Los autores desean agradecer a Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material de comandos (números de concesión W81XWH-09-1-0386 y W81XWH-10-1-0806) para el apoyo financiero y el Dr. Shawn Rigby del Fondo Estatal de Iowa Citometría de flujo para la Universidad su experto en asistencia técnica.

1. La recolección macrófagos alveolares (AMɸ) del ratón usando lavado pulmonar <ol><li> Use equipos de protección personal (EPP), como una bata de laboratorio, guantes desechables y protección ocular adecuada. </li><li> Preparar completa AMɸ (cAMɸ) medio antes del inicio de la cosecha. Añadir 2,5 ml de penicilina / estreptomicina (penicilina / estreptomicina) solución, 250 l de β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol), y 25 ml de inactivado por calor suero fetal bovino (SFB) a 222,25 ml de medio modificado Dulbelcco de Eagle (DMEM). Filtro de esterilizar a medio cAMɸ con un 0,2 micras de tamaño de poro botella de filtro superior al vacío. </li><li> La eutanasia de un ratón sano por asfixia de CO 2 en una cámara de la eutanasia. Aunque un ratón C57BL / 6 (6-8 semanas de edad) se utilizó para los fines de este proyecto, esta técnica lavado pulmonar se puede realizar en cualquier cepa de ratón. El uso de un cilindro de gas comprimido, permitir el flujo de gas en la cámara durante 1 min antes de colocar el ratón en el CHámbar para asegurar que la cámara está completamente cargada con CO 2. Coloque el ratón en la cámara por lo menos durante un minuto para eutanasia el ratón. Además, exsanguinate cada ratón a través de punción cardíaca como un método físico para confirmar la muerte del ratón como se describe en 1,4. </li><li> Coloque el cursor sobre la espalda (dorso), rocíe con etanol al 70%, localizar el esternón y, en un ángulo de 30 grados desde el abdomen, inserta una aguja de calibre 23 (unida a una jeringa de 1 ml) de unos 50 mm en la cavidad torácica . Con la colocación correcta de la aguja, debería ser posible recoger entre 0,4 a 1 ml de sangre en función del tamaño del ratón. Examinar el animal para el cese de los signos vitales. </li><li> Coloque el ratón sobre el banco de laboratorio por lo que está acostado sobre su abdomen (parte ventral). Aerosol ratón con etanol al 70% para esterilizar el medio ambiente de trabajo. Pellizque la piel a mitad de la columna vertebral del ratón. Con una tijera de disección que han sido esterilizadas con etanol al 70%, hará una pequeña incisión a través de la piel. &lt;/ Li&gt; <li> Agarra la piel en ambos lados de la incisión y tirar de la piel en direcciones opuestas a lo largo del eje cráneo-caudal del ratón. Cuando se hace correctamente, la piel se separan del cuerpo subyacente. </li><li> El cuello del ratón ahora debe mostrar los músculos expuestos y las glándulas. Corte con cuidado de que el tejido y tire de ella hacia la parte anterior del mouse el uso de fórceps, con lo que la exposición de la laringe, la tráquea y el esófago del ratón. Evite cortar la vena yugular o la arteria carótida. </li><li> La tráquea es ahora visible y se puede identificar como el tejido con anillos cartilaginosos que la rodean. Delicadamente mantenga la tráquea con fórceps y suavemente levantar y separar la tráquea desde el esófago, que está situado en el lado dorsal. </li><li> Haga una pequeña incisión anterior, donde se sostiene la tráquea, pero por detrás de la laringe. La incisión debe hacerse aproximadamente a un ángulo de 45 ° grado. Además, no completamente seccionar la tráquea, ya que esto evitará que se retraiga enla cavidad del cuerpo. </li><li> Llenar una jeringa de 1 cc equipado con un catéter gato Tom con PBS estéril en preparación para insertar el catéter en el lumen de la traquea. Mantenga la tráquea con unas pinzas y con la mano sujetando el catéter cerca de la punta para aumentar el control y suavemente insértelo en el sitio de la incisión traqueal. Suavemente insertar catéter en la tráquea alrededor de 20 mm. Sujetar la tráquea que es alrededor del tubo de catéter, liberando la otra mano. </li><li> Con una jeringa de 1 ml equipado con el catéter, fundan suavemente con 0,75 ml de la temperatura ambiente, PBS estéril en los pulmones y luego suavemente la parte posterior aspiración de PBS en la jeringa. Repita este proceso tres veces, mientras que el exterior de masaje en el pecho. Desconectar la jeringa del catéter y dispensar el líquido de lavado en un tubo de centrífuga de 15 ml. Después de llenar la jeringa con 0,75 ml de PBS fresco y volver a conectar la jeringa al catéter, repetir los pasos 1,9 y 1,10 veces para cada ratón. La recuperación del fluido puede ser parcial, obteniendo menos de la VOlume infundido. Si la recolección de células procedentes de más de un ratón, colocar el tubo de 15 ml con las células recolectadas en hielo hasta que todos los lavados pulmonares se han realizado. </li></ol> 2. El tratamiento de lavado pulmonar AMɸ Cosecha <ol><li> Centrifugar el líquido de lavado pulmonar a 250 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Utilizando una técnica estéril, el sobrenadante se decanta en un recipiente apropiado para desechos dentro de un gabinete de bioseguridad. Resuspender el botón celular rastrillando suavemente el tubo de centrífuga a través de la parte superior de un bastidor de tubo de ensayo. Añadir 1 ml de medio de cAMɸ para volver a suspender las células. </li><li> Enumerar las células utilizando un Partículas Coulter Counter Z1 pipeteando 20 l de células en 10 ml de Isoton II diluyente en vial contador Coulter. Agregue 3 a 4 gotas de Zap-oglobin reactivo II lítico en el vial, los tiempos de invertir suavemente 3 a 4 y luego cargar la cubeta de análisis sobre el mostrador para obtener una concentración celular. Asegúrese de programar el contador con un factor de dilución de 2 x 10 4 para mostrar lapila de concentración como el número de células por ml. </li><li> Diluir las células de 2,5 x 10 5 por ml usando medio cAMɸ. </li><li> Dispensar 2 ml de 2,5 x 10 5 células / ml en cada pocillo de una placa de tejido 6-pocillos. </li><li> Para enriquecer para AMɸ, las placas de cultivo se incuban dentro de un 37 ° C incubadora humidificada con un 