Los autores agradecen a la Universidad Regional del VA-MD de la medicina veterinaria para proporcionar núcleo y soporte técnico para este proyecto. Este trabajo es apoyado por un premio de Desarrollo Profesional de los NIH (K01DK092355).

Se realizaron todos los estudios bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso (IACUC) de Virginia Tech y de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Intratraqueal (it) La inoculación de LPS mediante Administración de orofaringe <ol><li> Asegúrese de que cada animal se identifica unívocamente usando un punzón oído, marca auricular, u otro método aprobado institucionalmente. </li><li> Anotar el peso corporal inicial y la temperatura corporal de cada animal. </li><li> Preparar la solución de trabajo de LPS. Cada ratón recibe una dosis de 50 l de 1 mg / kg de LPS en 1x tampón fosfato salino (PBS). Animales tratados Mock recibirán una dosis de 50 l de PBS 1x. </li><li> Preparar una cámara apropiada para la administración de isoflurano usando el método de la gota siguiente. Directrices institucionales varían con respecto al uso del isoflurano y otros agentes anestésicos y antes de la iniciatuso de todo tipo de estudios, las personas deben comunicarse con el Departamento de Atención / Bienestar Animal de su institución para asegurar que las todas las directrices que se cumplan adecuadamente. Si método de la gota isoflurano no es una opción, otros agentes anestésicos son alternativas aceptables. <ol><li> En una cabina de seguridad apropiado, aplicar aproximadamente 3 ml de isoflurano a una toalla de papel absorbente plegada y el lugar en el fondo de un vaso de precipitados de 500 ml. </li><li> Coloque un pequeño trozo de papel de aluminio en la parte superior de la toalla de papel y cubrir el recipiente con una tapa transparente. </li></ol></li><li> Preparar las herramientas y reactivos que se utilizarán durante la inoculación ella. Coloque la banda de goma y que asegure los animales se dirigen en el stand de la intubación. Este procedimiento requiere un par de pinzas rectas, un par de pinzas en ángulo o curvados, y una pipeta P200 con puntas. </li><li> Carga 50 l de LPS en la punta de la pipeta y colocar en un lugar fácilmente accesible junto al stand de la intubación. </li><li> Anestesiar el ratóncolocando el animal en la cámara de isoflurano y que cubre la cámara con la tapa transparente. Observar los patrones de respiración del animal, que será rápida y superficial cuando primero colocado en la cámara. El animal será suficientemente anestesiado cuando las tasas de respiración aproximan 1 respiración / 2 seg, que normalmente se encuentra a 30 segundos de colocar en la cámara. El ratón debe ser anestesiado como se indica en el protocolo aprobado animales utilizando el método de caída de isoflurano. </li><li> Retire el ratón anestesiado de la cámara y suspender el animal en la intubación de pie por sus incisivos delanteros. Asegúrese de que el animal está bien sujetos y de la boca y la lengua son accesibles. </li><li> Asegurar la lengua suavemente con las pinzas rectas. Sujete la lengua con la pinza en ángulo y tire de él hacia fuera de la boca hasta que se note una ligera resistencia. Esta acción es suficiente para bloquear la epiglotis y obtener acceso a la tráquea. </li><li> Sin soltar la lengua en elposición extendida, administrar la dosis de 50 l de LPS en la parte posterior de la garganta y cubrir inmediatamente las fosas nasales del animal con un dedo enguantado. El LPS será visible en la parte posterior de la garganta hasta que inhala el ratón. </li><li> Continuar para cubrir las ventanas de la nariz y mantenga la lengua extendida durante 5-10 respiraciones adicionales. </li><li> Retire el ratón desde el stand de la intubación y coloque el animal de nuevo en una nueva jaula hasta que se recupere de la anestesia. </li><li> Monitorear marcadores indirectos asociados con la progresión de la enfermedad. El peso corporal y la temperatura corporal deben ser controlados cada 4-8 horas durante la duración del estudio. Del mismo modo, evaluar las características de comportamiento y síntomas clínicos asociados con una mayor morbilidad. </li><li> Para evaluar