Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (NIDA) de subvención R01 DA24040 (DCC) de la Universidad de Colorado Fondo Semilla Innovador (DCC), y NIDA beca de formación T32 DA017637 (MVB).

1. Almacenamiento Virus y Preparación <ol><li> El uso de vectores AAV incompetentes para la replicación para la entrega de genes opsina para el cerebro de roedores está aprobado para el Nivel de Bioseguridad 1 (BSL-1) y requiere de una adecuada protección y procedimientos de manejo como se describe en la publicación de Gobierno de los EE.UU., Bioseguridad en Microbiología y Laboratorios Biomédicos, disponible en los Centros para el sitio web de Control de Enfermedades al ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> Con el fin de evitar los ciclos de congelación-descongelación, el virus de la pipeta de vial del fabricante en alícuotas de trabajo más pequeños en una clase II de Bioseguridad Gabinete y almacenar en un -80 ° C congelador. </li><li> Antes de la inyección estereotáxica, permite una alícuota de descongelar en hielo y luego girar brevemente abajo con una centrífuga de sobremesa. </li><li> Lentamente rellenar una jeringa de vidrio Hamilton y aguja con una pequeña cantidad de silicona o aceite mineral.Asegúrese de que no haya burbujas de aire visibles en el cuerpo de la jeringa. Inserte la jeringa en una bomba microinyector y conecte la bomba directamente al brazo estereotáxica vertical (es decir, manipulador estereotáxica). </li><li> Bajar el brazo estereotáxica hasta que la punta de la aguja toca el fondo del tubo alícuota de virus. Utilice el controlador para la bomba de microinyector de retirar el volumen deseado del virus (1,5 l para una inyección de 1 l). </li><li> Todo el material y las superficies que entran en contacto con el virus deben descontaminarse con un desinfectante como cloro (10%). </li></ol> 2. La cirugía y la Inyección de virus <ol><li> Se anestesia de los animales con una mezcla de ketamina (de rata; 125 mg / kg, ip) - xilazina (rata; 10 mg / kg, ip) cóctel. Para medir la efectividad de la anestesia, compruebe si hay una respuesta refleja a una pizca dedo del pie y dar dosis suplementarias de ketamina si es necesario. El uso de métodos quirúrgicos asépticas estándar, colocar los animales en un aparato estereotáxico (David Kopf Eninstrumentos). </li><li> Haga una incisión en la línea media a través de la piel en la parte superior del cráneo de los animales con pequeñas tijeras quirúrgicas o bisturí. Separar suavemente el tejido conjuntivo y limpiar la parte superior del cráneo con un pequeño raspador de hueso. </li><li> Verifique que la cabeza del animal está a nivel tal que el z coordenadas de bregma y lambda son iguales. Determine las coordenadas estereotáxica para el área del cerebro objetivo de un atlas del cerebro tales como el cerebro de rata en estereotáxica Coordenadas (George Paxinos y Charles Watson, Academic Press, 2007) o El cerebro de ratón en estereotáxica Coordenadas (BJ Keith Franklin y George Paxinos, Academic Press , 2007). Marcar el sitio previsto de la inyección con una pluma quirúrgica. </li><li> Cuidadosamente delgada del cráneo por encima del área de destino usando un taladro de mano y se detendrá cuando la broca de perforación alcanza la parte inferior del cráneo. Con un par de pinzas finas adicionales, retirar el hueso adelgazado con el fin de exponer la duramadre. </li><li> Colocar la aguja de la jeringa sobre el objetivo sonA y bajar la aguja hasta que toque la duramadre y utilizar este punto para calcular la coordenada z. Muy bajar lentamente la aguja de inyección en el cerebro hasta que se alcanza la posición correcta z. En este protocolo, la región prelimbic de la corteza prefrontal medial (2,7 mm anterior al bregma, ± 0,5 mm lateral a la línea media, y -2,2 mm de duramadre) o subiculum dorsal (-6.0 mm anterior al bregma, ± 3,0 mm lateral a la línea media, y -2,0 mm a partir de la duramadre) se dirige en un adulto de rata Sprague Dawley macho (aprox. 