Este protocolo proporciona un modelo reproducible de la neumonía que genera una lesión pulmonar aguda robusta. Otras ventajas de este modelo es que se puede utilizar para reproducir el SDRA infeccioso o el síndrome de dificultad respiratoria aguda en ratones. Como mencioné, este modelo es altamente reproducible donde el nivel de mortalidad y lesión se puede ajustar fácilmente para evaluar las fases tempranas y tardías de la lesión pulmonar aguda y su resolución, lo que sirve como plataforma para evaluar estrategias terapéuticas.
Aunque este protocolo no proporciona un enfoque novedoso para el diagnóstico o tratamiento de la lesión pulmonar, es un modelo fiable donde se pueden probar nuevas terapias, lo que resulta especialmente útil para áreas relacionadas con la inmunología, las enfermedades pulmonares y las enfermedades infecciosas. Una de las ventajas de esta técnica es su reproducibilidad. Sin embargo, las personas que realizan esta técnica por primera vez pueden experimentar dificultades para insertar el catéter por vía intratraqueal.
Es por eso que idealmente, las personas que aprenden esta técnica deberían comenzar a practicar en animales eutanasiados. Para comenzar, caliente una placa de agar sangre durante 10 minutos a 37 grados centígrados en una coctelera o incubadora caliente. Tome un nuevo vial de reserva bacteriana del congelador y descongélelo agitándolo suavemente en un baño de agua a 37 grados centígrados hasta que el vial esté completamente descongelado.
Evite tocar la junta tórica o la tapa con agua tibia. Para contar manualmente las colonias bacterianas en una placa, realice una dilución de 1 vez 10 a la sexta y coloque 200 microlitros de la última dilución en una placa de agar sangre precalentada. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, determine la nueva concentración bacteriana aplicando la fórmula dada. Coloque el ratón anestesiado sobre una superficie limpia y esterilizada. Cuelgue el ratón por los incisivos y pegue suavemente las extremidades delanteras.
Afeitar la región del cuello y desinfectar la zona con clorhexidina y alcohol al 70%. Luego, con unas tijeras quirúrgicas, haga una incisión de un centímetro en la línea media superficial del cuello para visualizar la tráquea. Si se observa una abundancia de tejido graso, diseccione cuidadosamente el tejido adiposo verticalmente para visualizar la tráquea.
Tire suavemente de la lengua hacia afuera e introduzca un angiocatéter de calibre 20 a través de la boca, avanzando el catéter hacia la tráquea. Aplique una presión suave sobre la tráquea para facilitar la intubación. Después de la intubación, conecte el ratón a un respirador para confirmar la intubación.
Ajuste los parámetros del ventilador a 200 microlitros de volumen corriente y 200 golpes por minuto. Después de confirmar la intubación, desconecte el ratón del respirador y instile cuidadosamente 50 microlitros del agente bacteriano a través del catéter angioico con una pipeta de 200 microlitros, punta de carga de gel. Después de la instalación, vuelva a conectar el mouse al respirador para ayudar a reiniciar la respiración.
Deje el ratón en el respirador durante 30 a 60 segundos para controlar la respiración. Si se observa un patrón de respiración lenta, vuelva a conectar el ratón al respirador. Cierre la incisión agregando una gota de pegamento a la piel.
Junta los pliegues de la piel y aplica una presión suave hasta que el pegamento se seque. Coloque el ratón eutanasiado en decúbito supino sobre una tabla quirúrgica limpia y cuélguelo por los incisivos. Después de rociar la piel del ratón con etanol al 70%, con unas tijeras, haga una pequeña escisión superficial de la línea media del cuello para visualizar la tráquea.
Cánula de la tráquea con un catéter de calibre 20 y agregue cuidadosamente un mililitro de PBS libre de calcio por vía intratraqueal con una jeringa de un mililitro. Permita la expansión completa del pulmón, luego aspire el líquido con la misma jeringa. Repita el procedimiento dos veces para un total de dos mililitros.
Transfiera el lavado broncoalveolar, o BAL, a una alícuota de dos mililitros. Con unas tijeras, abra la cavidad torácica para exponer el pulmón, el corazón y la tráquea. Diseccione cuidadosamente el diafragma y retire la caja torácica, asegurándose de no pellizcar el tejido pulmonar.