la progresión de la enfermedad, los ratones de cosecha en los puntos de tiempo específicos después de la exposición LPS. Puntos de tiempo típicos para la cosecha después de la exposición LPS incluyen 0, 6, 12, 18, 24 y 48 h. Para evaluar la recuperación y la supervivencia, evaluar los ratones durante 7 days después de la inoculación. </li></ol> 2. El suero y lavado broncoalveolar de fluido (BALF) Colección <ol><li> Sacrificar el ratón usando un método aprobado institucionalmente. </li><li> Colocar el animal sobre su espalda y fijarlo a un tablero de la necropsia, lo ideal es 0,5 en (1.27 cm) de altura. </li><li> Mojar todo el ratón con etanol al 70%. </li><li> Con una jeringa de 1 ml con una aguja de 27 G, llevar a cabo una punción cardíaca antes de hacer ninguna incisión. Debería ser posible retirar 500-800 l de sangre entera de un solo ratón. </li><li> Retire la aguja de la jeringa y transfiera toda la sangre a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml premarcan. Para la recolección de suero, permite toda la sangre para coagular durante al menos 30 min a temperatura ambiente. En adición a la colección de suero, este procedimiento también se puede modificar mediante la incorporación de un anti-coagulante en el tubo y la jeringa, antes de recoger la sangre entera, para estudiar células inmunes circulantes. </li><li> Haga una incisión horizontal acruzar la longitud de la cavidad peritoneal y una incisión vertical de la cavidad peritoneal a la mandíbula inferior del ratón. </li><li> Con unas pinzas, sujete ambos lados de la incisión y tire suavemente de la piel lejos de las cavidades peritoneales y torácicas subyacentes. </li><li> Hacer una incisión grande a lo largo de la longitud de la cavidad peritoneal de los genitales con el esternón, teniendo cuidado de evitar el corte de la membrana. Desplazar suavemente los intestinos en la cavidad peritoneal para permitir el acceso a uno de los riñones. </li><li> Cortar la vena renal que conduce a la riñón para servir como un punto de drenaje para la perfusión. </li><li> Nick el diafragma con unas tijeras, teniendo cuidado de evitar los pulmones y el corazón, para exponer el lado izquierdo del corazón. </li><li> Perfundir manualmente el corazón con una jeringa de 10 ml con una aguja de 27 G y 1 x solución de PBS. Evitar la aplicación de fuerza excesiva durante la perfusión para asegurar que la solución salina no está forzada en los pulmones. La sangre restante debe escurrirse de la incisión de la vena porta.</li><li> Corte con cuidado la caja torácica a lo largo del esternón utilizando tijeras de punta roma / roma, teniendo cuidado de no cortar el corazón y los pulmones. Cortar accidentalmente los pulmones durante este procedimiento reducirá significativamente la cantidad de BALF recogido y dará lugar a una incapacidad para inflar correctamente los pulmones con fijador. </li><li> Aislar suavemente el corazón y los pulmones de distancia de la caja torácica con fórceps. Corte cuidadosamente cada sección de la caja torácica con unas tijeras romas / roma tan cerca de la columna vertebral como sea posible y completamente eliminar ambas secciones. </li><li> Separe las glándulas salivales utilizando fórceps o eliminarlos con unas tijeras, para exponer la tráquea. </li><li> Corte cuidadosamente los músculos que cubren la tráquea con una tijera. Es esencial que la tráquea no ser cortado durante este proceso. </li><li> Con unas tijeras, separar de la clavícula que recubre la tráquea. </li><li> Agarre suavemente el timo utilizando pinzas y levantar el tejido desde el corazón. Retire el timo utilizando tijeras, velando al mismo tiempoevitar cortar el corazón o los pulmones. </li><li> Haga una pequeña incisión horizontal en la tráquea 1-2 anillos debajo de la laringe con tijeras en ángulo (ángulo de 45-90 º, agudo / agudo). La incisión debe ser lo suficientemente grande para asegurar firmemente la cánula. </li><li> Inserte la cánula de manera que el extremo cónico se extiende 2-3 anillos traqueales por debajo de la incisión y asegurar la cánula en su lugar usando una sutura de seda. Asegúrese de que la sutura pasa entre la tráquea y el esófago y se tensa en la