5% de CO 2 ambiente durante 6 horas para permitir que las células se adhieran a la parte inferior del pozo. Aspire con cuidado el sobrenadante y no perturbar las células adherentes. </li><li> Lavar los pocillos con PBS estéril (libre de calcio y magnesio) para eliminar las células no adherentes y escombros. Añadir 2 ml de medio de cAMɸ a cada pocillo. </li><li> Se incuban las células durante la noche dentro de un 37 ° C incubadora humidificada con un 5% de CO 2 ambiente antes de la adición de estimulantes. Después de esta etapa de enriquecimiento, aproximadamente el 87% de las células son positivos para el macrófago marcadores CD11b y F4/80 (figura 2c). </li></ol> 3. La adición de PolyanhydridLas nanopartículas y tratamientos electrónicos de control <ol><li> Fabricar las nanopartículas a través de polianhidrido antidisolvente nanoencapsulación 15. En este proceso, el polímero se disuelve en cloruro de metileno (4 ° C a una concentración de 25 mg / ml) y se precipitó en pentano (-20 ° C en un cloruro de metileno relación 1:200: pentano). </li><li> Pesar utilizando nanopartículas polianhídrido esterilizada peso del papel en el equilibrio que se puede medir con precisión las cantidades de microgramos. Añadir partículas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Volver a suspender las nanopartículas en el hielo frío cAMɸ. Los cálculos se realizan de tal manera que no más de 0,3 ml de medio se añade a cada pocillo para obtener la concentración deseada de nanopartículas. Mantener las partículas resuspendidas en hielo hasta que las nanopartículas se añade al cultivo así. </li><li> Antes de la adición de las nanopartículas a los cultivos AMɸ, sonicar partículas usando un sonicador parte superior del banco con una micropunta. Esterilizar micropunta por pulverización con 70% de etanol y wiping con una Kimwipe estéril antes de sonicación. Someter a ultrasonidos a 10-20 julios de 30 a 45 s mientras se mantiene el tubo en hielo. Observar macroscópicamente suspensión de nanopartículas. Si las partículas no están lo suficientemente dispersa, permitir la suspensión para ajustar en hielo durante 1 a 2 minutos para asegurar que las nanopartículas están por debajo de la temperatura de transición vítrea del polímero antes de sonicación de nuevo durante 30 a 45 segundos. La intención de este paso es sonicación para dispersar adecuadamente las nanopartículas, como la CPTEG 50:50: nanopartículas CPH tienden a agregarse cuando se expone a un ambiente acuoso. Sin embargo, algunos pequeños agregados de nanopartículas todavía pueden permanecer en la suspensión. </li><li> Suspensión de nanopartículas (dispersa adecuadamente) debe mantenerse en hielo y se utiliza de inmediato para evitar la erosión superficial prematura o agregación. </li><li> Retire las placas de cultivo que contienen la AMɸ de la incubadora y el lugar en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Placa de inclinación en un ángulo de 45 grados y la pipeta de la cantidad de medicinaum que se añade a la suspensión de nanopartículas (no debe exceder de 0,3 ml). No molestar a las células adherentes al quitar del medio. </li><li> Vórtice de la suspensión de nanopartículas polianhidrido brevemente antes de añadir a los pocillos correspondientes. Pipetear la cantidad de suspensión de nanopartículas (no más de 0,3 ml) en el pozo (s) específico, sin embargo, no pipetear arriba y hacia abajo para mezclar. Esta acción podría separar el adherente AMɸ del pozo. Las partículas se depositan en el fondo del pozo y en contacto con las células. Para los estudios indicados en este informe, la concentración final de nanopartículas de co-cultivadas con la AMɸ fue de 125 mg / ml. Proceda con los pozos posteriores y deseadas grupos de tratamiento. Incluir a los grupos de control positivas y negativas, como único medio y 200 ng / ml de lipopolisacárido (LPS) a los pozos designados. </li><li> Volver las placas de cultivo a los 37 ° C incubadora humidificada con un 5% de CO2 la atmósfera durante 48 h. Los estudios cinéticos en nuestro laboratory han demostrado ser de 48 horas para el período de cultivo óptimo para evaluar tanto la superficie celular marcador expresión y secreción de citoquinas, ya que permite un tiempo adecuado para la transcripción y la síntesis de proteínas que se produzca. A pesar de mayores niveles de citocinas se acumulan durante un período de cultivo prolongado (es decir, 72 horas), la evaluación de la superficie celular expresión de los marcadores en este punto en el tiempo puede ser confundida por la contribución de los niveles elevados de citoquinas. Los cambios en la expresión de superficie marcador de observarse no pueden ser directamente atribuibles a la estimulación con las mismas nanopartículas. </li></ol> 4. La evaluación de la activación AMɸ mediante citometría de flujo <ol><li> Preparar activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) tampón (0,1% de azida sódica y 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA)) en 0,1 M tampón fosfato salino (pH 7,4) antes de la cosecha de los macrófagos chapados que han sido co-cultivadas con nanopartículas or estimulantes. </li><li> Preparar las soluciones de trabajo de la memoria intermedia de bloqueo y los anticuerpos monoclonales. Para preparar el tampón bloque, diluir IgG de rata (Sigma) y anti-CD16/32 (eBioscience) a 1 mg / ml y 10 mg / ml, respectivamente, en tampón FACS. Diluir marcador superficie del panel de anticuerpos en tampón FACS ya sea a la concentración fabricante recomienda o la concentración de usuario optimizada. Por los resultados presentados en este trabajo, el panel de marcadores de superficie se compone de anticuerpos contra MHC II, CD86, CD40 y CIRE (CD209). Anti-ratón anticuerpos contra los marcadores F4/80 macrófagos y CD11b también están incluidos en el panel para identificar positivamente el fenotipo de macrófagos durante el análisis de datos. Se debe tener cuidado al seleccionar anticuerpos contra moléculas MHC II, como puras cepas de ratón a menudo difieren en sus haplotipos MHC II. Los anticuerpos seleccionados deben reaccionar con los aloantígenos específicos MHC expresadas por su cepa de