Damos las gracias a la Dra. Julie K. Horton para la lectura crítica del manuscrito y el Dr. Rajendra Prasad por sus útiles sugerencias y discusiones. Parte de esta investigación fueron publicados originalmente en The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., &quot;Efectos de la secuencia de ADN del contexto de la actividad glicosilasa de ADN humano glucosilasa 8 oxoguanine.&quot; J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Esta obra fue financiada en su totalidad o en parte, por los Institutos Nacionales de Investigación en Salud Proyecto de Donación Z01-ES050158 en el Programa de Investigación Intramural, NIEHS.

1. Preparación de la enzima y el sustrato de ADN <ol><li> Over-express OGG1 como una proteína de fusión GST en E. coli, utilizan la etiqueta de GST para la purificación, y luego retire la etiqueta de GST por escisión con HRV-3C proteasa (Figura 1) 6. </li><li> Compre la síntesis química 5&#39;-6-carboxifluoresceína (6-FAM) oligonucleótido marcado que contiene un único residuo de 8-oxo G y su cadena de oligonucleótido no marcado complementaria. Los oligonucleótidos 34-mer contienen una 8-oxo G en la posición 17 desde el extremo 5 &#39;. Purificar estos oligonucleótidos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. </li><li> Preparar sustrato de ADN de doble cadena que contiene 8-oxo G mediante la mezcla de 5&#39;-6-FAM oligonucleótido marcado con su cadena complementaria a una relación molar de 1:1,2 en tampón de reasociación (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Colocar el tubo en un flotador en agua hirviendo durante 5 min. Deje el tubo en su lugar y luego dejar que el agua se enfríe lentamente a rtemperatura oom (esto toma aproximadamente 2 horas). </li><li> Realizar la preparación de muestras y el experimento en condiciones de baja o mínima de luz a fin de minimizar photobleaching de la etiqueta fluorescente. </li></ol> 2. Medición de golf Tiempo en estado estable y activo Titulación sitio de OGG1 2.1. Preparación de la muestra y el curso de tiempo de estado estacionario <ol><li> Preparar sustrato de ADN y OGG1 soluciones por separado en tampón de reacción (50 mM HEPES, pH 7,5, 20 mM KCl, 0,5 mM de EDTA, y 0,1% albúmina de suero bovino) en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo. La concentración de ADN es 400 nM y la concentración aparente de OGG1 es 30, 60, 90, o 120 nM tal como se determina mediante un ensayo de proteínas de Bradford. Coloque los tubos de reacción en un conjunto de bloque de calor a 37 ° C. Enzima pre-incubar y soluciones de sustrato de ADN por separado a 37 ° C durante 1 min. </li><li> Se inicia la reacción mediante la mezcla de volúmenes iguales de las soluciones de sustrato y OGG1 ADN mediante pipeteo. Después de mezclar estas solucionesciones 01:01 (v / v), las concentraciones finales son 200 nM de ADN y 15, 30, 45, o 60 nM OGG1, respectivamente. Retirar alícuotas (10 l) a intervalos de tiempo y enfriar rápidamente la reacción mediante la mezcla con 1 l de 1 M de NaOH. Como el control para los cursos de tiempo, 10 l de la mezcla de reacción sin enzima se mezcla con 1 l de 1 M de NaOH. </li><li> Colocar las muestras de reacción en un bloque de 90 ° C de calor durante 5 min para escindir el producto resultante AP-sitio. Después de calentar, añadir 1 l de HCl 1 M para neutralizar cada muestra. </li><li> Añadir un volumen igual (12 l) de tampón de carga de gel (95% formamida, 20 mM EDTA, 0,02% bromofenol y 0,02% xilenocianol) a cada muestra de reacción, y luego colocar la mezcla en un bloque térmico fijado en 95 ° C durante 2 min, a continuación, colocar inmediatamente el tubo en hielo. </li><li> Cargar las muestras (5 l) en un gel desnaturalizante de poliacrilamida 15% que contiene urea 8 M en 89 mM de Tris-HCl, pH 8,8, ácido bórico 89 mM y EDTA 2 mM. El sustrato y los productos escindidos se separaron bien después decorrer el gel. </li></ol> 2.2. Las imágenes del gel de <ol><li> Escanear el gel usando un generador de imágenes que puede detectar el ADN marcado con fluorescencia y visualizar el