Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation bajo la subvención # IOS-1025627 y por los Institutos Nacionales de Salud, bajo la concesión # 1R21NS078582-01 a MORDAZA

Este protocolo utiliza dos configuraciones (Figura 1) para adquirir cuatro lecturas de datos distintas de las moscas recogidas sometidos a una infección bacteriana. Estos productos incluyen: 1) sueño / vigilia comportamiento, 2) los resultados de supervivencia, y 3) la carga bacteriana en la mosca, y 4) medición en tiempo real de la actividad de reportero NFkB en vivo. En combinación con las herramientas genéticas que están disponibles en Drosophila, estas mediciones proporcionan información mecanicista en el enlace molecular entre la función inmune y el comportamiento. 1. Medida de la actividad locomotora y del sueño en moscas <ol><li> La configuración utilizada para medir la actividad locomotora y dormir en moscas, que incluye la actividad de Drosophila sistema de supervisión (DAM2, Trikinetics), incubadoras, oscuro, y la preparación de los animales experimentales y los tubos de la actividad, se ha descrito previamente 6. El mismo enfoque se usa aquí, con algunas modificaciones menores. <ol class="lalpha"><li&gt; La iluminación de la incubadora está controlado por la propia incubadora. Por lo tanto, es importante sincronizar el ajuste de tiempo entre ordenador y las incubadoras. </li><li> Actividad tubos se limpian para su reutilización por ebullición en una placa caliente en agua desionizada. Una pequeña cantidad de detergente es añadido para la ebullición primero, los tubos se enjuagan bien y se hirvió dos veces más. Si el hilo se utiliza para conectar el tubo, los tubos utilizados actividad (que contiene los alimentos, de cera, y los hilados de mosca) se puede limpiar sin eliminación previa del hilo. </li></ol></li><li> Antes de iniciar un experimento, culturas lugar que contengan tarde pupal etapas moscas en incubadoras durante tres a cuatro días para adaptarse a la iluminación experimental y otras condiciones ambientales. Luz: condiciones de oscuridad constante o se han usado comúnmente para medir el comportamiento del sueño. En este ejemplo, las moscas se aclimataron a la luz constante para eliminar la influencia del reloj circadiano en la respuesta inmune y el comportamiento 2,7,8. Como se describe en la Figura 1A </strong&gt;, moscas de carga 1-4 días de edad en la actividad Trikinetics DAM2 monitores como se describió 6, y registro para un mínimo de tres días antes de la infección. </li></ol> 2. Infect moscas con una cepa patógena de las bacterias <ol><li> El protocolo aquí descrito es específico para S. marcescens, que son fáciles de cultivar y mantener. Protocolos para el almacenamiento a largo plazo y condiciones de cultivo para otras especies bacterianas pueden variar. S. marcescens se almacenan en 15-50% de glicerol a -80 ° C. Para prepararse para almacenamiento a largo plazo, mezclar 2 volúmenes de cultivo bacteriano durante la noche (OD 600 = 0,5 - 1,0) a 1 volumen de glicerol esterilizado en autoclave 50% en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Esto dará lugar a una concentración final de glicerol de 17%. Almacene los tubos a -80 ° C. Para preparar un corto plazo en el uso de código de bacterias, raspar el stock congelado con una punta de pipeta estéril 200 l y realizar una serie de tres vías en una placa de agar LB. Incubar la placa durante la noche a 37 &amp; dpor ejemplo, C para obtener colonias aisladas. Guarde la placa a 4 ° C. Un día antes de la infección programada, recoger una única colonia de la placa de agar LB con una punta de pipeta estéril 200 l y sumergir la punta en un tubo de cultivo que contiene 5 ml de medio LB. Crecer las bacterias durante la noche, o hasta 16 horas en el interior de un agitador incubador a 37 ° C y 250 rpm hasta que se alcanza la fase de crecimiento exponencial. Medir la concentración con un espectrofotómetro a OD 600. La concentración de esta fase varía de 0,5 a 1. Si la concentración es demasiado alta, subcultivar las bacterias y crecer durante otras varias horas para conseguir una concentración óptima. Lleve a cabo el procedimiento cerca de una fuente de llama. Algunas cepas bacterianas están diseñados para resistencia a los antibióticos y se cultivan y se seleccionan