilidad para facilitar el crecimiento de células en cultivo ex vivo. Por estas razones, la técnica de investigación utiliza un mayor volumen instilado (típicamente en el orden de 200 ml) y se emplea de succión manual para reducir el daño celular. Los pacientes reciben anestesia local, ofrecen sedación consciente (midazolam), y toleran el procedimiento bien con efectos secundarios mínimos. Subjetivo verbal y escritainformación t mejora la tolerancia y el consentimiento informado por escrito es obligatorio 1. Meta El objetivo general es que el procedimiento debe ser seguro y efectivo. Los sujetos no deben experimentar ninguna alteración fisiológica y los operadores deben recoger sistemáticamente superiores a 100 ml de BAL de los sujetos. Después del procedimiento, los sujetos deberían experimentar efectos secundarios mínimos. Seguridad Seguridad de la asignatura es de suma importancia. Los sujetos son cuidadosamente seleccionados con criterios de inclusión y exclusión claros. Este protocolo incluye una descripción de los riesgos potenciales y las medidas adoptadas para mitigarlos. Las contraindicaciones de la broncoscopia investigación pueden expresarse como absoluta o relativa, y están incluidos en el protocolo de estudio como criterios de exclusión y de inclusión. Nuestros temas están seleccionados para garantizar la plena salud. Las contraindicaciones absolutasincluir columna inestable de cuello uterino, la hipoxia no responde, la angina de pecho inestable, diátesis hemorrágica, y arritmia cardíaca maligna. Las contraindicaciones relativas, incluso las condiciones asociadas con el aumento de las tasas de complicaciones, incluyen: General: poco cooperativa sujeto 1, cualquier problema significativo de medicina general por ejemplo, la epilepsia, la anterior broncoscopia mal tolerado, conocido reacciones adversas a la lidocaína o midazolam, el embarazo, la mala nutrición. Respiratoria: hipoxia [saturaciones (SATs) en el aire &lt;94%], hipercapnia, asma inestable 1, la función respiratoria deteriorada significativamente 1 (FEV 1 &lt;1 L), la hipertensión pulmonar. Cardiovascular: uremia, dentro de las 6 semanas de infarto de miocardio 1, obstrucción de la vena cava superior. Otros: inmunosupresión (nuestro grupo realiza regularmente este procedimientomiento en sujetos VIH positivos). Vea la Tabla 1 - Los riesgos asociados con BAL para la investigación.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:966px;" width="966">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:25px;">
			Material
			</td>
			<td style="width:161px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:151px;height:25px;">
			Catalogue Number
			</td>
			<td style="width:410px;height:25px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Fibreoptic bronchoscope, light and suction source
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Surgical gown, sterile gloves
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sphygnomanometer
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For continuous patient monitoring
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Pulse oximeter
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For continuous patient monitoring
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			3 lead ECG monitor
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For continuous patient monitoring
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Nasal oxygen delivery 2-4l/min
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Lidocaine 10% spray (Xylocaine)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			AstraZeneca
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For topical anaesthesia
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Lidocaine hydrochloride 2%
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For topical anaesthesia
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Lidocaine gel (Instillagel)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Farco-Pharma, Germany
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Normal saline, sterile 200ml
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Warm to 30oC
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			10ml taper-end syringe (x10)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For administration of lidocaine
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Intravenous cannula 18G
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For administration of midazolam
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Midazolam
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For sedation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Flumazenil
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Reversal of benzodiazepine sedation (emergency use only)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			60ml taper-end syringes (x4)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For normal saline injection and BAL fluid withdrawal.
			May require connector to attach to the injection port of the bronchoscope
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sterile gauze swab
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Vernaid, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sterile container for BAL fluid
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			See text and comments
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Siliconised glass bottles reduce macrophage adherence. Alternatively, 50ml centrifuge tubes may be used (total capacity 200ml)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sigmacote
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			SL2
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Only if siliconised glass bottles used. NB: Harmful and flammable. If used, follow precautions detailed in manufacturer&#8217;s MSDS
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Centrifuge
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;"></td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			At least 4x50ml tube capacity. Refrigeration to 4oC preferred.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Shandon Cytospin centrifuge
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Thermo Scientific, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			RPMI 1640 medium with L-glutamine
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			R8758
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Fetal bovine serum
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			F6178
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Penicillin-Streptomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			P4333
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Amphotericin B
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			A2942
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Tissue culture plates
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Greiner Bio-One, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			662160
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Glass microscope slides
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Shandon cytofunnel
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Thermo Scientific, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			A78710003
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Shandon cytoclip
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Thermo Scientific, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			59910052
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Hemacolor staining set (fixative, red and blue reagents)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Merck, Germany
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			111661
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Use according to manufacturer&#8217;s instructions
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bronchoalveolar lavage (bal) for research; obtaining adequate sample yield

