Este trabajo fue apoyado por la compañía de seguros de vida &quot;Novalis-Taitbout&quot;, Escuela de Neurociencias de París (PEV), la Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-neur-004&quot; en el marco de la &quot;ERA-NET NEURON&quot; de 7PM programa por la Comisión Europea, &quot;Fundación pour la Recherche Medicale&quot;, la Fundación Letten y la Fundación Pasteur.

1. Estereotáxica inyecciones <ol><li> El virus utilizado en estos experimentos es un vector lentiviral replicación deficiente basada en el virus del VIH para expresar Channelrhodopsine2-YFP (proteína fluorescente de color amarillo) construcción de fusión controlado por un promotor sinapsina 6. El plásmido fue generosamente proporcionada por K. Deisseroth &#39;s del grupo de investigación ( <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ). Los lentivirus se puede obtener de fuentes comerciales o producidos en el laboratorio de acuerdo a los protocolos establecidos 7. Los títulos de promedio de vectores fueron del orden de 10 10 unidades de transducción / ml. Alícuotas viral se almacenan a -80 ° C y debe ser descongelado antes de la carga de pipeta. Múltiples de congelación / descongelación ciclos deben ser evitados. Nunca la exposición del virus de la solución directamente en hielo seco. </li><li> Prepare pipetas de vidrio de borosilicato con capilares de vidrio en el estándar pipeta extractor (Sutter P-97 Pipeta asistente de cámara). La configuración de tracción debe estar adecuadamente calibrado para obtener una pipeta larga y rígida. A continuación, corte la punta de la pipeta con un par de tijeras para obtener una propina de 30 a 40 micras de diámetro. Tienda sacó pipetas en una caja libre de polvo. </li><li> Configuración de la Nanoject II microinyector con las instrucciones del fabricante para la entrega de 50 nL. Prepare la pipeta de inyección de back-llenado con aceite mineral y la inserta en el émbolo microinyector. Conecte el microinyector en un marco estereotáxico. El aceite parcialmente vacío de la pipeta de vidrio antes de llenar con la solución de virus </li><li> Con una micropipeta, de transferencia de 2 l de solución de virus en un trozo de Parafilm estéril. Baje suavemente la pipeta de vidrio dentro de la gota de la solución de virus y llenar la pipeta con 2.1 l. Asegúrese de que no hay burbujas de aire en la pipeta. </li><li> Anestesiar a un ratón con 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina, diluida en solución salina estéril. Quitar el pelo del cuero cabelludo de laanimales utilizando tijeras de roedores, maquinilla de afeitar, tijeras, o un agente químico depilitory. Desinfectar el cuero cabelludo con tres aplicaciones de alternancia de etanol al 70% y el betadine. Todos los instrumentos quirúrgicos deben esterilizarse en autoclave y luego desinfectar con alcohol al 70%. Colocar el animal en el marco estereotáxico con las barras de los oídos y la nariz de barras, asegurando que la cabeza es seguro. Aplique una pomada ocular para prevenir la sequedad de la córnea. </li><li> Con un bisturí, cortar el cuero cabelludo de entre los ojos de entre las orejas. Tire de la piel a un lado para exponer el cráneo y el anclaje de la piel con un par de pinzas. Limpie la superficie del cráneo. El aparato estereotáxico se pone a cero con la punta de la pipeta de vidrio en el bregma. Entonces la punta se coloca en el sitio de la inyección (antero-posterior, 3,30; medio-lateral, ± 0,82, para ambos hemisferios derecho e izquierdo, respectivamente). La posición de la barra de la nariz debe ser ajustada de acuerdo con el cálculo de las coordenadas estereotáxica. En nuestro experimento, la barra de la nariz se ajusta uasta bregma y el sitio de inyección están alineados a la misma altura. </li><li> Identifique el sitio de inyección. Usando un taladro quirúrgico de alta velocidad, con cuidado agujeros en el cráneo. Con una aguja de jeringa doblada enganchada en la punta, quitar los restos de hueso fino para exponer la duramadre. Compruebe que el agujero se centra en la posición correcta. Tenga cuidado de no romper los vasos sanguíneos en la superficie del cerebro durante la perforación. Si los vasos sanguíneos se rompen, presione suavemente sobre la superficie del cerebro con un bastoncillo de algodón o tejido pequeños durante varios segundos hasta que el flujo sanguíneo se detiene. </li><li> Inferior de la pipeta y el cero de la altura dorso-ventral en la punta de la pipeta toque la superficie del cerebro. A continuación, baje a la profundidad correcta dorso-ventral (dorso-ventral, el 2,9 de la superficie del cerebro) y esperar 30 segundos para el equilibrio de presión. Se inyecta 4 veces 50 nl de virus para un total de 200 nl. Espere 30 segundos entre cada inyección. </li><li> Un minuto después de la última inyección, extraiga lentamente la tuberíatte. Repita los puntos 1.6-1.8 para el otro hemisferio. Quitar el animal de aparato estereotáxico, limpiar la incisión y el punto de corte de la piel con hilos quirúrgicos. Que el animal pueda recuperarse en la plataforma de calentamiento antes de regresar a la jaula. Además, los animales se puede dar un no-esteroides anti-inflamatorios analgésicos (por ejemplo, carprofeno 4mg/kg) inmediatamente después y tres días después de la cirugía. </li></ol> 2. Implantación crónica LED para la estimulación optogenetic vivo en el bulbo olfatorio <ol><li> Los animales inyectados con partículas lentiviral bilateral están al lado implantados en forma permanente con un LED azul en miniatura (Osram, LED CMS 4.6W azul). Soldadura de los pines LED a una hembra de conectores eléctricos en miniatura para que el conector se coloca en el lado opuesto de la LED. Compruebe que no hay atajos eléctricos e identificar el pin positivo y negativo en el conector. Pruebe el LED mediante la conexión a un controlador de corriente de LED a través de un cable adecuado. </li><li> Para medir y / o establecer el poder absoluto de la luz del LED, el LED de montaje en un micromanipulador y la posición del LED en contacto directo con la célula fotoeléctrica de un medidor de potencia de un pico de intensidad de la luz a 470 nm. Perforar un agujero de 3 mm de diámetro en una placa opaca de PVC. Coloque este agujero con el medidor de potencia y construir una curva de nivel de potencia óptica frente a la corriente de entrada para calcular la potencia por 2 mm. </li><li> Para medir la propagación de la luz a través del cerebro, cortar los bloques de tejido cerebral fresco de 300, 500, 1000, 1500 y 2500 m de espesor en 0-4 º C con un ACSF vibratome 14. Coloque un pedazo de cráneo con una craneotomía idéntica a la realizada en ratones vivos en el LED. En primer lugar, medir la potencia de la luz sin el tejido centrado en LED. Luego, coloque cada bloque de tejido entre el LED y el fotodetector del medidor de potencia, y medir el poder. Construir una curva de espesor de los tejidos frente a la transmisión de la fracción relativa, calculada como el cocienteentre la potencia medida a través del tejido y sin