275 g). </li><li> Inyectar el virus a una tasa de 0,1 l / min. Después de que se complete la inyección de esperar 10 minutos antes de retirar la aguja para evitar el flujo de retorno del virus a la superficie del cerebro. </li><li> Utilice una sutura de coser con aguja fija para sellar la piel y aplicar antibióticos a la herida. </li><li> El curso temporal de la expresión funcional ChR2 y NpHR de vectores de AAV variará dependiendo del diseño experimental y el título viral. Para este experimento, in vivo </em&gt; grabaciones se realizaron inyección de 18-21 días después. </li></ol> 3. Entrega Luz y En vivo Grabación de ChR2 o neuronas que expresan NpHR <ol><li> Conecte un electrodo de tungsteno (~ 1-1.5 MΩ, minipostes) a un tubo capilar de vidrio (Fisher Scientific) usando pegamento. </li><li> Utilice una herramienta de extracción de la fibra (Thorlabs) para exponer el extremo desnudo de una fibra óptica multimodo (200 m de diámetro del núcleo, Thorlabs) y punta de fibra limpia con etanol. Muy ligera marcar punta de la fibra con un cuchillo de diamante en forma de cuña (Thorlabs) y retirar con cuidado el exceso de fibra (por ejemplo, con unas pinzas finas). La fibra debe adherirse fácilmente a la partitura. </li><li> Conectar el extremo de FC de la fibra en el conector de PC en el puerto de salida de un solo láser de diodo de 200 mW ( <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) con la longitud de onda deseada. Asegúrese de que las gafas de protección adecuada se usa en todo momento cuando se trabaja con el láser. </li><li> Mida la lintensidad aser en la punta de la fibra óptica utilizando un medidor de potencia óptica ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Por in vivo grabaciones, intensidad de la luz tan poco como 20 a 100 mW / mm 2 puede evocar fiable ChR2-o la activación o silenciamiento mediado por NpHR, respectivamente, de la actividad neuronal. </li><li> Inserte la fibra óptica en el tubo capilar. Coloque la punta de la fibra de aproximadamente 500 m por encima de la punta del electrodo de tungsteno y atar un hilo de sutura fina dos veces en unos pocos puntos cerca de la punta de modo que el electrodo y la fibra son rectas. Asegúrese de que la distancia entre la punta del electrodo y el nudo más cercano es el tiempo suficiente para la inserción de la región de destino. </li><li> Preparar el animal como en los pasos 2.1 y 2.2. Utilice la craneotomía inicial como guía para hacer una nueva ventana pequeña limpia en el cráneo para colocar el Optrode ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Haga una pequeña incisión en la parte dura usando una aguja fina. </li><li> Baje con cuidado la Optrode a través de la ventana de cráneo y en el cerebro para la región transducidas utilizando un micromanipulador (Narishige). Luego avanzar el Optrode lentamente en 10-50 micras pasos hasta la aparición de una célula responde a la luz. </li><li> Una interfaz de usuario de software personalizado (NeuroLux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) escrito en LabVIEW (National Instruments) se utiliza para controlar el láser de diodo único y para visualizar y registrar la actividad neuronal en curso. Señales grabadas se capturaron con una EJEMPLOS-20K (Kation Scientific) amplificador de paso de banda de filtrado (0,3-8 kHz), y un análogo de National Instruments para pizarra digital (NI USB-6009). La interfaz de usuario NeuroLux Pro permite la elección de las entradas analógicas (dos canales para elegir el neuronal y la señal TTL) y salida digital. El usuario puede definir la frecuencia de muestreo (20 kHz), el período de referencia (antes de la luz), y el período posterior a la luz. El usuario puede definir el stimulati láser TTLla anchura del impulso, frecuencia y periodo de estimulación (si la frecuencia es de 20 Hz y la estimulación periodo es de 500 ms, 10 pulsos láser con ancho de pulso definido se entregan). El usuario también puede elegir una entrega de luz continua (por ejemplo, la Figura 1). Para grabaciones repetidas, el usuario también puede definir el número de trenes de impulsos y el intervalo entre trenes. Los datos pueden ser adquiridos con o sin la grabación en el disco. </li><li> Tras la grabación, los animales se anestesian con el cóctel de ketamina / xilazina y transcardially perfundidos con solución salina fisiológica y paraformaldehído (4%) con el fin de verificar la colocación Optrode y expresión opsina. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Una amplia gama de técnicas disponibles para la genética de metas de genes opsina microbianas a regiones discretas del cerebro en los roedores. La entrega de genes viral proporciona un enfoque relativamente barata y rápida para mediar ChR2 y NpHR expresión con especificidad de tipo celular. Sistemas de vectores de AAV son una opción común para uso en experimentos optogenetic debido a títulos altos de producción que permanecen estables durante el almacenamiento, su falta de patogenicidad, y su capacidad de producir la expresión génica a largo plazo 10. Muchas de las construcciones opsina con promotores específicos de células de tipo están comercialmente disponibles en una variedad de serotipos de AAV de instalaciones básicas de vectores, tales como la Universidad de Pennsylvania ( <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) o la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). Un inconveniente de la tecnología de AAV es lacapacidad limitada de embalaje (~ 4,7 kb), que impone una restricción en el tamaño de la casete del transgén que puede ser utilizado para la orientación específica de la célula. Como alternativa, los vectores lentivirales, que tienen una capacidad de envasado más grande, son capaces de acomodar opsina dirigidos bajo el control de secuencias promotoras más grandes. El uso de un Optrode permite la detección fiable de señales electrofisiológicas en combinación con la entrega de luz temporalmente-precisa. Como se describió anteriormente, sin embargo, es necesario tener cuidado suficiente en su construcción. Dado que la fibra óptica escindido es frágil, atar el hilo de sutura con demasiada fuerza puede hacer que la fibra se rompa. A pesar de que la Optrode se puede utilizar para realizar varias grabaciones, el electrodo y la fibra óptica se deben limpiar (o manualmente troceados en el caso de la extremo desnudo de la fibra óptica) antes de la inserción debido a que la impedancia del electrodo y la calidad de la luz entregada se degradará con el uso repetido. Durante elegrabaciones ctrophysiological es importante que el Optrode ser avanzado lentamente. El Optrode utilizado aquí tiene aproximadamente 350 micras de espesor (electrodo de tungsteno: 125 micras; núcleo de fibra óptica: 200 m) y el descenso rápido podría conducir a un movimiento de tejido cerebral. Artefactos inducidos por luz también se pueden considerar con especial registro y entrega de la luz reglajes 11-12. Aunque no se encontraron artefacto inducido por la luz en nuestra condición experimental, grabaciones fuera de la zona del cerebro transducidas potencialmente se pueden utilizar como un control para los artefactos de luz. Otra consideración durante el proceso de grabación es la intensidad de la luz necesaria para observar los cambios en las neuronas CHR2 o NpHR expresan, especialmente para largas grabaciones de duración. Intensidad del láser fuerte y la iluminación láser de largo podría resultar en el daño tisular y / o una disminución de la respuesta a la luz posterior entrega 12-13. Para la experimentación del comportamiento se requiere el uso de un vector viral de control para eliminating ningún efecto debido al calor emitido desde la fibra. Para muchas de las construcciones optogenetic disponibles comercialmente existen construcciones de control complementarios en los que se ha eliminado la secuencia del gen de la opsina. Cabe señalar que diseñado ChR2 variantes con propiedades mejoradas y la cinética se han desarrollado junto con otros opsinas de silenciamiento que pueden ser más adecuados para ciertos preguntas experimentales 14-15. Por ejemplo, una nueva variante ChR2 establecido a través de mutagénesis dirigida, denominada &quot;Cheta&quot;, puede conducir de alta fidelidad Rematar neuronal en las frecuencias (hasta al menos 200 Hz) por encima de la del original ChR2 14. La combinación de in vivo de suministro de luz y la grabación simultánea de las respuestas neuronales es un paso crítico en el establecimiento de relaciones de causalidad entre la actividad con dibujos en las poblaciones de células genéticamente específicos y eventos de comportamiento en el tiempo de bloqueo correspondientes. Los procedimientos y hardware descrito aquí proporciona un enfoque directo para la aplicación de la optogenética para Vivo grabaciones cabeza-fija en en roedores.