Se describe una técnica de investigación para la fibrobroncoscopia con lavado broncoalveolar (BAL) utilizando la succión de mano manual para eliminar las células no adherentes y fluido del revestimiento del pulmón de la superficie de la mucosa. En entornos de investigación, BAL permite el muestreo de innata (macrófagos de pulmón), las respuestas celulares (B-y células T), y humoral (inmunoglobulina) en el pulmón. BAL está aceptado internacionalmente con fines de investigación y desde 1999 la técnica se ha realizado en&gt; 1.000 sujetos en el Reino Unido y Malawi por nuestro grupo. Nuestra técnica utiliza una succión suave de mano de fluido instilado; este está diseñado para maximizar el volumen BAL volvió y aplicar fuerza de corte mínima en el epitelio ciliado con el fin de preservar la estructura y función de las células dentro del fluido BAL y para preservar la viabilidad para facilitar el crecimiento de células en cultivo ex vivo. Por tanto, la técnica de investigación utiliza un mayor volumen inslavaje (típicamente en el orden de 200 ml) y se emplea de succión manual para reducir el daño celular. Los pacientes reciben anestesia local, ofrecen sedación consciente (midazolam), y toleran el procedimiento bien con efectos secundarios mínimos. Información sujeta verbal y escrito, mejora la tolerancia y el consentimiento informado por escrito es obligatorio. Seguridad de la asignatura es de suma importancia. Los sujetos son cuidadosamente seleccionados con criterios de inclusión y exclusión claros. Este protocolo incluye una descripción de los riesgos potenciales y las medidas adoptadas para mitigarlos, una lista de contraindicaciones, pre-y los controles posteriores al procedimiento, así como las técnicas de broncoscopia y de laboratorio precisos.

Los buenos resultados clínicos son un volumen BAL de más de 100 ml y un sujeto que ha experimentado a lo sumo, una leve molestia (ver Tabla 1). Esto requiere de un sujeto relajado y cooperativo. El médico debe estar seguro, completamente preparado (Materiales), y la comprensión hacia el voluntariado. Variabilidad inter e intra-sujetos en el rendimiento celular (incluyendo recuento diferencial) se ha descrito. Diferencial de células de sujetos sanos son típicamente&gt; 90% de macrófagos con un pequeño número de neutrófilos (&lt;2%) y linfocitos (5-10%). BAL células se centrifugaron sobre portaobjetos de microscopio se pueden teñir con un tinte nuclear diferencial para obtener esta información (Figura 1). En la Figura 1, las células de BAL han sido fijadas y teñidas usando tinción Hemacolor de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Al menos 300 células se deben contar para obtener resultados fiables de los macrófagos,neutrófilos y linfocitos; 500 células para tipos de células raras. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Peligro </td><td> Riesgo </td><td> Reducido en este protocolo a través de: </td></tr><tr><td colspan="3"> Efecto de la broncoscopia y BAL 1, 14 </td></tr><tr><td> Molestias leves </td><td> &lt;25% 14, # </td><td> Analgesia y sedación adecuada. Enfoque Confiado y atento al tema. </td></tr><tr><td> Epistaxis </td><td> &lt;1% # </td><td> Presión leve por sólo intubación nasal. Si el malestar tema o menor apertura de diafragma - intubación oral en su lugar. </td></tr><tr><td> Hemorragia endobronquial (hemoptisis) </td><td> &lt;0,1% * 15 </td><td> No biopsias tomadas. El control cuidadoso durante la broncoscopia - evitando la mucosa respiratoria. </td></tr><tr><td> Nausea, vómitos y aspiración neumonía </td><td> &lt;0,02% 14, # </td><td> Ayuno para el alimento sólido&gt; 4 horas antes del procedimiento 1. Anestesia tópica adecuada. Posición semisentada durante el procedimiento. Una cuidadosa observación post-procedimiento. </td></tr><tr><td> Fiebre </td><td> 0,01 para 14 - 1% #, 16 </td><td> Se relaciona con la inflamación, y puede minimizarse mediante la recolección máxima de BAL. Lóbulo individual BAL solamente. # </td></tr><tr><td> Nariz dolorida / garganta y ronquera </td><td> &lt;25% 14, # </td><td> Anestesia tópica adecuada de la nariz, la garganta y la laringe (minimizando la tos). </td></tr><tr><td> Infección </td><td> &lt;0,1% de VIH negativo, 1% en VIH positivo 14, # </td><td> Procedimiento de lavado broncoscopio estándar 1. Lóbulo individual BAL solamente. # El reconocimiento precoz de la infección: examen clínico dentro de 1 hora unad contacto clínico en 1-5 días después de la broncoscopia. </td></tr><tr><td> Dolor en el pecho / tos </td><td> &lt;0,2% 14, # </td><td> Lóbulo individual BAL solamente. Colección Maximal BAL. # </td></tr><tr><td colspan="3"> Efectos de las drogas: la lidocaína, midazolam </td></tr><tr><td> Arritmia </td><td> Muy raras * </td><td rowspan="3"> Máximo de 5 mg / kg 14 lidocaína utilizada. Al calor de solución salina normal inculcado. # La oximetría de pulso (SATs&gt; 90% con la administración de suplementos de oxígeno), la monitorización cardiaca durante todo el procedimiento. Antagonista de las benzodiazepinas (flumazenil) disponible de inmediato. </td></tr><tr><td> Desorientación / agitación </td><td> &lt;0,1% † # </td></tr><tr><td> Depresión respiratoria Cardio </td><td> Muy raras * </td></tr></tbody></table> * No experiencia de nuestro grupo en más de 1.500 procedimientos de investigación. † idiosyncratic en lugar de la reacción dependiente de la dosis. # La experiencia de nuestro grupo en más de 1.500 procedimientos de investigación. Tabla 1. Los riesgos asociados con BAL para la investigación. Esto incluye el peligro o riesgo y cómo esto se reduce mediante el uso de la técnica descrita. Efectos de la broncoscopia / BAL y también los efectos de alguna droga medicinales utilizadas están incluidos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/4345/4345fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Un portaobjetos de microscopio Mostrando BAL macrófagos y neutrófilos ocasionales. BAL células se han corregido en metanol y se tiñeron con rojo Hemacolor (eosina Y) y azul (azur B).