para antibiótico apropiado añadir al medio. S. marcescens (ATCC # 8100) no son resistentes a los antibióticos y por lo tanto se desarrollaron en medio estéril sin antibiótico. Para verificar una técnica estéril, hacer un simulacro de culsin volver a bacterias como un control. La solución para infectar las moscas contiene bacterias (diluido a OD 600 = 0,1) y 1% de colorantes de alimentos (Azul Brillante FCF) en PBS. Preparar una solución de control de la inyección mediante la adición de una cantidad equivalente de medio LB utiliza en solución infección y 1% colorante azul en PBS. Store Solutions en hielo. </li><li> Preparar agujas de vidrio para la inyección de las moscas. Tire capilares de vidrio (OD = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) a una punta fina usando un extractor de micropipeta (Narishige). Bajo un microscopio de disección, utilizar unas pinzas finas para romper la punta de la aguja para que la abertura sea suficientemente grande para llenar con fluido de inyección a una aspiración mediante una jeringa, pero lo suficientemente pequeño para minimizar el daño a la marcha durante el proceso de inyección. Después de romper la punta, el tamaño de la punta debe estar alrededor de 40-50 micras. La aguja de vidrio está unido a una jeringa de plástico de 3 cc con una longitud de tubería. El flujo de medio de inyección se controla manualmente aplicando presión positiva o succión con la jeringa. Evitar la contaminación del tubo de goma con inyección de fluido, como el aparato de jeringuilla se utiliza tanto para la infección y las inyecciones de control. </li><li> Anestesie moscas poniéndolos en una plataforma de CO 2. CO 2 se pasa a través de un recipiente sellado de agua para humidificar la almohadilla y para reducir la electricidad estática, lo que puede complicar la manipulación de las moscas en la almohadilla. Inyectar moscas por meter la aguja de vidrio en la región por encima del escutelo del tórax dorsal. El paso del medio de inyección en la marcha se verifica por el colorante de alimentos - las moscas se vuelven azules como los spreads de alimentos para colorear través del sistema. La dosis de bacterias que reciben las moscas se pueden cuantificar como se describe en la Sección 3, a continuación. Algunos diseños experimentales incluyen un grupo de control que recibe lesión aséptico mediante la inyección de moscas con el colorante PBS y comida, pero sin bacterias. </li></ol> 3. Determinar la carga bacteriana Un enfoque para evaluating de la respuesta inmune contra la infección bacteriana es determinar la infección después de la carga bacteriana. D. melanogaster es un gran modelo para determinar este parámetro porque la marcha todo se puede homogeneizar para estimar el número total de bacterias en un individuo. La lógica detrás de este protocolo es que cuando se cultivan en un medio sólido tal como caldo de Luria (LB) agar en una placa de Petri (placa de LB), una sola bacteria forma una colonia visible distinguible. Por lo tanto, por homogeneización de las moscas infectadas en medio LB líquido, generando diluciones en serie del homogeneizado, y la difusión del homogeneizado diluido en placas LB, el número de células bacterianas que infectan una mosca se puede determinar. Un grupo de control de moscas inyectadas con PBS y colorante de alimentos, pero sin las bacterias deben ser utilizados para verificar que la infección no estaba contaminado con otras especies bacterianas. No debe haber colonias en la placa de agar LB en esta condición. <ol><li> Autoclave todos los materiales que se utilizarán para esteprocedimiento antes de realizar la etapa de homogeneización real. Esto incluye 200 puntas de pipeta mu l cortar con tijeras, medio LB, y morteros usados ​​para la homogeneización. Preparar placas por vertido autoclave LB / agar en platos de 10 cm de Petri estériles al menos 1 día antes de homogeneizar las moscas. </li><li> Anestesiar y colectar las moscas en tubos de microcentrífuga 1,5 ml y tubos Almacenar en hielo. </li><li> Lleve a cabo la homogeneización cerca de una llama para evitar la contaminación. Una homogeneización de control que contiene las moscas sin infección se recomienda especialmente cuando se utiliza una cepa bacteriana, tal como S. marcescens, que no son resistentes a los