tejido. </li><li> Anestesiar a un ratón con 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina, diluida en solución salina estéril. Limpie y desinfecte el LED con el 70% de etanol. Quitar el pelo del cuero cabelludo de los animales y desinfectar el cuero cabelludo con tres aplicaciones de la alternancia del 70% de etanol y betadine. A continuación, coloque el animal en el marco estereotáxico. Aplique una pomada ocular para prevenir la sequedad de la córnea. Enchufe el conector a un titular estereotáxica. La posición de la barra de la nariz debe ser ajustada hasta que la superficie del cráneo por encima del bulbo olfatorio es perfectamente horizontal y paralela a la superficie de la miniatura LED. </li><li> Con un bisturí, cortar el cuero cabelludo de 3 mm por delante de los ojos a 3 mm por detrás de las orejas. Tire de la piel a un lado y fijarlo con un par de pinzas. Raspe las membranas en la superficie del cráneo una hoja de afeitar. Limpie y seque el cráneo. Aplicar una capa delgada de pegamento instantáneo para permitir anuncios posteriorescohesión de acrílico dental. </li><li> Usando un taladro quirúrgico de alta velocidad, realizar una craneotomía rectangular (1 mm y 3 mm de caudal lateral, centrado en 5,1 mm caudal, 0 mm lateral de bregma) en los bulbos olfatorios. Para ello, cuidadosamente delgada del cráneo hasta que sólo quede una fina capa de restos óseos. Retire con cuidado el hueso restante con la ayuda de una aguja de jeringa dobladas. Especial cuidado se debe tomar para evitar la punción de la materia dura y la ruptura de los vasos sanguíneos principales que se encuentran entre los dos hemisferios y en el borde caudal de los bulbos olfatorios. La acumulación de sangre y coagulación en la superficie del cerebro se opone a la penetración óptima de la luz en el tejido. Enjuague la craneotomía y la superficie del cerebro con solución salina estéril y seco en el cráneo. </li><li> Conecte el LED en miniatura en el conector. Baje la miniatura LED en la parte superior de los bulbos olfatorios. El eje principal de la miniatura LED debe ser paralela al eje rostral-caudal del ratón, limpieza con solución salina estéril y dry el cráneo. Luego asegure el LED en el cráneo con una primera capa de acrílico (cemento, es decir, policarboxilato), seguido por una segunda capa de acrílico dental. La adición de dos pequeños tornillos puede ser necesaria para corregir el LED. Los tornillos deben ser insertados en el cráneo (por detrás de la posición de LED) y se cubre con los acrílicos. Mientras que el acrílico es todavía líquida, tire hacia atrás y pegar los bordes libres del cuero cabelludo en la superficie del acrílico dental. Tenga cuidado de no aplicar ningún tipo de acrílico en el conector. Después de que el acrílico se ha endurecido, retirar el animal del aparato estereotáxico y dejar que se recuperen en un cojín de calentamiento antes de regresar a la jaula. Los animales se quedan aislados en su jaula para recuperarse de la cirugía por lo menos durante siete días. Además, los animales se puede dar un no-esteroides anti-inflamatorios analgésicos (por ejemplo, carprofeno 4mg/kg) inmediatamente después y tres días después de la cirugía. LEDs deben ser probados antes de la implantación y después de la terminación de los experimentos. </li><li> A la luz eléccal cable se utiliza para atar al animal a un regulador de corriente de LED acoplado a un generador de impulsos (Master-8) para controlar el ritmo y la intensidad de los LED. El cable delgado permite una total libertad de movimiento. Tenga cuidado de respetar la polaridad del conector. La inversión de la polaridad puede romper el LED. </li></ol> 3. Los resultados representativos: ChR2-YFP se expresa en neuronas transducidas aproximadamente 48 horas después de la inyección, y se mantiene estable desde hace varios meses 7. La figura 1 es una imagen representativa de una sección sagital de un animal de paraformaldehído-fijo 15 días después de la inyección. Tenga en cuenta el etiquetado denso y el tamaño del sitio de la inyección en el RMS. Un gran número de células recién nacidas han migrado a lo largo de la RMS para colonizar las distintas capas del bulbo olfatorio (Fig. 1). La proteína de fusión se expresa en todos los compartimentos neuronales, incluyendo el soma, dendritas y espinas. Miniatura LED impla<html> ntation permite a gran escala y bajo costo estimulación óptica de una amplia región de interés. El animal está atado con el controlador LED con un cable de luz eléctrica que permite una total libertad de movimiento. Al caracterizar a la difusión de la luz en el tejido cerebral y el umbral de activación del ChR2, se estima que la activación óptica puede ser activado a una profundidad de ~ 2 mm por debajo de la superficie del LED (Fig. 2A). Para controlar la activación funcional de ChR2 neuronas que expresan in vivo, la expresión de c-fos, un marcador de actividad neuronal, se puede analizar la luz después de la estimulación repetitiva (Fig. 2B). Como alternativa, en los registros electrofisiológicos in vitro de neuronas que expresan ChR2 junto a la estimulación de luz focal se pueden realizar 14. Por último, dos fotones dirigidos sueltas parche grabaciones se han utilizado para estudiar la activación funcional de ChR2 que expresan las neuronas corticales en miniatura similares LED en vivo 9. ntent &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" /> Figura 1. ChR2-YFP expresión de la inyección de lentivirus en la corriente migratoria rostral. Confocal imágenes representativas de las secciones sagital del bulbo olfativo de un ratón de 15 días después de la inyección de un lentivirus de la rostral RMS. Tenga en cuenta la presencia de neuronas dispersas YFP recién nacidos migran desde el final de la RMS de las diferentes capas de la OB. La mayoría de las células de recién nacidos (95%) son las células granulares, que se encuentran en el soma de la capa de células granulares (GCL) y las dendritas se ramifican en la capa plexiforme externa (EPL). Una pequeña población de neuronas recién nacidas emigran hasta la capa más superficial de la obstetricia, en la capa glomerular (GL). Barra de escala, 100μm. Ampliación de la inserción de alta de un recién nacido de células granulares, que muestra la expresión en la membrana de ChR2-YFP en las dendritas, así como en las espinas. Barra de escala, 20μm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" /&gt; Figura 2. Diagrama de implantar LED en la parte superior del bulbo olfatorio y la luz evoca la expresión de c-fos en ChR2-YFP células que expresan el nuevo gránulo. Un dibujo, Esquema de los LED implantados por encima de los bulbos olfatorios. B, Representante confocal de imágenes que muestran doble etiquetado ChR2-YFP + c-fos células granulares + una hora después de la estimulación de la luz del bulbo olfatorio. C-fos expresión se revela con un conejo anti-c-fos anticuerpo primario (Calbiochem, 1:5000) y A568-conjugado anti-conejo secundaria de anticuerpos (Invitrogen, 1:1000). Barra de escala, 10μm.