sustrato y las bandas de productos. </li><li> Cuantificar las bandas después de la proyección de imagen del gel. Tenga en cuenta que algunas división de fondo puede ser observada después del tratamiento del propio sustrato con NaOH (Figura 2A). Restar este fondo a partir de la cantidad medida de cada producto de reacción. </li></ol> 2.3. Análisis de los datos <ol><li> Trazar la cantidad de producto formado en cada tiempo de reacción (t) (Figura 2B). Analizar los datos en bruto utilizando la Ecuación 1 para determinar la amplitud de la ráfaga (un 0, el eje y) y la pendiente de la fase lineal de estado estacionario (V ss). </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" /><ol start="2"><li> Parcelael punto de intersección con respecto a la concentración de proteína total (es decir, concentración de la enzima aparente; Figura 2C), que proporciona una medida de la fracción activa de la enzima. Utilice un ajuste lineal con una ordenada cero para proporcionar el factor de corrección para la determinación de la fracción de enzima activa. </li><li> Trazar la tasa de estado estacionario con respecto a la concentración de la enzima activa (Figura 2D), que proporciona la constante de velocidad de disociación del producto (es decir, la pendiente de la línea ajustada). </li></ol> 3. Medición de golf Tiempo Pre-estado estacionario Como se muestra en la Figura 2, la formación de producto durante la fase de estallido es demasiado rápido para medir por mezcla manual y enfriamiento rápido. Por lo tanto, un instrumento de flujo de enfriamiento rápido puede proporcionar un poderoso método para medir reacciones rápidas que se producen en la escala de tiempo de un milisegundo (Figura 3) 5. El instrumento utiliza un motor de accionamiento controlado por ordenador para mezclar rápidamente unaND saciar reacciones después de tiempos de reacción especificados. Por ejemplo, utilizar un instrumento Quench-Flujo RQF-3 Rapid Kintek para medir la fase de estallido inicial y la subsiguiente fase de estado estacionario de la formación de producto catalizada por OGG1. Instrumentos de enfriamiento rápido de Flujo están disponibles de varios fabricantes. 3.1. Preparación de la muestra Por separado, preparar sustrato de ADN y OGG1 soluciones en tubos de 1,5 ml, como se describe en 2-1. Las concentraciones de ADN y OGG1 activos son 400 nM y 80 nM, respectivamente. Esto da lugar a concentraciones finales de 200 nM de ADN y 40 nM OGG1 activo después de la mezcla 01:01 (v / v). 3.2. Preparación de un rápido instrumento de flujo de enfriamiento rápido <ol><li> Conecte un baño de agua circulante en el instrumento de flujo de enfriamiento rápido para el control de la temperatura (37 ° C). </li><li> Ajuste los parámetros del instrumento y seleccione el circuito de reacción adecuada durante el tiempo deseado apunta según las instrucciones del fabricanteciones. Los bucles de reacción son de longitudes variables para proporcionar tiempos de reacción alternativos. </li><li> Prepare el buffer de reacción y NaOH saciar soluciones en 10 ml Luer Lock jeringas desechables y adjuntar estas jeringas a los puertos de unidad y cargar los depósitos de unidad con el tampón de reacción (jeringas B) y NaOH 142 mM (jeringa Q) (válvulas de carga de jeringa en posición de carga) . Para eliminar las burbujas de aire de la jeringa, funcionan de la solución de ida y vuelta varias veces. </li><li> Baje el motor paso a paso hasta que haga contacto con la parte superior de las jeringas (válvulas de carga de jeringa y válvulas de carga de muestra en posición de fuego). </li><li> Lave los bucles de muestra, el circuito de reacción, y la línea de salida con agua y metanol. Seque las áreas enrojecidas por completo (válvulas en posición FLUSH). </li></ol> 3.3. Evolución en el tiempo de pre-estado de equilibrio <ol><li> Hacer un agujero en la parte superior de un tubo de 1,5 ml con tapa usando una aguja de calibre 16. Conecte un tubo en la línea de salida para recoger la reacción apagada. </li><li> Ajuste el reactio deseadan tiempo (en segundos) con el teclado. El