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Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Se describe una técnica de investigación para la fibrobroncoscopia y el lavado broncoalveolar mediante succión baja presión. La técnica se utiliza para cosechar células inmunes de las superficies broncoalveolar de pulmón. Se utiliza anestesia local y sedación consciente leve (midazolam). Los sujetos toleran bien el procedimiento y experimentan efectos secundarios mínimos.

Lavado broncoalveolar (BAL) de Investigación; obtención de rendimiento adecuado de la muestra

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

bronchoalveolar-lavage-bal-for-research-obtaining-adequate-sample

Research

JoVE Journal

Medicine

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

73.0K vistas.  National Institute for Health Research.  Se describe una técnica de investigación para la fibrobroncoscopia y el lavado broncoalveolar mediante succión baja presión. La técnica se utiliza para cosechar células inmunes de las superficies broncoalveolar de pulmón. Se utiliza anestesia local y sedación consciente leve (midazolam). Los sujetos toleran bien el procedimiento y experimentan efectos secundarios mínimos. 

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Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer specimens and clinical data to be available to researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database also captures a large volume of genomic and proteomic data obtained from various tumor tissue studies. A team of clinical and basic science researchers, a biostatistician, and a bioinformatics expert was convened to design the database. Variables of interest were clearly defined and their descriptions were written within a standard operating manual to ensure consistency of data annotation. Using a protocol for prospective tissue banking and another protocol for retrospective banking, tumor and normal tissue samples from patients consented to these protocols were collected. Clinical information such as demographics, cancer characterization, and treatment plans for these patients were abstracted and entered into an Access database. Proteomic and genomic data have been included in the database and have been linked to clinical information for patients described within the database. The data from each table were linked using the relationships function in Microsoft Access to allow the database manager to connect clinical and laboratory information during a query. The queried data can then be exported for statistical analysis and hypothesis generation.

A thoracic oncology database was developed to serve as a comprehensive repository for clinical and laboratory data for the purposes of translational research. The database will serve translational cancer researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database is adaptable to other cancer models, as well as other human diseases.

Generación de base de datos integral de Oncología Torácica - Herramienta para la Investigación Traslacional

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Investigación

Medicina

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Bilateral Común oclusión de la arteria carótida como un estímulo de preacondicionamiento adecuado para inducir la tolerancia isquémica precoz de isquemia cerebral focal

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Trabajar con Tejidos Humanos para la Investigación del Cáncer Traslacional

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future therapies. Severe lung injury with a reproducible deterioration of pulmonary gas exchange and hemodynamics can be induced in anesthetized pigs using repeated lung lavages with warmed 0.9% saline (50 ml/kg body weight). Including standard respiratory and hemodynamic monitoring with clinically applied devices in this model allows the evaluation of novel therapeutic strategies (drugs, modern ventilators, extracorporeal membrane oxygenators, ECMO), and bridges the gap between bench and bedside. Furthermore, induction of lung injury with lung lavages does not require the injection of pathogens/endotoxins that impact on measurements of pro- and anti-inflammatory cytokines. A disadvantage of the model is the high recruitability of atelectatic lung tissue. Standardization of the model helps to avoid pitfalls, to ensure comparability between experiments, and to reduce the number of animals needed.