ratón de interés. </li><li> Después de 48 h de incubación con nanopartículas y / oestimulantes, coloque los platos de cultivo de células en hielo durante 20 minutos. Para eliminar los macrófagos adherentes de las placas, raspe suavemente pozos con un rascador de células de 24 cm. </li><li> Utilizando una pipeta serológica de 5 ml, suavemente aspirar las células y el medio arriba y hacia abajo cinco veces para generar una suspensión de células individuales. Pipetear el contenido de los pocillos individuales en diferentes tubos de 5 ml de poliestireno para que no se mezclan las células de diferentes tratamientos experimentales. </li><li> Añadir 2 ml de tampón FACS a cada tubo. </li><li> Centrifugar los tubos de células a 250 x g a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet de células suavemente en el líquido residual con un rastrillo de los tubos en la parte superior de un bastidor de tubo de ensayo. </li><li> Con el fin de prevenir no específicos de unión de los anticuerpos monoclonales, añadir 10 l de tampón de bloqueo (preparado en el 4,2) a cada tubo de células. Tubos Vortex e incubar en hielo durante 30 minutos. </li><li> Añadir un volumen apropiado de anticuerpos monoclonales diluidos a cada tubo y incubComimos en la oscuridad en hielo durante 15 minutos. Los tubos que contienen las muestras a analizar deben recibir la combinación de anticuerpos del panel polycromatic (optimización anterior de la combinación de anticuerpos debe ser realizado por laboratorios individuales). Otros grupos de control se deben incluir para configurar correctamente los parámetros de adquisición en el citómetro de flujo, incluyendo un tubo de células que no fueron etiquetados, y los tubos de compensación que corresponden a las células marcadas con cada uno de un solo color por separado. Para configurar correctamente las puertas para el análisis de citometría de flujo, la fluorescencia Minus One (FMO) los controles deben ser incluidos durante la adquisición. Controles FMO son células marcadas con todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo que se utilizan en el panel excepto uno que se sustituye por su isotipo de control respectivo. Poblaciones positivos y negativos (es decir, partes alícuotas separadas de las células tratadas con un control positivo y estimulante medio solo) también deben ser incluidos en FMO y tubos de compensación de control. </li><li&gt; Añadir 2 ml de tampón FACS a cada tubo, vórtice y se centrifuga a 250 x g a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet de células en el líquido residual con un rastrillo de los tubos en la parte superior de un bastidor de tubo de ensayo. </li><li> Si el panel de anticuerpos consta de un anticuerpo no conjugado directamente a un fluorocromo sino que es conjugado con biotina, un fluorocromo estreptavidina conjugada es necesaria para visualizar el marcador de superficie. En este paso, añadir un volumen apropiado de la solución diluida fluorocromo conjugado estreptavidina y se incuba en la oscuridad durante 15 minutos en hielo. Como en 4,2, la estreptavidina se diluye a una concentración recomendada por el fabricante o para una optimizada por el usuario. Este paso sólo es necesario para los paneles que contienen biotina anticuerpos primarios. </li><li> Realizar una etapa de lavado como se describe en 4,10. </li><li> Diluir un volumen apropiado de BD estabilizar 01:03 fijador en agua desionizada. Añadir 100 ml de fijador diluido a cada tubo mientras que suavemente vortexing para evitar la aglutinación de las células. Células marcadas y fijadas pueden ser establemente almacenada en la oscuridad a 4 ° C durante aproximadamente una semana antes de la adquisición en un citómetro de flujo. </li></ol> 5. Los datos representativos Las nanopartículas fabricadas en el paso 3,1 tenía un diámetro medio de 163 ± 24 nm y una morfología consistente con la obtenida en estudios previos 5,16. Nanopartículas en solución antes y después de la sonicación se muestra en la Figura 1 para demostrar la necesidad de sonicación para asegurar la dispersión adecuada de las partículas. El análisis de citometría de flujo de AMɸs cosechadas obtenidos mediante lavado pulmonar se muestra en la Figura 2. Etiquetado células con una combinación de CD11b anti-ratón y anti-ratón F4/80 anticuerpos, así como los correspondientes controles FMO permite establecer el etiquetado de fondo, identificando AMɸs y gating para su posterior análisis. El tratamiento de los macrófagos alveolares con polianhídridonanopartículas mejora de activación tal como se muestra por la mayor intensidad de fluorescencia media del MHC II, CD40, CD86, y CIRE (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Figura 1 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas antes de (A) y después (B) 30 s de sonicación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> Figura 2. Análisis de citometría de flujo de cosechados los macrófagos alveolares marcados con (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b y el control de PE-Cy7 FMO, (B) Alexa Fluor 700 FMO de control y el anti-F4/80 PE-Cy7 y (C ) Alexa Fluor 700 y anti-CD11b anti-F4/80 PE-Cy7. El número en la esquina superior derecha representa el porcentaje de células doble positivas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> Figura 3. Histogramas demostrando un aumento de la intensidad de la fluorescenciadad para la expresión de superficie de MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) y CIRE (D) después de co-cultivo de macrófagos alveolares con CPTEG 50:50: polianhidrido CPH nanopartículas durante 48 horas. Los histogramas representan los resultados de AMɸ etiquetados como controles (FMO <img alt="Gráfico de la Línea 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), No se trata AMɸ marcadas con anticuerpos contra todos los marcadores de la superficie celular ( <img alt="Gráfico de la Línea 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) Y AMɸ cultivadas con nanopartículas y marcadas con anticuerpos contra todos los marcadores de la superficie celular ( <img alt="Gráfico de la Línea 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