motor paso a paso se copia de seguridad para ajustar el volumen de bucle con el fin de mantener el volumen de enfriamiento constante. Posición émbolos de la jeringa B contra la plataforma del motor paso a paso mediante la adición de tampón con las jeringas desechables conectados a los puertos de unidad. </li><li> Llene 1 ml Luer Lock jeringas desechables con sustrato de ADN y OGG1 soluciones, respectivamente (válvulas de muestra en la posición de carga). Coloque las jeringas con el sustrato de ADN y OGG1 soluciones a cada uno de los puertos de carga de muestra, y luego llenar los Loops de muestra con un sustrato de ADN y OGG1 soluciones, respectivamente (válvulas de carga de muestra en la posición de carga). </li><li> Ajuste todas las válvulas de carga de jeringa y válvulas de carga de muestra en la posición de FUEGO. Se inicia la reacción por un golpe teclado (por ejemplo, pulsar la tecla &quot;START&quot;, &quot;G&quot; o). Sustrato de ADN y OGG1 soluciones (18 l cada uno) se mezclan inmediatamente en el circuito de reacción. </li><li> Esperar hasta que la reacción se apaga automáticamente en el tiempo de reacción deseado mediante la mezcla de 36 l de la rmezcla eaction con 86 l de NaOH 142 mM. Después de inactivar la reacción, la muestra se descarga desde la línea de salida. </li><li> Ajuste las válvulas de carga de jeringa a la posición de la carga y las válvulas de carga de muestra en la posición de descarga. Lave los bucles de muestra, el circuito de reacción, y la línea de salida con agua y metanol y secar como se describe en 3.2. Repita el procedimiento anterior para cada momento. </li><li> Realizar un experimento de control sin enzima para determinar una corrección de fondo, lo que puede hacerse manualmente o con el instrumento rápido enfriamiento rápido. Para realizar un control con el instrumento de rápido enfriamiento, llene el Loop de muestra de ADN con ADN sustrato pero mantener el lazo de la muestra para OGG1 vacía. Configurar el tiempo de reacción, realizar la mezcla y enfriamiento según se describe en 3.3.4-3.3.6. </li><li> Lavar los bucles de muestra y del circuito de reacción con NaOH 2 M, HCl 2 M, agua y metanol y luego secar las líneas lavadas. Después de ajustar el motor paso a paso a la posición inicial, cambie las válvulas de carga de jeringa a la positio CARGAn y lavar los depósitos de accionamiento con agua. </li><li> Tratar las muestras inactivadas de reacción con calor, y luego sustrato separado y ADN producto por 15% de desnaturalización de electroforesis en gel de poliacrilamida como se describe en 2.1. </li><li> Visualizar y cuantificar las bandas en el gel como se describe en 2.2. </li></ol> 3.4. Análisis de los datos Montar los cursos de tiempo de la formación de producto por análisis de regresión no lineal a una ecuación con un aumento de los términos exponenciales y lineal (Ecuación 2) que proporcionan la velocidad de primer orden constante (k obs), la amplitud de la ráfaga (A 0), y una velocidad lineal (v ss). <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" /> 4. Lapso de tiempo de un solo volumen <ol><li> Preparar sustrato de ADN y OGG1 en tubos separados de 1,5 ml como se describe en 2-1. La concentraciónciones de ADN y OGG1 activos son 100 nM y 500 nM, respectivamente; esto produce una concentración final de 50 nM de ADN y 250 nM OGG1 después de la mezcla 01:01 (v / v). </li><li> Preparar el rápido instrumento de flujo de enfriamiento rápido y preparar las muestras de la reacción como se describe en 3.2 y 3.3. </li><li> Tratar las muestras de reacción se inactivó con calor y someterlas a 15% electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida al sustrato y de los productos por separado como se describe en 2.1. </li><li> Visualizar y cuantificar las bandas en el gel como se describe en 2.2. </li><li> Montar los cursos de tiempo de la formación de producto a un solo exponencial para determinar la constante de velocidad de primer orden (k obs) como se indica en la Ecuación 3. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" />