antibióticos. Homogeneizar un mínimo de 2 grupos de 10 moscas por cada condición experimental. El número de moscas utilizadas por homogeneizado se determina por el experimentador. Algunos grupos han utilizado una mosca por homogeneizado, que es útil para la evaluación de la variación en la carga bacteriana entre las moscas individuales 8, mientras que otros han usado 3 a 10 moscas por homogeneizadohacer comparaciones entre genotipo o condición experimental 9-12. <ol class="lalpha"><li> Añadir 400 l de medio LB a cada tubo de microcentrífuga que contiene moscas y homogeneizar utilizando un motor pequeño y mano de mortero (Kontes). </li><li> Utilizando puntas de pipeta esterilizadas cortadas, serial diluir la 1:10 homogeneizado mediante la adición de 20 l LB homogeneizada / medio bacteriano a 1,5 tubo de microcentrífuga que contiene 180 l de medio LB l. Cortar las puntas de pipeta evita el bloqueo de los desechos volantes y asegura que un volumen apropiado está siendo transferido. </li><li> Factor de dilución se determina empíricamente y depende del genotipo de la mosca, la cepa bacteriana utilizada, y las condiciones experimentales. Para el tipo salvaje moscas infectadas con S. marcescens, utilizar diluciones de 1:10 2 o 1:10 3 para moscas homogeneizadas inmediatamente después de la infección, y las diluciones de 1:10 o 1:10 4 5 para moscas de la homogeneizaron 24 horas después de la infección. </li><li> Añadir 100 l de LB / media bacteriana del micrófonorocentrifuge tubos que contienen la dilución final y se extendió el medio en una placa de LB con bolas de vidrio (VWR) para asegurar una distribución uniforme. </li><li> Deseche las bolas de vidrio en 100% de solución de EtOH. Colocar las placas de LB en una incubadora a 37 ° C durante la noche. </li><li> Como un paso opcional, utilizar un sistema de formación de imágenes con luz visual para obtener una imagen de las placas LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Contar el número de colonias ya sea en la propia placa o de la imagen de la placa utilizando la herramienta de recuento en el software Photoshop (Adobe Photoshop CS3). </li><li> Calcular el número de unidades formadoras de colonias por mosca usando la fórmula: [N / (N * D * v)] * V, donde n = número de colonias crecidas en la placa de LB, N = el número de las moscas agrupado en uno tubo de microcentrífuga, D = factor de dilución, y v = volumen de la solución se extendió sobre cada placa; V = volumen inicial del homogeneizado. </li></ol></li></ol> 4. Evaluar sueño y duración de la supervivencia después de la infección <ol><li> Paramoscas que no se cosechan para medir la carga bacteriana, continuar el monitoreo del comportamiento durante otros 7-10 días. Duración de la supervivencia se ve influida por el genotipo de las condiciones ambientales de ventanas, y las especies bacterianas utilizado para la infección. </li><li> Después de ~ 10 días, dar por terminado el experimento, descargar y procesar los datos de comportamiento como se describió previamente 6. Insomniac2 software a medida, que se basa en Matlab, se utiliza para analizar los parámetros del sueño. Es importante eliminar las moscas muertas del análisis de comportamiento. Normalmente, esto restringe el análisis a dentro del primer día después de la infección, dependiendo del tipo de infección y el genotipo mosca. Muerte en el ensayo se indica por el tiempo todos los recuentos de actividad han llegado a cero. Para facilitar el análisis de la supervivencia, Drosonex, software personalizado escrito en Microsoft Visual C + + 6.0, se utiliza para procesar archivos de datos brutos del sistema DAM Trikinetics. Los informes de software como archivos de Excel, la duración de supervivencia de cada vuelo (en horas), recoge la actividad de datuna desde todos los monitores en una sola hoja de cálculo, y notifica el porcentaje de moscas supervivientes con el tiempo establecido por el usuario. Los archivos de Excel están diseñadas para integrarse en otros paquetes de software estadístico para su posterior análisis. </li></ol> 5. Medir la actividad de NF-kB durante la infección utilizando un ensayo luciferase reportero Transgenic kappa B-luc moscas utilizadas en este ensayo se generaron como se describe anteriormente en Kuo et al., 2010 2. Brevemente, el