cánula. </li><li> Llene una jeringa de 1 ml con 1 ml de solución salina tamponada de Hanks (HBSS) e insertar suavemente su luer dentro de la cánula. </li><li> Con un movimiento lento, pero constante, inyectar ~ 900 l en la tráquea, inflar los pulmones, y el retiro inmediato del HBSS. Coloque el BALF recuperado en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Repita este lavado 2 veces adicionales para recoger aproximadamente 3 ml de BALF para el análisis futuro. Guarde el BALF en hielo oa 4 º C hasta que esté listo para su uso. </li></ol><ol><li> Inserte una jeringa de 10 ml en el soporte de la inflación pulmonar. Montar el tubo a la de luer, el luer a la llave de paso, y la llave de paso a la jeringa. Asegúrese de que la llave de paso está en la posición cerrada. La jeringa de 10 ml servirá como un depósito de flujo por gravedad. El depósito debe estar unido a la inflación de pie por encima de 4,75 en el animal y la parte superior del depósito debe extenderse en 10,5 por encima del animal. </li><li> Llene la jeringa con solución de formalina tamponada neutra. Asegúrese de que la jeringa se llena completamente con el fijador. </li><li> Coloque una toalla absorbente debajo del extremo abierto del tubo y abrir la llave de paso para permitir que el fijador para llenar el tubo. Una vez que el fijador comienza a fluir desde el tubo, cerrar inmediatamente la llave de paso y volver a llenar la jeringa hasta el tope con fijador. Es importante que la jeringa se llena por completo para proporcionar la cantidad apropiada de presión para la inflación pulmonar. </li><li&gt; Pasar suavemente una segunda pieza de hilo de sutura bajo la tráquea, aproximadamente 1-2 anillos traqueales por debajo del extremo de la cánula. </li><li> Haga un solo nudo flojo en la sutura; Sin embargo, no tire el apretado nudo. </li><li> Insertar el tubo de la inflación del ratón de pie dentro de la cánula. </li><li> Abra la llave de paso y permitir que los pulmones se llenen por la inflación gravedad. </li><li> Una vez que los pulmones llegan a su nivel máximo de inflación, tirar de la sutura apretada y ata un segundo nudo. </li><li> Cierre la llave de paso y quite el tubo de la cánula. </li><li> Retire con cuidado la cánula de la tráquea agarrando la sutura con un par de pinzas y la celebración de la cánula con los dedos. Jale firmemente la sutura hacia abajo, hacia la cavidad torácica y la cánula de nuevo hacia la nariz del ratón. </li><li> Agarre suavemente la tráquea o los puntos de sutura con las pinzas y levante la tráquea fuera de la cavidad del cuello. </li><li> Cortar el caudal tráquea a la sutura atada con unas tijeras romas. </li><li> Una vez que el Tracheuna es libre de los tejidos subyacentes, empiezan a tirar de la tráquea de distancia del ratón. Levante suavemente los pulmones fuera de la cavidad torácica. </li><li> Corte cuidadosamente el tejido conectivo que sostiene los pulmones en la cavidad torácica. Continuar tirando de la tráquea de distancia del cuerpo del ratón y aplicar fuerza ascendente constante, mientras que el corte de las conexiones subyacentes. Tenga cuidado de no cortar los pulmones. Tenga en cuenta que el corazón se debe dejar conectado a los pulmones utilizando este método. </li><li> Una vez que se han eliminado de los pulmones, el lugar en 10 ml de formalina tamponada. </li><li> Eliminar una sección de cola de ratón para el genotipado. </li><li> Deshágase de la canal del ratón siguiendo las directrices institucionales apropiados. </li></ol> 4. Evaluación de citocinas <ol><li> Centrifugar la sangre total, recogido en la etapa 2.5, a 12.000 xg durante 5 min para aislar el suero. Transferir el suero a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml premarcan y almacenar a -80 ° C. </li><li> Evaluar la Seruniveles m de citoquinas por ELISA u otro ensayo similar. Diluir el suero 1:05-1:20 en un tampón de dilución apropiado, dependiendo del ensayo, siguiendo las instrucciones del fabricante. Estas diluciones se deben determinar empíricamente antes de ejecutar la mayor parte de las muestras. </li><li> Debido al bajo volumen de suero recogido, reducir el volumen de la muestra se carga en la placa de ELISA