<ol>
	<li>Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Alonso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+astrocytes+from+the+rostral+migratory+stream+into+neurons:+a+role+for+the+olfactory+sensory+organ.">Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.</a> J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li><li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons:+when+time+matters.">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How,+when,+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Haubensak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+an+amygdala+microcircuit+that+gates+conditioned+fear.">Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear.</a> Nature. 468, 270-276 (2010).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+Production.">Lentivirus Production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li><li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice.">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li><li>Arenkiel, B. 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Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons.">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Herramientas Optogenetic han aumentado recientemente el control sobre selectiva poblaciones neuronales, incluyendo los adultos las neuronas nacidas en el sistema olfativo. A continuación se describe cómo realizar una inyección estereotáxica de un vector lentiviral expresar ChR2-YFP en una población específica de los adultos nacidos en las neuronas. Controlando cuidadosamente el período post-inyección, que son capaces de analizar y manipular la actividad de una cohorte de adultos nacidos en las neuronas con una e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material </td><td> Empresa </td><td> Catálogo N º </td></tr><tr><td> La ketamina </td><td> Merial </td><td> Imalgène 1000 </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Bayer Health Care </td><td> Rompum 0,2% </td></tr><tr><td> Pipeta Extractor </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Capilares de vidrio (3,5 &quot;) </td><td> Drummond Científico </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Nanoject II microinyector </td><td> Drummond Científico </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Taladro de velocidad alta quirúrgica </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 18000-17 </td></tr><tr><td> Taladro de acero micro rebabas 0,7 mm diámetro de la punta </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 19008-07 </td></tr><tr><td> LED azul CMS 4.6 W </td><td> OSRAM </td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td> Conector hembra eléctrica (2,54 mm) </td><td> Fischer Elektronik </td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> Regulador de corriente de LED (max: 1A) </td><td> A1W Electronik </td><td> HKO-KL50-1000 </td></tr><tr><td> Generador de impulsos </td><td> AMPI </td><td> Maestro-8 </td></tr><tr><td> Medidor de potencia óptica </td><td> Thor Laboratorios </td><td> PM100 </td></tr><tr><td> Adhesivo de cianoacrilato </td><td> Loctite </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Cemento de policarboxilato (primera capa de cemento) </td><td> Septodont </td><td> Selfast (# 0068Q) </td></tr><tr><td> Metacrilato de cemento (cemento segunda capa) </td><td> GC InternationalCorp. </td><td> Unifast Trad - líquido (# 339292) Unifast Trad - Polvo (# 339114) </td></tr><tr><td> Carprofeno </td><td> Pfizer </td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selective viral transduction of adult-born olfactory neurons for chronic in vivo optogenetic stimulation