La capacidad de activar o silenciar un tipo celular específico dentro de un circuito neuronal de una manera temporal precisa es crítica para la comprensión de cómo los circuitos neuronales procesan diferentes tipos de información subyacentes emoción y la cognición. El control experimental sobre la actividad neural intacto ha empleado herramientas loss-/gain-of-function (por ejemplo, la estimulación eléctrica, la modulación farmacológica, lesión) que no proporcionan la necesaria selectivamente para controlar poblaciones específicas de neuronas, ya sea en una escala temporal o espacial. Dirigiéndose directamente estos retos tecnológicos, el desarrollo y la aplicación de herramientas sensibles a la luz genéticamente codificables ha permitido a los neurocientíficos para controlar la actividad eléctrica de selectos tipos de células durante los eventos de conducta bien definidos. Muchas de estas proteínas sensibles a la luz son de origen microbiano, con el canal de la luz-ción cerrada, canalrodopsina-2 (ChR2) 1, y la bomba de cloruro impulsada por la luz, halorhodopsin (NpHR) 2,3, de uso generalizado. Una ventaja importante de la optogenética es la capacidad de poblaciones específicas de células genéticamente-diana en regiones del cerebro heterogéneos y la técnica se ha aplicado con éxito a un número de organismos modelo (invertebrados a los primates no humanos) 4-6. Muchos animales transgénicos optogenetic se han generado y se encuentran disponibles comercialmente 7,8, sin embargo el establecimiento de líneas transgénicas pueden ser mano de obra intensiva y el costo prohibitivo. Aquí se describe un protocolo para la entrega mediada por virus-de los genes Chr2 y NpHR bajo el promotor CaMKIIα en la rata corteza prelimbic y subículo dorsal usando un virus adeno-asociado recombinante (AAV). Dentro del cerebro anterior, la expresión CaMKIIα es exclusiva de las neuronas piramidales glutamatérgicas 9. AAV se utiliza comúnmente para la investigación básica debido a su relativa facilidad de la producción y la falta de patogenicidad, así como la fuerte y Persila expresión del transgen stent que se ha conseguido con estos vectores 10. Además delineamos los pasos y hardware para la entrega de la luz y grabación simultánea en ratas cabeza-fijo anestesiados.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Métodos optogenética se han convertido en una herramienta poderosa para la aclaración de la actividad del circuito neural que subyace a un conjunto diverso de conductas a través de una amplia gama de especies. Herramientas optogenética de origen microbiano se componen de proteínas de la membrana sensible a la luz que son capaces de activar (por ejemplo, canalrodopsina-2, ChR2) o silencio (por ejemplo, halorhodopsina, NpHR) actividad neuronal tipos de células definidas ingenetically-en escalas de tiempo conductualmente relevantes. En primer lugar, demostramos un enfoque simple para la entrega mediada por virus adeno-asociado de Chr2 y NpHR los transgenes a la subículo dorsal y región prelimbic de la corteza prefrontal en la rata. Debido a ChR2 y NpHR son genéticamente objeto de orientación, se describe el uso de esta tecnología para controlar la actividad eléctrica de poblaciones específicas de neuronas (es decir, las neuronas piramidales) incrustados en el tejido heterogéneo con alta precisión temporal. Se describe en el presente documento el hardware, software a medidainterfaz de usuario y los procedimientos que permitan la entrega simultánea de luz y de registro eléctrico de las neuronas piramidales transducidas en un anestesiado en preparación vivo. Estas herramientas responde a la luz proporcionan la oportunidad para identificar las contribuciones causales de los diferentes tipos de células en el procesamiento de la información y la conducta.