Transectar la aorta abdominal para permitir la exanguinación. Perfundir el tejido pulmonar haciendo una pequeña incisión de aproximadamente uno a dos milímetros en el ventrículo derecho con unas tijeras e inyectando cinco mililitros de PBS frío, utilizando un catéter de calibre 20. Tras una perfusión exitosa, el tejido pulmonar se vuelve blanco y pálido, y el PBS abandona el compartimento intravascular a través de la aorta abdominal.
A continuación, extraiga cuidadosamente el pulmón y diseccionelo de la tráquea. Alternativamente, si el pulmón se está utilizando para la histología, inserte cuidadosamente un catéter de calibre 20 para inflar los pulmones hasta 25 centímetros con una solución de formalina. Una vez que los pulmones estén insuflados, pase una cuerda de sutura 3/O de unos cinco centímetros de largo por debajo de la tráquea y átela firmemente dos veces para asegurarse de que la formalina permanezca en el tejido pulmonar.
Diseccione suavemente el pulmón del resto de los tejidos y colóquelo en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de solución de formalina. Centrifugar el BAL a 500 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos y retirar el sobrenadante libre de células en un tubo separado. Lisar los glóbulos rojos añadiendo 100 microlitros de tampón lisante durante un minuto.
Neutralizar la reacción de lisis añadiendo un mililitro de PBS. Centrifugar el BAL y eliminar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 100 a 300 microlitros de PBS. A continuación, realice un recuento de células con tinción de azul de tripano al 0,4% mediante recuento de células automatizado.
Diseccione suavemente el pulmón de los tejidos en un tubo cónico de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de PBS frío. Después de la disección, retire el pulmón del PBS y séquelo con una toalla de papel. Diseccionar el pulmón derecho e izquierdo de otros tejidos que también se extrajeron como la tráquea.
Prepare un cóctel de digestión como se describe en el manuscrito del texto y transfiera el pulmón a un tubo C que contenga un mililitro de cóctel de digestión. Transfiera el tubo al disociador de tejidos y siga el protocolo estandarizado para el procesamiento de tejido pulmonar. Después de la disociación, agregue 10 mililitros de PBS frío en el tubo y mezcle correctamente.
Filtre la suspensión unicelular con un colador de celdas de 70 micras sobre un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Centrifugar la suspensión y retirar el sobrenadante. Añadir un milímetro de tampón lisante durante un minuto a temperatura ambiente.
A continuación, añada 10 mililitros de PBS frío para detener la reacción de lisis y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en PBS y realice un recuento de células con tinción de azul de tripán mediante recuento de células automatizado. Después de la lesión pulmonar inducida por neumonía bacteriana en ratones, los grupos infectados mostraron un peso corporal más bajo en comparación con el control no infectado.
El grupo de Streptococcus pneumoniae o Spn recuperó su peso corporal hacia el valor basal, mientras que los ratones infectados con Klebsiella pneumoniae o Kpn mostraron una recuperación lenta después de seis días de infección. La concentración de la proteína BAL y el recuento total de células tanto para el BAL como para los pulmones fueron marcadamente más altos en los grupos infectados. Se obtuvieron secciones histológicas representativas que muestran el proceso inflamatorio en ambos modelos en los días dos, cuatro y seis después de las inoculaciones, mostrando evidencia de inflamación alveolar persistente en los ratones infectados con Kpn, incluso en el día 10.
Los ratones infectados con Kpn continuaron la lesión al día 10, mientras que los ratones infectados con Spn resolvieron la inflamación pulmonar al sexto día. El paisaje de las células inmunitarias mediante citometría de flujo multicolor después de seis días de infección por Spn mostró un mayor número de granulocitos, macrófagos intersticiales, monocitos, células B y células T, incluidas las células asesinas naturales. Al intentar este método, la inserción del catéter es la clave para tener infecciones replicables.
Se trata de un método fiable que sirve de plataforma para la identificación de dianas para el estudio y la resolución de la lesión pulmonar aguda.