por medio. Por ejemplo, la mayoría de las pruebas ELISA comerciales utilizan volúmenes de 100 l de estándares y muestras. Para conservar las muestras, carga 50 l de normas y suero diluido por pocillo. </li><li> Centrifugar el BALF en una centrífuga de mesa refrigerada a 200 xg durante 5 min. Transferir el sobrenadante libre de células en dos premarcan 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C. </li><li> Evaluar citoquinas BALF por ELISA u otro ensayo similar sin diluir. </li><li> Tienda de suero utilizados y BALF a -80 ° C. </li></ol> 5. La tinción diferencial y BAL celularidad Evaluación <ol><li> Después de la centrifugación BALF y la eliminación completa de HBSS, lisar las células rojas de la sangre sedimentadas utilizando solución salina hipotónica. Resuspender las células en 900 l de agua destilada. Inmediatamente después, añadir 100 l de 10x PBS. </li><li> Individualmente lisar cada muestra. Si las muestras contienen cantidades excesivas de las células rojas de la sangre, las células pueden ser sedimentaron en la centrífuga de mesa superior a 400 xg durante 5 min y la sangre protocolo de lisis de glóbulos rojos se puede repetir. </li><li> Determine la celularidad total de BALF en la suspensión 1 ml utilizando un hemocitómetro bajo 10X o 20X de aumento con la tinción de azul de tripano. Evaluar y presentarán los datos como células / ml. </li><li> Preparar los materiales para la cytospin y tinción diferencial. Etiquetar los portaobjetos de microscopio estándar utilizando un lápiz o un bolígrafo resistente a los disolventes. Asegure las diapositivas en un soporte cytospin y embudo. Fije el conjunto de diapositivas en el rotor cytospin. </li><li> Cytospin 150 l de BALF en 100 xg durante 5 min. Si la densidad celular es demasiado grande para efectivamenteevaluar la morfología celular, reducir el volumen hilado hacia abajo sobre las diapositivas. Permitir a las diapositivas para aire durante la noche seca. </li><li> Mancha Diferencial las diapositivas siguiendo los protocolos de confección. Permitir a las diapositivas para aire durante la noche seca. Cubreobjetos las diapositivas usando Permount y evaluar los portaobjetos usando un microscopio equipado con un objetivo de 20X y 40X. </li><li> Recoger las células restantes para su posterior análisis, tales como FACS, microscopía electrónica, microscopía confocal, la extracción de RNA para la evaluación de la expresión génica, y / o extracción de proteína de transferencia de western. </li></ol> 6. Evaluación Histopatología <ol><li> Preparar los pulmones para la evaluación de histopatología. Después de 24 a 48 horas de fijación en formol, ventralmente orientar enteros los pulmones inflados e incluidos en parafina. Cortar los bloques resultantes para exponer la principal vía aérea conductora. </li><li> Para mejorar la precisión de puntuación, la posición de los pulmones en la misma posición y recorte cada bloque para producir la visualización longitudinal máximo de tque las vías respiratorias intrapulmonares axial principal. Desde este punto, corte 5 micras secciones seriadas y se tiñen con hematoxilina y eosina (H &amp; E). Las secciones adicionales se pueden cortar y se prepararon para la hibridación in situ utilizando protocolos estándar. </li><li> Evaluar la histopatología usando un sistema de puntuación semicuantitativo basándose en los siguientes parámetros inflamatorios, que se puntúan entre 0 (ausentes) y 3 (grave): mononucleares y polimorfonucleares infiltración de células; vías respiratorias hiperplasia de las células epiteliales y lesiones; extravasación; perivascular y manguitos peribroncheolar; y el porcentaje del pulmón implicado con la inflamación. Histopatología de pulmón debe ser evaluada por un patólogo experimentado. </li><li> Promedio de todas las puntuaciones de los parámetros para generar una puntuación total histopatología o utilizar las puntuaciones individuales para cuantificar aspectos específicos de la progresión de la enfermedad. Llevar a cabo todos los de puntuación de una manera doble ciego, con revisores cegados a ambos genotipo y tratamiento. Este sistema de puntuación ha sido previously describió 6,7,10. </li></ol>