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No hay conflictos de interés declarado.

Polianhidrido plataformas de la vacuna de nanopartículas han demostrado su eficacia cuando se administra por vía intranasal en los regímenes de dosis única 5. Medición de la activación de las poblaciones de células fagocíticas residentes en los pulmones inducidas por esta plataforma de administración de vacunas permite la evaluación de su capacidad potencial para promover en última instancia la respuesta inmune adaptativa. En concreto, la cosecha macrófagos alveolares ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> AMPc medios de comunicación </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM de 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina 10.000 mg / ml de la Solución </td><td> Cellgro </td><td> 30 a 002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón FACS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato sódico </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> El cloruro de potasio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potasio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albúmina de suero bovino) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> Azida sódica </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> IgG de rata </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Sra. CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Lucha contra el haplotipo MHC II Sra. IA / IE, el clon M5/114.15.2, conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) </td><td> EBIOSa ciencia </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD86 de ratón, clon GL-1, conjugado con aloficocianina (APC)-Cy7 </td><td> BioLegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD40 de ratón, clon 1C10, conjugado con APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón, clon CD209 5H10, conjugado con biotina </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón CD11b, el clon M1/70, conjugado con Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón F4/80, clon BM8, conjugado con ficoeritrina (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-rojo de Texas conjugado estreptavidina </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Otros suministros y reactivos </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Se utiliza como 70% (v / v) </td></tr><tr><td> Comprimido de CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml de jeringa </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Soberano de 3 ½ &quot;Padre Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Seguridad de la Biotecnología del Gabinete </td><td> Nuaire </td><td> Serie 22 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras de disección </td><td> Pescador </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 1X sin calcio y magnesio </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga de 15 ml con tapón de rosca </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Seis de cultivo de tejidos tratados placas </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Bastidores de tubo de plástico </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Rascador de células de 24 cm </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 de poliestireno ml de fondo redondo del tubo </td><td> Halcón </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetear auxilios XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, y 2 mL Pipetas </td><td> Pescador </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 y 10 Micropipetas de l </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 y 10 puntas de pipeta l </td><td> Pescador </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> La estabilización de BDFijador </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II diluyente </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II reactivo lítico </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter viales de poliestireno Contador </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de ensayo, </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Equipo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga Refrigerada </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Humidificado incubadora de CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> Modelo Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Contador de partículas Coulter Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Equipos de procesamiento de líquidos Sonicator con micropunta </td><td> Misonix </td><td> Modelo N º S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles

Nanopartículas biodegradables se han convertido en una plataforma versátil para el diseño e implementación de nuevas vacunas intranasales contra enfermedades infecciosas respiratorias. Específicamente, polianhídrido nanopartículas compuesto del ácido alifático sebácico (SA), la aromático 1,6-bis (p-carboxifenoxi) hexano (LPA), o la anfifílico 1,8-bis (p-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctano (CPTEG) muestran granel único y cinética de la superficie de erosión 1,2 y puede ser explotado para liberar lentamente biomoléculas funcionales (por ejemplo, antígenos proteicos, inmunoglobulinas, etc) in vivo 3,4,5. Estas nanopartículas tienen también actividad adyuvante intrínseca, por lo que una excelente elección para una plataforma de administración de la vacuna 6,7,8. Con el fin de dilucidar los mecanismos que regulan la activación de la inmunidad innata la mucosa nasal después de la vacunación, se debe evaluar las respuestas moleculares y celulares del antígeno pcélulas resentidos (APC), responsables de iniciar la respuesta inmune. Las células dendríticas son las CPA principales que se encuentran en la realización de las vías respiratorias, mientras que los macrófagos alveolares (AMɸ) predominan en el parénquima pulmonar 9,10,11. AMɸ son altamente eficientes en la limpieza de los pulmones de los microbios patógenos y los residuos celulares 12,13. Además, este tipo de células juega un papel importante en el transporte de antígenos microbianos a los ganglios linfáticos de drenaje, que es un primer paso importante en la iniciación de una respuesta inmune adaptativa 9. AMɸ también expresan niveles elevados de reconocimiento de patrones innatos y los receptores scavenger, los mediadores pro-inflamatorios secretan, y las células T vírgenes 12,14. Una población relativamente pura de AMɸ (por ejemplo, superior al 80%) se puede obtener fácilmente a través de lavado pulmonar para su estudio en el laboratorio. Residente AMɸ recogerá a partir de animales inmunes competentes faciliten un fenotipo representante de los macrófagos que encounter la vacuna basada en partículas in vivo. Aquí se describen los protocolos utilizados para la cosecha y la cultura AMɸ de ratones y examinar el fenotipo de la activación de los macrófagos después del tratamiento con nanopartículas polianhídrido in vitro.