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K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1:+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases.">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li><li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease.">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li></ol>

Los autores tienen nada que revelar.

Los enfoques cinéticos descritos aquí perfilar métodos para definir las constantes cinéticas primarias. Si un curso de tiempo de formación de producto es bifásica, con la primera rotación enzimática ocurre rápidamente, a continuación, un paso después de la química es limitante de la velocidad durante pérdidas de balón catalíticos subsiguientes. En el caso de OGG1, la primera rotación se puede medir utilizando altas concentraciones de enzimas, ya sea con la limitación (S &lt;E) o alta (S&gt; E) las conce...

Un ambiente aeróbico acelera la inestabilidad genómica. Una importante lesión del ADN promutagenic resultante de estrés oxidativo es 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxo G). Esto es debido al potencial de codificación ambigua de 8-oxo G. Human 8-oxoguanine DNA glicosilasa (OGG1) es responsable de iniciar la base de reparación por escisión de 8-oxo G. La actividad glicosilasa de OGG1 extirpa la base 8-oxo G resulta en ADN producto con un sitio apurinic (AP-site). Una actividad liasa débil OGG1 puede incidir la AP-site en algunos casos. La caracterización cinética de ADN glycosylases general encuentra que exhiben cursos de tiempo bifásicos. Después de una fase rápida inicial de la formación de producto (es decir ráfaga), una fase de estado estacionario lineal se observó 1-3. Este comportamiento es indicativo de un paso después de la química (es decir, el cambio conformacional o liberación del producto) siendo limitante de la velocidad durante la parte lineal del curso del tiempo, mientras que la fresaª fase, conocida como la fase transitoria a menudo, corresponde a la formación de producto en el sitio activo de la enzima durante el primer ciclo de la reacción. Cuando liberación del producto es limitante de la velocidad durante la fase de estado estacionario, las mediciones de actividad proporcionan una medida cualitativa del producto afinidad de unión de ADN, pero no proporcionan información cinética relativa a eventos en el sitio activo de la enzima (es decir, química). En consecuencia, se necesitan métodos para aislar y medir la fase de explosión pre-estado estacionario exponencial para investigar los acontecimientos durante la primera rotación enzimática en el sitio activo de la enzima 4. Hay tres métodos cinéticos estándar para caracterizar el comportamiento catalítico de OGG1, (1) en estado estacionario, (2) pre-estado de equilibrio, y (3) un solo volumen. Estos enfoques se diferencian entre sí por la concentración de enzima en la mezcla de reacción y la relación de enzima a sustrato utilizado en cada enfoque. En un enfoque típico de estado estacionario,a veces referido como múltiples cinética de volumen de negocios, bajas concentraciones de enzima se utilizan para seguir la formación de producto. La concentración de sustrato excede en gran medida la concentración de la enzima de manera que múltiples pérdidas de balón enzimáticas no afectan significativamente a la concentración de sustrato. En esta situación, los cursos de tiempo debe ser lineal y es a menudo difícil de discernir si un estallido se produjo durante la primera rotación debido a la baja concentración de la enzima utilizada en este enfoque; tenga en cuenta que la amplitud de ráfaga es equivalente a la concentración de la enzima. Esto se puede superar mediante el uso de una mayor concentración de la enzima y la extrapolación de la evolución en el tiempo lineal a tiempo cero para detectar si la primera rotación enzimática ocurrió rápidamente. La intersección con el eje de ordenadas (eje y) debe ser proporcional a la concentración de enzima y proporciona una medida de la enzima participa activamente con el sustrato. Aunque este enfoque puede, en principio, proporcionar