Interneuronas locales se regeneran continuamente en el bulbo olfativo de los roedores adultos 1-3. En este proceso, denominado neurogénesis adulta, las células madre neurales en las paredes de los ventrículos laterales dan origen a los neuroblastos que migran de varios milímetros a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) para alcanzar e incorporar en el bulbo olfatorio. Para el estudio de los diferentes pasos y el impacto de la integración de las neuronas adultas de origen en los circuitos preexistentes olfativo, es necesario etiquetar y manipular de forma selectiva la actividad de esta población específica de las neuronas. El reciente desarrollo de las tecnologías de optogenetic ofrece la oportunidad de utilizar la luz para activar precisamente este grupo específico de neuronas sin afectar a las neuronas circundantes 4,5. A continuación, presentamos una serie de procedimientos para expresar de forma viral Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP en una cohorte temporalmente restringido de neuroblastos en el RMS antes de llegar al bulbo olfatorio y se hacen adultos nacidos en neurons. Además, se muestra cómo se implante y calibrar una miniatura de LED para la estimulación crónica en vivo de ChR2 neuronas que expresan.

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Las neuronas nacidas de adultos del bulbo olfatorio puede ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 que expresan lentiviral inyección en la corriente migratoria rostral y fotoestimulación crónica con una miniatura implantado LED.

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

selective-viral-transduction-adult-born-olfactory-neurons-for-chronic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

15.4K vistas.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Las neuronas nacidas de adultos del bulbo olfatorio puede ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 que expresan lentiviral inyección en la corriente migratoria rostral y fotoestimulación crónica con una miniatura implantado LED.

Video: Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

El estudio de la integración de los adultos nacidos en las neuronas

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Investigación

Neurociencias

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

La implantación de fibra óptica para la estimulación optogenético crónica en el tejido cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...