Este trabajo fue apoyado (en parte) por la Israel Science Foundation (Grant 399/11), por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en el marco de la cooperación germano-israelí Proyecto (DIP), y por el Instituto de la Familia Rappaport de Investigación en las Ciencias Médicas.

1. Generación de líneas celulares inducibles <ol><li> Antes del experimento se necesita para encontrar la concentración mínima del fármaco G418 que mata todas las células utilizadas para la preparación de las líneas celulares deseados. Para este propósito, la placa de las células de elección en varios duplicados de placas a 70% de confluencia en el medio que se utilizará durante el experimento y añadir concentraciones crecientes de G418 (0-1.000 g por ml). Monitorear las células diariamente para determinar la concentración mínima G418 que mata a las células de manera eficiente. La muerte celular se observa dentro de 3-7 días. </li><li> Antes de la generación de líneas celulares, se recomienda verificar por ensayos de transfección transitoria que el plásmido que expresa el shRNA puede reducir en cierta medida la expresión del gen bajo estudio. Esto se puede hacer en cualquier línea celular que pueden ser eficientemente transfectadas. </li><li> Placa T-REx-293 células a una densidad de alrededor de 5x10 6 células por placa de 10 cm en 8 ml de medio DMEM (que contiene 10% Tet symadre aprobadas FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades por ml de penicilina y 0,1 mg de estreptomicina por ml, 5 mg por ml blasticidin). Se incuban las placas durante la noche a 37 º C, 5% de CO 2. </li><li> Al día siguiente, cambiar el medio a medio fresco 8 ml antes de la transfección. </li><li> Transfectar las células utilizando 10 g de pSuperior.neo + GFP plásmido Acf1 (Figura 1) que codifica o shRNA SNF2h dirigido por un promotor inducible por tetraciclina H1, así como el gen de resistencia a neomicina fusionado a GFP y conducido por un promotor PGK constitutiva. Añadir el ADN a 500 l de 150 mM de NaCl. Añadir el reactivo jetPIE a otra alícuota de 500 l de 150 mM de NaCl a 2 l por g de ADN. Añadir la solución jetPIE al ADN y mezclar adecuadamente por agitación. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente. Pipetear suavemente complejos de ADN en las placas de 10 cm que contienen 70-80% de células confluentes. Devolver las placas a la incubadora. </li><li> Al día siguiente, sustituir el medio con un medio selectivo (medio DMEM como sedescrito anteriormente que contiene un adicional de 500 g por ml de G418). </li><li> Para las dos semanas siguientes supervisar las células y reemplazar el medio selectivo con un medio fresco cada día similares 3-4 hasta que aparecen colonias y se pueden visualizar con un microscopio. </li><li> Previo al aislamiento de colonias, preparar 24-pocillos con medio selectivo. </li><li> Identificar colonias por ojo, y marque su ubicación en la parte inferior de la placa usando un marcador de color. Verificar al microscopio que las colonias estén bien separados. </li><li> En la campana estéril, aspirar el medio de la placa, enjuagar suavemente con PBS caliente y aspirar así todo el líquido restante. Añadir 3 l de 0,25% de tripsina / EDTA a una colonia en la placa. Pipetear la tripsina varias veces hasta que las células se separen y añadirlos a uno de los pocillos de la placa de 24 pocillos. Repita esto para varias otras colonias en la placa. </li><li> Cultivar las células a 37 º C, 5% de CO 2 hasta que llenan el pozo. A continuación, dividir las células derivadas decada una de las colonias originales en tres pozos, cada uno en una separada 12-pocillos, y se incuban durante la noche. </li><li> Al día siguiente, reemplazar el medio en una placa con medio que contiene 1 mg por ml de doxiciclina a partir de una solución madre preparada en agua destilada dos veces (1-5 mg por ml). Sustituir el medio en una placa de control con medio sin doxiciclina. Incuban las células durante 72 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Células de una cosecha tratada y no tratada un pocillo de cada clon de células para la preparación de extractos de proteína y análisis de transferencia Western para determinar la eficiencia de Acf1 o desmontables SNF2h. Utilizar anticuerpos frente a Acf1 o SNF2h así como anticuerpos frente a alfa-tubulina, que sirve como control de carga. Usar las células en la tercera así, no se trata, para la expansión de clones de células seleccionados en los que además de doxiciclina condujeron a la reducción de al menos 50% en el nivel de la proteína en estudio. Congelar alícuotas de estas células en FBS al 90%, DMSO al 10% para su uso posterior. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. La inducción de Derribo y transfección <ol><li> Células de la placa en el medio selectivo en placas de 10 cm. Añadir doxiciclina a 1 g por ml de medio de las placas y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48-72 horas (ver Figura 4). </li><li> Después de 48-72 hr, Tripsinizar las células de cada grupo de células, contarlos, y la placa de 1.5x10 6 células por placa de 6 cm en el mismo medio, con o sin doxiciclina. Se incuban las células a 37 º C, 5% de CO 2 durante la noche. Plan de manera que cada grupo de placas de sección 2,1 proporcionará las células durante doce placas de 6 cm, incluyendo dos duplicados para el ensayo de DAPI para cada punto, así como una placa para el análisis de transferencia Western de cada muestra (ver figura 4). </li><li> En el día siguiente transfectar las células en placas de 6 cm con las siguientes combinaciones de plásmidos: 1 g de un plásmido vacío o una cantidad idéntica de la plásmido que codifica E4orf4, junto con 4 g de un vectorexpresando Acf1-GFP o GFP-SNF2h hacerse resistentes a la shRNA en los clones de células por introducción de mutaciones silenciosas, o 3 g de la correspondiente vector vacío y 1 g de plásmido que expresa GFP (Figura 4). Usar el reactivo jetPIE como se describió anteriormente (10 l por g de ADN 5) para preparar la mezcla de transfección. Para cada muestra, preparar una mezcla de transfección de tres placas. </li><li> Tras una incubación de 15 min de ADN con el reactivo jetPIE a temperatura ambiente, pipetear suavemente cantidades iguales de complejos de ADN a partir de cada mezcla de transfección sobre tres placas de 6 cm y se incuban a 37 ° C, 5% de CO 2 durante la noche. </li></ol> 3. Ensayo de DAPI en las células transfectadas <ol><li> El día siguiente, extraer las proteínas de una placa por muestra para análisis de transferencia Western para determinar que Acf1 o SNF2h se han derribado y eficiente que E4orf4 se expresó igualmente en las diferentes muestras. </li><li> Aspirar el medio de las placas destinados a la DAPIensayo, se lavan las placas suavemente con PBS y añadir 1 ml de paraformaldehído al 4% en PBS preparado para cubrir las células. Preparación de la solución de paraformaldehído y el tratamiento de las células con esta sustancia química se lleva a cabo en una campana química. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente sin agitación. </li><li> Aspirar el paraformaldehído y lavar tres veces con PBS, balanceo a temperatura ambiente durante 5 min cada vez. Añadir 80% de etanol se mantuvo a -20 ° C y se incuba a -20 ° C durante al menos 1 h. Las placas se pueden mantener bajo etanol a -20 ° C durante varios días mientras se sellan bien para evitar la evaporación de etanol y secado. </li><li> Aspirar el etanol y lavar las células dos veces con PBS y una vez con PBS-BT (PBS que contiene 0,5% de BSA y 0,05% de Tween-20), mecedora a temperatura ambiente durante 5 min cada vez. </li><li> Para evitar la unión no específica de anticuerpos, bloquear las células en 1 ml de PBS-BT tampón que contiene 10% de suero de cabra durante 20 min mientras balanceo a temperatura ambiente. A continuación, lavar tél las células dos veces en PBS-BT, a 5 minutos cada lavado. </li><li> Se incuban las células con el anticuerpo primario (un anticuerpo específico de E4orf4 en nuestro caso) en 1 ml de PBS-BT durante 1 hora mientras balanceo a temperatura ambiente. A continuación, lavar dos veces en PBS-BT y una vez en PBS que contenía 0,1% de BSA, 5 min cada lavado. </li><li> Se incuban las células en 1 ml de BSA PBS-0,1% que contiene el apropiado anticuerpo secundario marcado fluorescentemente y 0,5 g por ml de concentración final de DAPI durante 40 min mientras balanceo a temperatura ambiente en la oscuridad. Entonces lavar con PBS durante 5 min, secar bien por aspiración y mantener las placas boca abajo durante una hora adicional a toda la noche para conseguir un secado completo. A continuación, montar cubierta se desliza en las células, usando Fluoromount G-solución. Se mantienen las placas a 4 º C en la oscuridad hasta que esté listo para contar los núcleos apoptóticos. </li><li> Pídale a un colega para identificar las diversas placas con números nuevos, por lo que contando núcleos apoptóticos en las diferentes muestras se puede hacer de una manera imparcial. </li><li> Visualice las células bajo una umicroscopio fluorescente pright a una magnificación de 400X (en el aire) o 630x (en aceite de inmersión). Identificar las células transfectadas que están teñidas para las diversas proteínas expresadas en cada muestra, y contar el número de núcleos condensados ​​o fragmentados visualizado por tinción con DAPI dentro de la población de células transfectadas. Supervisar varios campos y contar con un total de al menos 200 células transfectadas. </li><li> Calcular el porcentaje de núcleos con morfología apoptótica dentro de la población de células transfectadas. Repetir el experimento, con duplicados, 2-3 veces para calcular la significación estadística de los cambios entre las diferentes muestras. </li></ol> 4. Los resultados representativos La eficacia de la obtención de colonias en las que desmontables condicional de la expresión génica ha tenido éxito es variable, dependiendo del gen implicado. En nuestras manos, se obtuvieron 7 colonias de éxito de 12 pruebas de Acf1 y 6 de cada 18 para SNF2h. Figura 2 shDebe A una placa representativa de clones de células seleccionadas (Figura 2A) así como de una única colonia (Figura 2B). Figura 3 muestra una transferencia de representante preparado con proteínas extraídas de células de diversos clones cultivados en la presencia o ausencia de doxiciclina durante 72 hr. La transferencia se tiñeron con anticuerpos frente a SNF2h y para alfa-tubulina, que sirve como control de carga. Dos de los clones (número 4 y 5) mostraron una fuerte reducción en los niveles de SNF2h a la inducción doxiciclina. Cabe señalar que, aunque el pSuperior.neo + plásmido GFP (Figura 1) usado para la generación de las líneas celulares codifica una proteína de fusión neo-GFP, la fluorescencia verde en las líneas celulares estables fue muy baja y la expresión de otras proteínas de fusión GFP introducido transitoriamente en estas células podría ser fácilmente detectados por encima de la fluorescencia verde de fondo. Una representación esquemática de los experimentos llevados a cabo en los clones de células para medirAsegúrese de que el efecto de Acf1 o desmontables SNF2h sobre la muerte celular inducida por E4orf4 se muestra en la figura. 