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

harvesting-murine-alveolar-macrophages-evaluating-cellular-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.7K vistas.  Iowa State University. Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Investigación

Bioingeniería

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

De alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea (ureolysis) in naturally occurring environments through secretion of an enzyme urease. This process of ureolysis, through a chain of chemical reactions, leads to the formation of calcium carbonate precipitates. This is known as Microbiologically Induced Calcite Precipitation (MICP). The proper culture protocols for MICP are detailed here. Finally, visualization experiments under different modes of microscopy were performed to understand various aspects of the precipitation process. Techniques like optical microscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-Ray Photo-electron Spectroscopy (XPS)&#160;were employed to chemically characterize the end-product. Further, the ability of these precipitates to clog pores inside a natural porous medium was demonstrated through a qualitative experiment where sponge bars were used to mimic a pore-network with a range of length scales. A sponge bar dipped in the culture medium containing the bacterial cells hardens due to the clogging of its pores resulting from the continuous process of chemical precipitation. This hardened sponge bar exhibits superior strength when compared to a control sponge bar which becomes compressed and squeezed under the action of an applied external load, while the hardened bar is able to support the same weight with little deformation.

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Inducida microbiológicamente Calcita precipitación mediada por<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Producción de nanopartículas metálicas por ablación por láser pulsado en líquidos: una herramienta para estudiar las propiedades antibacterianas de las nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Depuración catalítica de planta oxígeno reactivo especie In Vivo de nanopartículas de óxido de cerio aniónicos

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...