reportero kappa B-luc contiene 8 repeticiones de una secuencia de unión a NF-kB que se insertaron en un promotor aguas arriba de un marco de lectura abierto de luciferasa. <ol><li> Ajuste las moscas a las condiciones de luz experimentales que se describen en la sección 1.2. En este ejemplo, 1-4 días de edad * B-luc moscas están alojadas en viales que contienen una solución de sacarosa al 5%, el 2% a medio agar alimento y se coloca en luz constante (LL) durante 2 días para llegar a la misma edad de otras moscas durante la infección. </li><li> Preparar una microplaca de 96 pocillos para las moscas. Cada pocillo contiene 2 capas de medio de alimentación (Figura 2), la capa superior contiene luciferina, el sustrato de la luciferasa. Añadir 300 l de un 5% de sacarosa, 2% de solución de agar a cada pocillo y dejar que se solidifique. A continuación, añadir una capa superior 50 l a cada pocillo que contenía sacarosa al 5%, 1% de agar, y 2 mM de luciferina (Gold Biotechnology, Inc.). Concentraciones luciferina utilizadas para la actividad del indicador de medida en Drosophila han variado en la literatura, y han sido tan baja como 100 mM 13. La concentración necesaria puede ser determinada empíricamente. Entre las capas de distribución de alimentos, cubrir la placa con un paño de malla fina para facilitar el secado, mientras que se mantiene la esterilidad. La placa deberá dejarse secar por completo, hasta una hora, con el fin de evitar que las moscas se queda pegada en gotas de condensación. Porque luciferina es sensible a la luz, evite exponer las placas a la luz más de lo necesario. </li><li> Aplique una capa adhesiva transparente (Top-Seal-A; Perkin Elmer) a una placa de 96 pocillos de microplaca y perforar con una aguja fina en una cantidad de 2 agujeros por pocillo. Estos orificios no sólo permite el intercambio de aire a cada pocillo, sino que también proporcionan una forma para anestesiar moscas sobre una base individual. Uso de una hoja afilada y el borde recto, introducir un corte entre cada columna. Esto proporcionará una forma fácil de cargar / descargar las moscas en grupos de 8 a la vez. Para cargar las moscas a la microplaca, retirar los viales del incubador y moscas anestesiar a un CO 2 pad. Carga vuela uno por uno a cada pocillo columna por columna. Si una mosca sin darse cuenta se bloquea al sello adhesivo, deje volar solo, ya que a menudo son capaces de liberarse sin intervención. Devuelva la microplaca a la incubadora en LL durante 8-24 horas para adaptarse al nuevo entorno y para consumir el sustrato luciferina. </li><li> Bacterias Cultura, S. marcescens, y preparar una solución para la infección como se describió anteriormente. </li><li> Anestesiar tvuela con una punta de micropipeta unido a una baja presión de CO 2 líneas. Colocar la punta de la micropipeta directamente encima de los agujeros de ventilación realizados para cada pocillo. Tenga cuidado para asegurar que el CO 2 la presión es lo suficientemente alta para anestesiar a la mosca, pero suficientemente baja para evitar daños a la mosca. En grupos de ocho, individualmente transferir cada mosca a un CO 2 pad, e infectar a como se ha descrito anteriormente. Después de la infección, volveos cada una mosca a su estado original y ciérrelo bien la microplaca. </li><li> Luminiscencia medida (TopCount NXT-luminiscencia y contador de centelleo; Perkin-Elmer). El contador de luminiscencia TopCount contiene un casete de apilamiento de las placas, lo que permite lecturas programadas y automatizado continuamente en incrementos deseados para cualquier periodo de tiempo (normalmente de hasta cinco días). Esta característica no está disponible en todos los instrumentos, y la recogida de datos para los experimentos realizados con otros instrumentos por lo tanto puede ser menos frecuente. El contador de luminiscencia se encuentra en un room con una temperatura controlada y programa de iluminación. Coloque los platos en la bandeja de apilamiento, apilar las placas que contienen las moscas claras entre las placas en blanco para que las moscas de recibir la luz. Programa del luminómetro de acuerdo con las especificaciones del fabricante para recoger lecturas cada hora durante un mínimo de 24 horas. En este ejemplo, los detectores están programados para leer cada