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Repeated pulmonary lavages in anesthetized pigs induce lung injury resembling major aspects of human acute respiratory distress syndrome (ARDS). For this purpose the lungs are repeatedly lavaged with 0.9% saline at 37 &#176;C. The goal of the protocol is a reproducible mitigation of gas exchange and hemodynamics for research in ARDS.

Lavado inducida por agotamiento de surfactante en los cerdos como modelo del síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ function. Clarifying the mechanism of blood vessel formation is therefore extremely useful for elucidating developmental processes and pathological mechanisms. Murine hind-limb vessels are often used as a model for physiological and pathological angiogenesis. Evaluation is mainly performed via a two-dimensional method using tissue sections. However, methods for evaluating three-dimensional (3D) vascular morphology are particularly limited. This paper introduces a method for visualizing murine hind-limbs using computed tomography (CT). Radiation-opaque resin is injected through the descending aorta, and whole vessels are filled with dye. By adjusting the time of dye injection, arterial-specific filling is also possible, and samples can be obtained with any micro-X-ray CT device. This contrast method provides a basic technique for the 3D evaluation of murine blood vessels in the lower extremities. Furthermore, this method can be used to visualize all blood vessels below the diaphragm and evaluate blood vessels in the abdominal organs.

Here, we describe a visualization and quantification method for murine hind-limb vessels using micro-X-ray computed tomography.

Preparación de muestras para la visualización tridimensional basada en tomografía computarizada de vasos murinos de las extremidades posteriores

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

Técnica para la obtención de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo y caracterización de fracciones vasculares estromales en criopreservación a largo plazo

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Aislamiento del mesénquima intestinal murino que resulta en un alto rendimiento de telocitos

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Preparing Zanba-Stir-Fried Tiebangchui (TBC) Sample for Processing Technology Optimization

To begin a single factor experiment to compare Tiebangchui, or TBC slice thickness, for processing technology optimization, prepare five test groups each having 30 grams of TBC, but different slice thickness. Then weigh 90 grams of Zanba, which is three times as much as that of the TBC in each group. Set the temperature and the time of the automatic stir fry machine to 140 degrees Celsius and 40 minutes respectively.After the machine has heated up to the set temperature, add the weighed amounts of TBC and Zanba into the machine. Then using a high speed smashing machine, grind the Zanba stir-fried TBC into powder. Next, weigh two grams of Zanba stir-fried TBC powder in a conical flask.To the sample in the flask, add three milliliters of ammonia solution followed by 50 milliliters of a mixture of isopropyl alcohol and ethyl acetate, having a volume ratio of one is to one. After recording the weight of the conical flask with the contents, ultrasonicate the TBC sample for 30 minutes at 220 volts and 40 kilohertz maintaining a temperature below 25 degrees Celsius. Weigh the conical flask with the sample once again after the ultrasonic extraction.Make up for the lost weight by adding the isopropyl alcohol and ethyl acetate mixture mentioned previously, and filter the sample solution. Evaporate 25 milliliters of the filtrate to dryness using a rotary evaporator at 40 degrees Celsius. Then dissolve the residue in five milliliters of a solution of 0.05 hydrochloric acid in methanol.Filter the solution through a 0.2 micron syringe filter, and analyze it by performing high performance liquid chromatography, or HPLC. Calculate the contents of the MDA and DDAs in different processing products according to the standard curve. Calculate the comprehensive score based on the results via the critic method.Following the method demonstrated above, compare the amounts of Zanba, processing temperatures, and times for processing technology optimization. The results of the single factor tests revealed that the comprehensive scores of Zanba stir-fried TBC were highest when the sliced thickness is two centimeters, the amount of Zanba is three times, the processing temperature is 120 degrees Celsius, and the processing time is 60 minutes. The results revealed the range of slicing thickness, amount of Zanba, processing temperature, and processing time to be used for future experiments.

Preparación de la muestra de tiebangchui (TBC) salteada por zanba para la optimización de la tecnología de procesamiento

Descubrimiento de biomarcadores no invasivos para la proteómica lagrimal mediante LC-MS

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

Autor destacado: Avance del análisis del líquido lagrimal mediante un protocolo estandarizado para la investigación proteómica 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

Preparación de muestras con captura de suspensión de proteínas para proteómica lagrimal mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...