4. El tiempo necesario para la caída de la expresión génica mediante el tratamiento con doxiciclina puede variar dependiendo de la estabilidad de la proteína cuyos niveles se debe reducir. Para Acf1 y SNF2h, un 72 horas de tratamiento se requiere para knockdown eficiente a nivel de proteínas. La Figura 5 muestra un ejemplo de células que expresan E4orf4 y GFP y experimentando la muerte celular manifiesta por la aparición de núcleos teñidos con DAPI con una morfología condensada o fragmentada. Figura 6 muestra los resultados de un experimento representativo que demuestra que la doxiciclina inducida Acf1 desmontables llevado a una aumentar en E4orf4 estimulada por la muerte celular (Figura 6A). Este aumento no fue resultado de un aumento en los niveles de E4orf4 (Figura 6B). Además, la restauración de Acf1 a las células doxiciclina inducida disminuye el aumento de E4orf4 toxicidad a los niveles<html> observada en las células no inducidas (Figura 6). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg"/> Figura 1. Mapa de la pSuperior.neo + plásmido GFP. El mapa muestra el promotor inducible por tetraciclina H1 conducción shRNA expresión y la expresión del promotor PGK conducción de una proteína de fusión neo-GFP. El mapa es una adaptación del manual de Oligoengine pSuperior. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" /> Figura 2. Imágenes de identificación de las colonias resistentes a la neomicina. De una placa que contiene colonias (A) y de una única colonia (B) son mostrados. Las colonias se obtuvieron por cultivo de las células durante 14 días en un medio selectivo que contiene neomicina. ys &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" /> Figura 3. Las células examen de la eficiencia caída en las colonias seleccionadas. De varias colonias seleccionadas en presencia de neomicina se cultivaron en pocillos duplicados. Un pocillo de cada muestra fue inducida por doxiciclina (+) y uno bien se dejaron sin tratar (-). Las proteínas se extrajeron 72 horas después de la inducción y se cromatografió en SDS-PAGE. El Western blot se tiñeron sucesivamente con anticuerpos frente a SNF2h y para alfa-tubulina (que sirve como control de carga) y muestra los niveles de SNF2h en células inducidas y de control. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" /> Figura 4. Planificación de un típico experimento desmontables-DAPI ensayo. Sucesivos pasos del experimento se muestran, incluyendo el tratamiento con doxiciclina para lograr Acf1 o desmontables SNF2h, una transfección para restaurar Acf1 o SNF2h expresión o para introducir un énfasisTy vector e introducir E4orf4 o su vector vacío correspondiente en las células, y el análisis de los resultados. Doxycycline placas tratadas se muestran en rojo (Dox) y las placas de control están marcados en azul. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" /> Figura 5. Células de detección de la muerte celular inducida por E4orf4 por el ensayo de DAPI. Que se sometieron a los diversos tratamientos descritos en la Figura 4 se fijaron y tiñeron con anticuerpos específicos de E4orf4 y DAPI para visualizar los núcleos de las células transfectadas. Esta imagen específica fue tomada de una muestra que contiene E4orf4 y la proteína de control GFP. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) las imágenes fusionadas. Las flechas blancas marca de las buenas prácticas agrarias y E4orf4 transfectadas las células que contienen núcleos con morfologías apoptóticas. Las flechas rojasmarcar los núcleos con formas irregulares que no se cuentan como núcleos apoptóticos. Los asteriscos marca núcleos mitótico o núcleos que acaba dividida. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" /> Figura 6. Acf1 desmontables mejora E4orf4 la muerte celular inducida. (A) Las células de la línea celular T-REx-293-derivada expresando Acf1-shRNA partir de un promotor inducible por tetraciclina fueron inducidas con doxiciclina (+ DOX) o se deja sin tratar (Dox-). Tres días más tarde, las células fueron transfectadas con plásmidos que expresan E4orf4 (+ E4orf4) o un vector vacío (-E4orf4) junto con un vector vacío o un plásmido que expresa GFP-etiquetados Acf1, que se hizo resistente a la shRNA por la introducción de silencio mutaciones. Las células se fijaron veinticuatro horas después de la transfección y se tiñeron con anticuerpos para E4orf4 y con DAPI. La inducción de la muerte celular se midió por el ensayo de DAPI se ha descrito anteriormente y el porcentaje of células transfectadas con núcleos condensados ​​o fragmentados se determinó. Un experimento representativo con tres repeticiones se muestra, y las barras de error representan la desviación estándar. (B) Las células de placas paralelas se recogieron para análisis de transferencia Western. La transferencia se tiñeron con anticuerpos frente a E4orf4, GFP, y Acf1. El endógena Acf1 y Acf1 GFP-se muestran en dos paneles separados.