<ol>
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Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Los pasos más importantes para evaluar con éxito la respuesta inmune del huésped en los pulmones del ratón es el siguiente: 1) elegir la cepa de ratón apropiado y sexo para el modelo que se está evaluando; 2) optimizar la entrega de PAMP a los pulmones; 3) recopilar y procesar correctamente la BALF; y 4) fijan correctamente y preparar los pulmones para las evaluaciones histopatológicas. La elección de la cepa de ratón es un factor importante en la evaluación de la respuesta inmune ...

Las infecciones pulmonares asociadas a especies de bacterias patógenas son una causa frecuente de morbilidad y mortalidad global. La determinación de los mecanismos que conducen a la respuesta inmune del huésped a estos patógenos, promoverá el desarrollo de estrategias de prevención novedosas y agentes terapéuticos que atenuar el impacto de estas infecciones. El objetivo general del protocolo descrito aquí es proporcionar al usuario un método flexible para evaluar la respuesta inmune innata huésped a la infección del patógeno utilizando un patrón molecular asociado patógeno (PAMP) como un sustituto de bacterias vivas. La mayoría de los estudios previos de evaluación de la respuesta inmune innata de acogida a las bacterias se han centrado en modelos peritoneales debido a la relativa facilidad de ejecución. Aunque estos modelos son muy útiles y han dado lugar a avances significativos en el campo de las interacciones huésped-patógeno y la inflamación sistémica, los datos generados a partir de estos modelos no siempre son apropiadas para estudios involving el sistema respiratorio. Aquí, un modelo pulmonar de la inflamación pulmonar aguda se propone como una expansión práctico y clínicamente relevante de los modelos de inyección clásicos intraperitoneal (ip). La técnica propuesta permite la evaluación local de la respuesta inmune innata en un sistema de modelo específico de órganos. Los métodos descritos aquí se han diseñado para proporcionar una técnica simple y robusto para permitir a los usuarios evaluar la respuesta inmune del huésped a LPS, que es un PAMP común. Los métodos se basan en intratraqueal (IT) de la instilación de LPS, que induce una respuesta inmune innata robusto en los pulmones de los ratones y imita muchas de las características fisiopatológicas observadas en los pacientes humanos que sufren de infecciones respiratorias y la lesión pulmonar aguda 1. Una ventaja principal de esta técnica es que permite al usuario evaluar la respuesta inmune del huésped y sin los factores de confusión y problemas de seguridad asociados con la realización de estudios in vivoel uso de bacterias vivas. Del mismo modo, la vía de administración que orofaríngea de la exposición descrita en este protocolo tiene ventajas significativas sobre otras técnicas comúnmente utilizadas, incluyendo intranasal (in) administración y gestión se quirúrgico. Por ejemplo, la administración que orofaríngea permite la dosificación relativamente precisa y la deposición de pulmón en comparación con en la administración, que típicamente sufre de aumento de la variabilidad de la deposición en los pulmones debido a la pérdida de agentes en la cavidad nasal y los senos paranasales 2-4. La vía de administración, elude estas cavidades y permite el acceso directo a la tráquea y las vías respiratorias. Del mismo modo, el enfoque que se quirúrgica es un método de administración mucho más morboso y requiere una amplia formación de dominar. Los protocolos descritos aquí también incluyen una descripción de las técnicas comunes y marcadores indirectos utilizados para evaluar la progresión de la inflamación y terminar con un protocolo que describe las técnicas adecuadas para la preparación de la luones para las evaluaciones de histopatología. Estos protocolos se centran en reducir al mínimo el número de ratones requeridos para cada estudio mediante la maximización de los datos generados a partir de cada animal individual. Los protocolos descritos son altamente flexibles y pueden ser fácilmente modificados para evaluar una diversa gama PAMPs y los daños asociados a patrones moleculares (apaga). Por otra parte, con algunas modificaciones, estos protocolos también pueden ser aplicados a los estudios que evalúan la progresión de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas o interacciones huésped-patógeno con bacterias vivas, virus u hongos 5-10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:269px;">C57Bl/6J</td>
			<td style="width:181px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:147px;">Stock 000664</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:269px;">Compact Scale</td>
			<td style="width:181px;">Ohaus Scale Corporation</td>
			<td style="width:147px;">71142845</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Small Animal Rectal Thermometer</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">TH 5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rectal Probe for Rodents</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RET 3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ear Punch</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">EP-S 901</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4</td>
			<td style="width:181px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:147px;">LPS-EB</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Baxter</td>
			<td style="width:147px;">40032609</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand</td>
			<td style="width:181px;">ICAP Manufacturing</td>
			<td style="width:147px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/sharp)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-806-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps (straight)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">forceps (45&#186;, curved)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/blunt)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pipette (200 &#181;l Capacity)</td>
			<td style="width:181px;">Gilson</td>
			<td style="width:147px;">F123601</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">459844</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">&#160;1 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301604</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">27 G x 0.5 in. needle</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-100-676</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">732836</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">14025-076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">4-0 Silk Braided Surgical Suture</td>
			<td style="width:181px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">A183</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer to Tube Connector Kits</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721406</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer Stopcock Kit</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721664</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tygon formula E-3603 laboratory tubing</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">HT501128-4L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-1&#946; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">559603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">550950</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse TNF-&#945; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">560478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:181px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:147px;">3520</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">22-021-801&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SV3008401</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funel Clips</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funels</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-354</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter Cards</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-030-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-544-1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-540A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cytospin Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A78300003&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Diff Quick Staining Kit</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">47733150</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SP15-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utilization of oropharyngeal intratracheal pamp administration and bronchoalveolar lavage to evaluate the host immune response in mice