evidencia de la existencia de una fase de estallido, un DIFSe requiere enfoque rente para medir la cinética de la fase de estallido. En muchos casos, la fase de estallido es demasiado rápido para medir por técnicas de mezcla y enfriamiento rápido manuales. En esta situación, antes de la cinética de estado estacionario y de un solo volumen de negocios (es decir, cinética transitoria) se acerca a menudo requieren un instrumento rápido de mezcla y enfriamiento rápido para seguir los puntos de tiempo tempranos de una reacción 5. En un enfoque de pre-estado estacionario se utilizan altas concentraciones de enzima de manera que se forma una cantidad significativa de producto durante la primera rotación. Desde múltiples pérdidas de balón son seguidos para observar bicicleta catalítica (es decir, la fase lineal que sigue a la ráfaga), la concentración de sustrato es mayor que la concentración de la enzima ([enzima] &lt;[sustrato]). Para aislar los eventos en el sitio activo de la enzima sin bicicleta catalítica, se utilizan condiciones de un solo volumen de negocios. En este caso, el sustrato está saturado con la enzima (E &gt;&gt; S) de modo que todo el sustrato participarán in el volumen de negocios único &quot;y normalmente muestran una evolución en el tiempo de un solo exponencial. Como se ha señalado anteriormente para las enzimas que exhiben una fase de estallido, liberación del producto (k fuera) a menudo limita la tasa de la fase de estado estacionario de la evolución en el tiempo. La tasa de liberación del producto (v ss, conc. / Tiempo) se puede determinar a partir de la pendiente de la fase de estado estacionario lineal. Es necesaria la concentración de enzima activa (E) para convertir la tasa de liberación del producto a una constante de velocidad intrínseca donde k off = v ss / [E]. Es importante destacar que la concentración de la enzima activa es típicamente más bajo que la concentración medida de proteína debido a las impurezas, enzima inactiva, enzima no productiva obligado a sustrato, y el método utilizado para determinar la concentración de proteína. La concentración de enzima activa puede determinarse a partir de la amplitud de la ráfaga cuando la liberación del producto es lento. Por lo tanto, la extrapolación de un curso de tiempo de estado estacionario atiempo cero proporciona una estimación de la enzima activa necesaria para calcular k fuera (liberación de producto) de la tasa de estado estacionario observada. Para medir la cinética de la explosión, un enfoque pre-estado de equilibrio, es necesario seguir la formación de producto durante la primera rotación que se produce antes de la fase de estado estacionario lineal. La cinética de ráfaga sigue la formación de enzima-producto intermedio. Una vez que la reacción se inicia por la enzima de mezclado con el sustrato, la cantidad de la enzima-producto aumenta rápidamente hasta que la reacción alcanza una fase de estado estacionario. Si la catálisis es mucho más rápida que la versión del producto, la amplitud de la ráfaga es igual a enzima participa activamente y el enfoque exponencial observada al equilibrio (k obs) corresponde a la tasa de conversión química del sustrato a producto, suponiendo que la velocidad inversa de química es insignificante. En algunos casos CY catalíticaaferrarse interfiere con un análisis previo de estado estacionario, por ejemplo, cuando la magnitud de las tasas para la química y la liberación de productos no son significativamente diferentes. En este caso, el empleo de exceso de enzima con respecto al sustrato evita ciclo catalítico y el sustrato límites unido con la enzima a una sola rotación. En consecuencia, la primera etapa química de la reacción se puede aislar y determinar con precisión como la constante de velocidad de primer orden (k obs). Esta constante de velocidad debe ser similar a k obs determinado a partir del enfoque de pre-estado de equilibrio se ha descrito anteriormente. Aquí se describe cómo estos enfoques cinéticos pueden ser utilizados para analizar la actividad glicosilasa de OGG1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