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R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference.">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li><li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model.">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127 (2003).</li><li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns.">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li><li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes.">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li><li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway.">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li><li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells.">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li><li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B'+subunits+of+protein+phosphatase+2A,+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba.">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E4orf4,+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk.">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells.">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases.">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Desmontables de la expresión génica específica es un enfoque importante para la investigación de la contribución de una proteína a las vías de regulación. Desde desmontables constitutivo de expresión de genes esenciales afecta negativamente la proliferación celular, su estudio puede requerir ya sea introducción transitoria de siRNAs o la aplicación de sistemas estables desmontables condicionales. Generación de líneas celulares estables con capacidad de expresión inducida por el fármaco de shRNAs descrito...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Alta glucosa DMEM </td><td> Gibco </td><td> 41965 </td><td></td></tr><tr><td> Tet sistema aprobado de FBS </td><td> Clontech </td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Pen Strep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> T-Rex-293 células </td><td> Invitrogen </td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma </td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td> blasticidin </td><td> Invitrogen </td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td> pSuperior.neo + plásmido GFP </td><td> Oligoengine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Transfección Polyplus </td><td> 101-40 </td><td></td></tr><tr><td> doxiciclina </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehído </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of cell-lines for conditional knockdown of gene expression and measurement of the knockdown effects on e4orf4-induced cell death