La respuesta inmune del huésped a patógenos es un proceso biológico complejo. La mayoría de los estudios in vivo empleado clásicamente para caracterizar las interacciones huésped-patógeno se aprovechan de inyecciones intraperitoneales de seleccionar las bacterias o los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) en ratones. Si bien estas técnicas han rendido enormes de datos relacionados con patobiología enfermedad infecciosa, los modelos de inyección intraperitoneal no siempre son apropiadas para estudios de interacción huésped-patógeno en el pulmón. Utilizando un modelo de inflamación pulmonar aguda en ratones, es posible llevar a cabo un análisis de alta resolución de la respuesta inmune del huésped innata la utilización de lipopolisacárido (LPS). A continuación, describimos los métodos para administrar el uso de la administración intratraqueal LPS orofaríngea no quirúrgico, el seguimiento de parámetros clínicos asociados con la patogénesis de la enfermedad, y utilizar el líquido de lavado broncoalveolar para evaluar la respuesta inmune del huésped. Las técnicas que se describenson ampliamente aplicables para el estudio de la respuesta inmune innata de acogida a un rango diverso de PAMP y patógenos. Del mismo modo, con pequeñas modificaciones, estas técnicas pueden también ser aplicadas en los estudios que evalúan la inflamación de las vías respiratorias alérgica y en aplicaciones farmacológicas.

Las paredes celulares de las bacterias gram-negativas se componen de LPS, que es altamente abundante en el medio ambiente. La inhalación de LPS en las poblaciones humanas sensibles exacerba la reactividad de las vías respiratorias y es capaz de desencadenar una response11 inmune robusta. LPS es también un PAMP común utilizado en modelos de ratón para provocar una respuesta inmune innata robusta. En el protocolo descrito aquí, los ratones recibieron una dosis de LPS es aislado a partir de E. coli (serotipo...

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The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K vistas.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad. 

Video: The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Investigación

Inmunología e Infección

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

La eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar tras la administración subcutánea e intranasal BCG en ratones

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Inoculador<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Los mosquitos con los granos para inducir y medir la respuesta inmune melanización

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.