Humano 8-oxoguanina ADN glicosilasa (OGG1) escinde el mutagénico oxidativo lesión del ADN 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxo G) a partir de ADN. La caracterización cinética de OGG1 se llevó a cabo para medir las tasas de escisión 8-oxo G y la versión del producto. Cuando la concentración es más baja que OGG1 sustrato de ADN, la evolución temporal de la formación de producto son bifásicos; una fase exponencial rápida (es decir ráfaga) de formación de producto es seguida por una fase de estado estacionario lineal. El estallido inicial de la formación de producto corresponde a la concentración de enzima debidamente enganchado sobre el sustrato, y la amplitud de la ráfaga depende de la concentración de enzima. La constante de la ráfaga de velocidad de primer orden corresponde a la frecuencia intrínseca de la escisión 8-oxo G y la tasa de estado estacionario más lenta mide la tasa de liberación del producto (producto de ADN de disociación constante de velocidad, k fuera). A continuación, se describen los enfoques de estado estacionario, pre-estado de equilibrio, y de un solo volumen para aislar y medir sppasos ecific durante OGG1 ciclo catalítico. Un oligonucleótido marcado con fluorescente lesión que contiene y OGG1 purificados se utilizan para facilitar mediciones cinéticas exactas. Dado que las concentraciones bajas de enzimas se utilizan para realizar mediciones en estado estacionario, la mezcla manual de los reactivos y el temple de la reacción se puede realizar para determinar la tasa de estado estacionario (k fuera). Además, la extrapolación de la tasa de estado estacionario a un punto en el eje de ordenadas en el tiempo cero indica que un estallido de formación de producto se produjo durante el primer volumen de negocios (es decir, intersección y es positivo). La constante de la fase de estallido exponencial de velocidad de primer orden se puede medir usando una técnica de mezcla y enfriamiento rápido que examina la cantidad de producto formado a intervalos de tiempo cortos (&lt;1 seg) antes de la fase de estado estacionario y corresponde a la tasa de 8 -oxo G escisión (es decir, química). El paso química también se puede medir usando un enfoque de un solo volumen de negocios donde el ciclismo es catalíticaimpedido por el ADN sustrato saturando con la enzima (E&gt; S). Estos enfoques pueden medir constantes de velocidad elementales que influyen en la eficacia de la eliminación de una lesión del ADN.

Análisis de la cinética de estado estable se realizó mediante el uso de 200 nM sustrato de ADN y cuatro diferentes concentraciones aparentes de OGG1 (15, 30, 45, y 60 nM) como se determinó por un ensayo de proteínas Bradford 2. Los cursos de tiempo de formación de producto se ajustaron a una ecuación lineal para determinar la ordenada en el origen, que fueron 2,2, 11, 15, y 26 nM, respectivamente, en relación a cada concentración de proteína (Figura 2B). Las intersecciones se repres...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Tiempo de cursos para la actividad glicosilasa de 8-oxoguanina ADN glicosilasa son bifásicos exhibiendo una explosión de la formación de producto y una fase de estado estacionario lineal. La utilización de técnicas de flujo de enfriamiento rápido, la ráfaga y las tasas de estado estable se pueden medir, que corresponden a la escisión de 8-oxoguanina y la liberación de la glicosilasa a partir del ADN del producto, respectivamente.

Medición cinética de estado estable, Pre-estado de equilibrio, y un solo volumen de negocios de ADN glicosilasa Actividad

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

19.2K vistas.  NIEHS, National Institutes of Health. Tiempo de cursos para la actividad glicosilasa de 8-oxoguanina ADN glicosilasa son bifásicos exhibiendo una explosión de la formación de producto y una fase de estado estacionario lineal. La utilización de técnicas de flujo de enfriamiento rápido, la ráfaga y las tasas de estado estable se pueden medir, que corresponden a la escisión de 8-oxoguanina y la liberación de la glicosilasa a partir del ADN del producto, respectivamente.

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HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&amp;#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

HPLC Medición de la oxidación del ADN de biomarcadores, 8-oxo-7,8-dihidro-2 &#39;desoxiguanosina, en células cultivadas y tejidos animales

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Investigación

Química

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Preparación de Mica y Silicon Sustratos para el Análisis de Origami ADN y Experimentación

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel &#945;-diimine ethylene polymerization catalyst. Initial polymerizations with the catalyst lead to optimized reaction conditions, including catalyst concentration, ethylene pressure and reaction time. Using gas-uptake data for these reactions, a procedure to calculate the initial rate of propagation (kp) is presented. Using the optimized conditions, the ability of the nickel &#945;-diimine polymerization catalyst to undergo chain transfer with diethylzinc (ZnEt2) during ethylene polymerization was investigated. A procedure to assess the ability of the catalyst to undergo chain transfer (from molecular weight and 13C NMR data), calculate the degree of chain transfer, and calculate chain transfer rates (ke) is presented.