Inactivación funcional de la expresión génica en células de mamífero es crucial para el estudio de la contribución de una proteína de interés a 1,2 diversas vías. Sin embargo, desmontables condicional de la expresión génica se requiere en los casos cuando desmontables constitutiva no es tolerado por las células durante un largo periodo de tiempo 3-5. Aquí se describe un protocolo para la preparación de líneas celulares que permiten desmontables condicional de subunidades del factor de remodelación de la cromatina ACF. Estas líneas celulares de facilitar la determinación de la contribución de la ACF para la inducción de muerte celular por el adenovirus E4orf4 proteína 6. Las secuencias que codifican los ARN de horquilla corta para las subunidades Acf1 y SNF2h del factor de remodelación de la cromatina ACF se clonaron al lado de un promotor inducible por doxiciclina en un plásmido también contiene un gen para el gen de resistencia a neomicina. Resistentes a la neomicina se seleccionaron clones de células en presencia de G418 y aislado. Las líneas celulares resultantes fueron inducidos porel tratamiento con doxiciclina, y una vez Acf1 o los niveles de expresión reducida SNF2h fueron, las células fueron transfectadas con un plásmido que codifica E4orf4 o un vector vacío. Para confirmar el efecto específico de las construcciones shRNA, los niveles de Acf1 o SNF2h proteínas se restauraron a niveles de tipo silvestre por cotransfección con un plásmido que expresa Acf1 o SNF2h que se volvieron resistentes a la shRNA por introducción de mutaciones silenciosas. La capacidad de E4orf4 para inducir la muerte celular en las diferentes muestras se determinó por un ensayo de DAPI, en los que se midió la frecuencia de aparición de núcleos con morfologías apoptóticas en la población de células transfectadas 7-9. El protocolo aquí descrito puede ser utilizado para la determinación de la contribución funcional de proteínas diferentes a la inducción de muerte celular por los socios de sus proteínas en los casos en que puede ser desmontables constitutiva celular letal.

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Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Contribución del factor de remodelación de la cromatina ACF a la muerte celular inducida por E4orf4 se midió. El protocolo incluye la selección de clones de células en las que el tratamiento con doxiciclina induce desmontables condicional de la ACF subunidades Acf1 y SNF2h, y el uso del ensayo de DAPI para medir E4orf4 inducida por la muerte celular en las líneas celulares inducibles.

Preparación de líneas celulares de Derribo condicional de la expresión génica y la medición de los efectos desmontables en la muerte celular inducida por E4orf4

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

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10.9K vistas.  Technion - Israel Institute of Technology. Contribución del factor de remodelación de la cromatina ACF a la muerte celular inducida por E4orf4 se midió. El protocolo incluye la selección de clones de células en las que el tratamiento con doxiciclina induce desmontables condicional de la ACF subunidades Acf1 y SNF2h, y el uso del ensayo de DAPI para medir E4orf4 inducida por la muerte celular en las líneas celulares inducibles.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Investigación

Biología

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

Generación de líneas celulares estables Humanos (Tet-on) inducible por tetraciclina o shRNA expresión cDNA

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Derribo Gene a gran escala en<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizar bibliotecas de alimentación de dsRNA para generar sólidas fenotipos de pérdida de función

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...