pocillo durante 10 seg y se expresa el resultado como recuentos (unidades arbitrarias) por segundo. Este valor es un promedio entre 3 lecturas por pocillo. Exportar los archivos de datos a una hoja de cálculo y realizar un análisis estándar, graficando los resultados de luminiscencia. </li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice.">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila.">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo describe un enfoque para investigar cómo el comportamiento, particularmente dormir, está vinculado a los parámetros de la respuesta inmune. Estos parámetros incluyen la carga bacteriana, los resultados de supervivencia, y la actividad de NF-kB, medido por un indicador de luciferasa in vivo. En conjunto, estos parámetros proporcionan información sobre la capacidad de una mosca puede luchar contra una infección. La carga bacteriana y los resultados de supervivencia son parámetros de la resp...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> Incubadoras </td><td> Percival Scientific, Inc. </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Cualquier incubadora capaz de ejecutar luz programada / horarios de la temperatura es la adecuada. </td></tr><tr><td> Drosophila Activitiy Monitores </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Como se describe en otra parte 6, este sistema requiere una interfaz de computadora, software, y otros accesorios. </td></tr><tr><td> Pyrex de vidrio Tubos </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Microplacas de centelleo y contador de luminiscencia </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 detector </td><td> Cualquier lector de microplacas capaz de detectar la luminiscencia puede usarse para este tipo de ensayo reportero. TopCount contiene múltiples detectores y una apiladora automática, sino que es capaz de ser programado para leer continuamente de placas múltiples. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha INNOTECH </td><td></td><td> Imágenes de cultivos bacterianos es opcional, cualquier sistema de imagen digital con capacidad de luz visual es suficiente. </td></tr><tr><td> Micropipetas Puller </td><td> Tritech Research, Inc. </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Suministros </td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato capilares </td><td> World Precision Instrument Inc. </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Jeringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Las agujas de jeringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - cortar la punta de la aguja para evitar daños a la tubería. </td></tr><tr><td> Tubo de silicona, id (0,030 &quot;) de diámetro externo (0,065&quot;) Espesor de la pared (0,018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Usa para conectar las agujas capilares de vidrio a una jeringa </td></tr><tr><td> Llave de paso de 3 vías </td><td> Sociedad Americana Pharmaseal </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pestle Motor inalámbrico </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pestle </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Bolas de cristal de 3 mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Microplacas Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select 96-y placas que son apropiados para la luminiscencia - que deben ser opacas. </td></tr><tr><td> TopSeal-A Microplacas :96-así </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Microplaca Press-On Film adhesivo de sellado </td></tr><tr><td> D-luciferina, sal de potasio </td><td> BioTechnology Gold, Inc. </td><td> Lucna </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Software </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Disponible a petición de los autores </td><td> costumbre, escrito por Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) </td><td> Matlab basado en software que se ha utilizado rutinariamente para el análisis de sueño 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Disponible a petición de los autores </td><td> costumbre, escrito por Thomas Coradetti (Software acera) </td><td> Un PC MSVC6 programa utilizado para el análisis de supervivencia de los archivos de datos brutos recogidos con elTrikinetics sistema </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Adobe </td><td></td><td> Útil para obtener el número de ufc / placa a partir de imágenes digitales (opcional) </td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila

Una compleja interacción entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento del sistema se ha descrito en una amplia gama de especies. Exceso de sueño, en particular, se sabe que ocurre como respuesta a la infección en mamíferos 1 y también ha sido descrito recientemente en Drosophila melanogaster 2. En general se acepta que el sueño es beneficiosa para el huésped durante una infección y que es importante para el mantenimiento de un sistema inmune robusto 3,4. Sin embargo, la evidencia experimental que apoya esta hipótesis es limitada 4, y la función de exceso de sueño durante una respuesta inmune sigue siendo poco clara. Hemos utilizado un enfoque multidisciplinario para abordar este complejo problema, y se han llevado a cabo estudios en el sistema modelo genético simple, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Nosotros utilizamos un ensayo estándar para medir el comportamiento locomotor y el sueño en las moscas, y demostrar cómo este ensayo se utiliza para medir el comportamiento en las moscas infected con una cepa patógena de las bacterias. Este ensayo también es útil para controlar la duración de la supervivencia de las moscas individuales durante una infección. Medidas adicionales de la función inmune incluyen la habilidad de las moscas para eliminar una infección y la activación de NF-kB, un factor de transcripción clave que es central en la respuesta inmune innata en Drosophila. Tanto los resultados de supervivencia y el aclaramiento de bacterias durante la infección juntos son indicadores de la resistencia y la tolerancia a la infección. Resistencia se refiere a la habilidad de las moscas para eliminar una infección, mientras que la tolerancia se define como la capacidad del huésped para limitar los daños de una infección y por lo tanto sobrevivir a pesar de los altos niveles de patógenos en el sistema 5. Monitoreo en tiempo real de la actividad de NF-kB durante la infección da una idea de un mecanismo molecular de la supervivencia durante la infección. El uso de Drosophila en estos ensayos sencillos facilita los análisis genéticos y moleculares de sueñoy la respuesta inmune y cómo estos dos sistemas complejos están recíprocamente influenciados.

<ol><li> La infección favorece el sueño. En este ejemplo, Canton-S (CS) moscas de tipo salvaje y las moscas mutantes que carecen de un gen NF-kB, Relish (Rel E20) 14, se cargaron en dos DAM2 monitores de actividad (n = 32 para cada genotipo) y se infectaron como se describió anteriormente. Las moscas se mantuvieron en luz constante para eliminar la influencia del reloj circadiano en el comportamiento y la infección 2,7,8. Los mutantes E20 Rel se isogenized a CS como se ha descrito ...

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Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Para comprender un enlace entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento, se describe un método para medir el comportamiento locomotor en<em&gt; Drosophila</em&gt; Durante la infección bacteriana, así como la habilidad de las moscas para montar una respuesta inmune por la supervivencia de seguimiento, la carga bacteriana, y en tiempo real de la actividad de un regulador clave de la inmunidad innata, NFkB.

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

15.3K vistas.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. Para comprender un enlace entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento, se describe un método para medir el comportamiento locomotor en Drosophila Durante la infección bacteriana, así como la habilidad de las moscas para montar una respuesta inmune por la supervivencia de seguimiento, la carga bacteriana, y en tiempo real de la actividad de un regulador clave de la inmunidad innata, NFkB.

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Investigación

Inmunología e Infección

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Dos fotones Intravital proyección de imagen de leucocitos durante la respuesta inmunitaria en hígado de ratón tratados con lipopolisacárido

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...