La Figura 1 muestra una captura de pantalla del software a medida (NeuroLux Pro) desarrollado en el entorno de LabVIEW (National Instruments) utilizado para la grabación simultánea de la actividad neuronal y el control de los parámetros del pulso de luz (es decir, frecuencia del pulso, ancho de pulso, periodo de estimulación). El programa de software envía una señal de comando a un dispositivo de adquisición digital que genera pulsos TTL para el control sobre el láser de diodo único. Además, el programa muestra el software y tiendas de la actividad neuronal registrada y señales TTL entregados. Estas señales son digitalizadas a través del dispositivo de adquisición a una tasa de muestra definida (por ejemplo, 20 kHz). Señales grabadas se almacenan como una matriz de doble precisión de dos dimensiones en un archivo binario. La Figura 2 muestra el Optrode personalizado que consiste en un electrodo de tungsteno unido a una fibra óptica. Una fibra óptica se fija al electrodo usando hilo de sutura delgada en trespuntos. Si es necesario, pegamento se puede utilizar para adherir ellos. Sin embargo, evitar la fijación de la fibra óptica de forma permanente al electrodo porque aunque el electrodo puede ser reutilizado varias veces, la transmisión de luz a través de la fibra se degradará con el uso repetido y debe ser escindido y limpiado o reemplazado con cada inserción en el cerebro. Paneles izquierdo de la Figura 3 muestran imágenes fluorescentes de la proteína fluorescente de color amarillo, lo que indica una mayor real ChR2 y expresión NpHR. Estas fotografías muestran la expresión NpHR representante en subiculum dorsal de rata (Figura 3A) y la expresión en la corteza ChR2 prelimbic (Figura 3B). La expresión viral se restringió principalmente a la subículo dorsal y corteza prelimbic (por ejemplo, algunos de fluorescencia se observó en el giro dentado (Figura 3A, izquierda)). También se observaron las huellas de los electrodos (pista fina, punta de flecha) y fibra óptica (pista de espesor, flecha). la Figura 4 muestra que ChR2 inducida Rematar temporal preciso en rata corteza prelimbic. Figura 4A es un ejemplo de rastreo de los potenciales de acción activada-ChR2 en respuesta a 20 Hz entrega de 10 mseg pulsos de luz azul a la rata prelimbic corteza. Raster parcela (Figura 4 B) muestra la activación inducida por ChR2 en seis neuronas representativas. Todas las neuronas registradas mostraron clavar luz evocada con fidelidad perfecta. En contraste con ChR2, NpHR rápidamente y de manera reversible silenciada actividad espontánea in vivo en la corteza prelimbic de rata (panel de la derecha de la figura 4). Figura 4C es un ejemplo de rastreo que muestra que la iluminación continua 532 nm (10 s) de la corteza prelimbic expresar bajo el NpHR promotor CaMKllα elimina la actividad de una sola unidad espontánea in vivo. Tenga en cuenta que el silenciamiento completa de la actividad de células piramidales prelimbic es tiempo-bloqueado en el suministro de luz continua 10 seg. Bajoer raster parcela (Figura 4D) muestra silenciamiento inducido por NpHR en seis neuronas representativas. Ambas grabaciones en vivo son típicas que se obtienen a partir de ratas adultas Sprague-Dawley, en el que la entrega de AAV-mediada por los genes opsina microbianos produjo 18-21 días antes. La Figura 5 muestra el resultado de la estimulación repetida ChR2 de un piramidal neurona prelimbic rata. Pulso de luz azul (10 ms) se entregó a 20 Hz durante 5 seg (100 pulsos total). Trazas de tensión del spiking luz evocados fueron adquiridos repetidamente cada 2 minutos durante una sesión de grabación de 2 horas (61 repeticiones en total). Incluso cuando se utiliza este protocolo de estimulación repetitiva, ChR2 indujo clavar estable y robusto en respuesta a la administración de luz. Las figuras 6 y 7 muestran los resultados de la fotoinhibición inducida por NpHR y fotoactivación impulsado-ChR2 de rata actividad de la neurona subicular. Como es el caso en la corteza prelimbic, NpHR y ChR2 pudieronmediar en la inhibición y la activación de las neuronas subicular opsina transducidas con alta reproducibilidad del tiempo de salida al mar inducida por la luz. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Figura 1. Captura de pantalla de la interfaz del software Pro NeuroLux para la entrega simultánea de luz y el registro electrofisiológico. En la foto se muestra traza silenciamiento NpHR inducida de la actividad espontánea de la rata de células piramidales prelimbic en respuesta a 10 segundos del continuo suministro de luz 532 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> Figura 2. Imagen de alta potencia de Optrode personalizado. Una fibra óptica se inserta en el tubo capilar de vidrio unido a un electrodo de tungsteno y fija al electrodo usando hilo de sutura. La distancia de centro a centro de entreen la punta del electrodo y la punta de la fibra es de aproximadamente 500 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> Figura 3. La expresión viral y la colocación Optrode. (Izquierda) Las fotografías muestran la expresión NpHR representante en subiculum dorsal (A) y la expresión en la corteza ChR2 prelimbic (B). (Derecha) Esquema que representa la ubicación donde se tomó cada fotografía. La punta de flecha y la flecha en cada fotografía indican la ubicación del electrodo de tungsteno y de fibra óptica, respectivamente. SUB: subiculum, DG: giro dentado, PL:. Córtex prelimbic <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Figura 4. En vivo registros electrofisiológicos de ChR2 o transducidas-NpHR prelimb ratacorteza IC. (A) Ejemplo rastro de los potenciales de acción provocados-ChR2 en respuesta a 20 Hz entrega de azul (473 nm) de impulsos de luz (10 ms, azul de barras). (B) parcela Raster mostrando clavar inducida ChR2 en seis neuronas representativas. Cada unidad de actividad se representa como un punto. (C) Ejemplo rastro de supresión inducida por NpHR de la actividad espontánea en verde continuo (532 nm) de iluminación de luz (10 seg, barra de color verde). (D) parcela Raster mostrando silenciamiento inducido por NpHR en seis neuronas representativas. Cada actividad de la unidad se representa como un punto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> Figura 5. Rematar impulsado ChR2 repetitivo 20 Hz de una neurona piramidal prelimbic rata in vivo. (A) Tensión rastros del spiking luz evocadosadquirido en los puntos temporales 0, 30, 60, 90, 120 minutos después del comienzo de las grabaciones. (B) parcela Raster mostrando todas las 61 repeticiones (2 minutos de intervalo entre ensayos, 120 min en total) de la activación inducida por la luz. Cada actividad de la unidad se representa como un punto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Figura 6. En vivo registros electrofisiológicos de subiculum dorsal de rata transducidas-NpHR. (A) Ejemplo de rastreo mostrando que 10 seg continua iluminación 532 nm (barra verde) del subiculum dorsal expresar NpHR elimina la actividad espontánea. (B) Promedio de formas de onda de las dos unidades de grabado de la traza anterior. El umbral de amplitud se utiliza para la identificación de dos neuronas distintas. (C) parcela Raster muestra cinco repeticioness de silenciamiento inducido por NpHR de estas unidades. Cada unidad de actividad se representa como un punto. <img alt="La figura 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Figura 7. Repetitivo 20 Hz CR2 impulsada enriquecidas de una rata dorsal subicular neuronas in vivo. (A) Tensión rastros de luz-evocó la Rematar adquiridas en los puntos de tiempo 0, 30, 60, 90, 120 minutos después del inicio de las grabaciones. Recuadro: la actividad de ruptura típica de esta célula. (B) parcela Raster mostrando todas las 61 repeticiones (2 minutos de intervalo entre ensayos, 120 min en total) de la activación inducida por la luz. Cada actividad de la unidad se representa como un punto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

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A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada &quot;optogenética&quot;, permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

18.9K vistas.  University of Colorado Boulder.  El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada "optogenética", permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y ...

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Investigación

Neurociencias

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

En Vivo electrofisiológicos mediciones sobre los nervios ciáticos de ratones

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.

Método para la lesión de estiramiento de alta velocidad de humanos inducida por las neuronas derivadas de células madre pluripotentes en formato de 96 pocillos