A protocol for the high-throughput analysis of polymerization catalyst, chain transfer polymerizations, polyethylene characterization, and reaction kinetic analysis is presented.

Las polimerizaciones de etileno utilizando reactores de presión paralelas y un análisis cinético de la cadena de transferencia de polimerización

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

Fabricación y pruebas de termómetros fotónicos

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

Medición simultánea de HDAC1 y HDAC6 actividad en HeLa células usando UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Desenredar las fibras de aramida de copolímero de alta resistencia para permitir la determinación de sus propiedades mecánicas

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Aspecto técnico de la síntesis automatizada y evaluación cinética en tiempo real de [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

Ensayos de actividad basados en RMN para determinar la inhibición compuesta, valores IC50, actividad artifefectiva y actividad de células enteras de ribohidrolasas de nucleósidos

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and chemical research. To meet the demand for high-performance microreactors, we developed a femtoliter droplet array (FemDA) device and exemplified its application in massively parallel cell-free protein synthesis (CFPS) reactions. Over one million uniform droplets were readily generated within a finger-sized area using a two-step oil-sealing protocol. Every droplet was anchored in a femtoliter microchamber composed of a hydrophilic bottom and a hydrophobic sidewall. The hybrid hydrophilic-in-hydrophobic structure and the dedicated sealing oils and surfactants are crucial for stably retaining the femtoliter aqueous solution in the femtoliter space without evaporation loss. The femtoliter configuration and the simple structure of the FemDA device allowed minimal reagent consumption. The uniform dimension of the droplet reactors made large-scale quantitative and time-course measurements convincing and reliable. The FemDA technology correlated the protein yield of the CFPS reaction with the number of DNA molecules in each droplet. We streamlined the procedures about the microfabrication of the device, the formation of the femtoliter droplets, and the acquisition and analysis of the microscopic image data. The detailed protocol with the optimized low running cost makes the FemDA technology accessible to everyone who has standard cleanroom facilities and a conventional fluorescence microscope in their own place.

The overall goal of the protocol is to prepare over one million ordered, uniform, stable, and biocompatible femtoliter droplets on a 1 cm2 planar substrate that can be used for cell-free protein synthesis.

Un arreglo de gotas Femtoliter para la síntesis masiva de proteínas paralelas a partir de moléculas de ADN únicas

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Quantitative Atomic-Site Analysis of Functional Dopants/Point Defects in Crystalline Materials by Electron-Channeling-Enhanced Microanalysis

A novel elemental and chemical analysis scheme based on electron-channeling phenomena in crystalline materials is introduced, where the incident high-energy electron beam is rocked with the submicrometric pivot point fixed on a specimen. This method enables us to quantitatively derive the site occupancies and site-dependent chemical information of impurities or intentionally doped functional elements in a specimen, using energy-dispersive X-ray spectroscopy and electron energy-loss spectroscopy attached to a scanning transmission electron microscope, which is of significant interest to current materials science, particularly related to nanotechnologies. This scheme is applicable to any combination of elements even when the conventional Rietveld analysis by X-ray or neutron diffraction occasionally fails to provide the desired results because of limited sample sizes and close scattering factors of neighboring elements in the periodic table. In this methodological article, we demonstrate the basic experimental procedure and analysis method of the present beam-rocking microanalysis.

We provide a general outline of quantitative microanalysis methods for estimating the site occupancies of impurities and their chemical states by taking advantage of electron-channeling phenomena under incident electron beam-rocking conditions, which reliably extract information from minority species, light elements, oxygen vacancies, and other point/line/planar defects.

Análisis Cuantitativo Del Sitio Atómico De Los Dopantes Funcionales / Defectos Puntuales En Materiales Cristalinos Por Microanálisis Mejorado Por Canalización De Electrones-Mejorado