Agradecemos a las personas que han donado sus cuerpos para el avance de la educación y la investigación. Estamos agradecidos a la Fundación OneLegacy, que formó la base para obtener corazones de donantes para la investigación. También agradecemos a Anthony A. Smithson y Arvin Roque-Verdeflor del Centro de Investigación Traslacional de Imágenes (Departamento de Radiología) de UCLA por su apoyo en la adquisición de datos de TC. Este proyecto fue apoyado por el Proyecto Amara Yad de UCLA. Agradecemos a los doctores Kalyanam Shivkumar y Olujimi A. Ajijola por establecer y mantener una línea de investigación sobre el corazón humano. Agradecemos a nuestra Gerente de Operaciones de Investigación, Amiksha S. Gandhi, por su dedicación para apoyar nuestros proyectos. Este trabajo fue posible gracias al apoyo de las subvenciones de los NIH OT2OD023848 y P01 HL164311 y la subvención Leducq 23CVD04 a Kalyanam Shivkumar, el Premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana del Corazón 23CDA1039446 a PH y el Proyecto Amara-Yad de UCLA (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project). El escáner microPET/CT GNEXT utilizado en este estudio fue financiado por una subvención de Instrumentación Compartida para Investigación Animal de los NIH (1 S10 OD026917-01A1).

Este estudio utilizó muestras de tejido no identificadas recolectadas de corazones humanos de donantes no fallantes y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA). Se obtuvieron muestras de corazones no defectuosos que fueron rechazados para trasplante. Los corazones se perfundieron a presión, se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4% y se tomaron imágenes antes del procesamiento de tejidos según los siguientes métodos. En la Figura 1 se resume el diagrama de flujo del orden del estudio. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Examen a microescala
<ol><li>Limpieza de tejidos mediante el protocolo de imágenes 3D de órganos aclarados con disolvente (iDISCO+) habilitado para inmunomarcaje modificado.<ol><li>Diseccionar el tejido fijado con PFA al 4% con un bisturí para que quepa dentro de la cámara de 3 mm × 16 mm × 25 mm para microscopía confocal. Para obtener imágenes de tejidos más gruesos, se pueden apilar cámaras y/o espaciadores adicionales en el portaobjetos.</li>
		<li>Deshidrate las muestras utilizando series de metanol (MeOH) graduadas (20%, 40%, 60%, 80% y 100% de MeOH en H2O desionizado [vol/vol]) durante 1 h cada una a temperatura ambiente (RT) con agitación.</li>
		<li>Lavar con MeOH al 100% durante 1 h en RT y sumergir en 66% de diclorometano/33% de MeOH en RT con agitación durante la noche.</li>
		<li>Al día siguiente, lavar dos veces en MeOH (100%) durante 1 h a RT, enfriar a 4 °C y tratar con 5% H2O2 en MeOH (vol/vol) durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Rehidratar con la serie de MeOH graduada (80%, 60%, 40% y 20% de MeOH) y lavar en 0,01 mol/L de PBS durante 1 h cada uno a RT con agitación.</li>
		<li>Lavar los pañuelos dos veces en 0,01 mol/L PBS con Triton X-100 al 0,2% durante 1 h en RT.</li>
		<li>Prepárese para el inmunomarcaje permeabilizando en PBS 0,01 mol/L, 20 % de dimetilsulfóxido (DMSO), Triton X-100 al 0,2 % y glicina 0,3 mol/L durante 2 días a 37 °C con agitación.</li>
		<li>Bloquear en 0,01 mol/L de PBS con 10% de DMSO, 0,2% de Triton X-100 y 5% de suero de burro normal durante otros 2 días a 37 °C con agitación.</li>
		<li>Marcaje con un anticuerpo primario compatible con MeOH conjugado con fluoróforos diluidos en PBS de 0,01 mol/L con 10 mg/ml de heparina (PTwH), 0,2% de Tween-20, 5% de DMSO y 3% de suero de burro normal durante 3-4 días a 37 °C con agitación.</li>
		<li>Reponer la solución de anticuerpos e incubar durante otros 3-4 días a 37 °C con agitación.</li>
		<li>Después de 1 semana de incubación en solución primaria de anticuerpos, lavar de 4 a 5 veces en PTwH durante la noche en RT.</li>
		<li>Incubar con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos diluidos en PTwH, suero de burro normal al 3% durante 3 días a 37 °C con agitación.</li>
		<li>Reponer la solución de anticuerpos secundarios, incubar durante otros 3 días a 37 °C con agitación.</li>
		<li>Después de 6 días de incubación en una solución secundaria de anticuerpos, lavar en PTwH 4-5 veces durante la noche a temperatura preparada.</li>
		<li>Deshidrate con una serie graduada de MeOH (20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 % y 100 % de MeOH). La muestra puede almacenarse durante la noche en RT.</li>
		<li>Incubar en 66% de diclorometano/33% de MeOH durante 3 h en RT con agitación.</li>
		<li>Lavar dos veces en diclorometano al 100% durante 15 min a RT con agitación.</li>
		<li>Incubar y almacenar muestras en éter bencílico. Llene el tubo para minimizar la oxidación del aire de la muestra.</li>
	</ol></li>
	<li>Obtención de imágenes de muestras de tejido aclaradas<ol><li>Coloque una cámara que contenga adhesivo en un portaobjetos y aplique esmalte de uñas alrededor del perímetro de la cámara. Para tejidos más gruesos, se pueden apilar cámaras y/o espaciadores adicionales en el portaobjetos.</li>
		<li>Coloque el pañuelo aclarado en la cámara, llénelo con éter bencílico y aplique un cubreobjetos.</li>
		<li>Aplica esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos para crear un sello.</li>
		<li>Obtenga imágenes de escaneo en mosaico y pila Z utilizando un microscopio confocal de escaneo láser vertical con una lente de 5x o 10x para obtener imágenes a una profundidad de hasta la distancia de trabajo de la lente.</li>
		<li>Imagen a una resolución de 1024 x 1024 utilizando líneas láser apropiadas para los espectros de emisión de los fluoróforos utilizados. La autofluorescencia muscular es visible utilizando la línea láser de 488 nm.</li>
		<li>Asegúrese de que el tamaño del paso del eje z sea proporcional al muestreo de Nyquist basado en la apertura numérica del objetivo11 especificado.</li>
		<li>Cose imágenes y utilice software para la visualización en 3D.</li>
		<li>Cree figuras utilizando imágenes de proyección de máxima intensidad (MIP) de pilas Z para canales individuales y combinados (Figura 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Inmunohistoquímica NOTA: Después de que el tejido se incluye en parafina22, se utiliza el siguiente procedimiento para crear portaobjetos para el estudio inmunohistoquímico.<ol><li>Preparación de la solución de adaptación del índice de refracción (RIMS).<ol><li>Prepare tampón de fosfato 0,1 mol/L añadiendo 10,9 g deNa2HPO4 (anhidro) y 3,1 g deNaH2PO4 (monohidrato) alH2O desionizado hasta un volumen total de 1 L (pH 7,4). Filtre-esterilice la solución y guárdela en RT.</li>
			<li>Diluir el tampón de fosfato a 0,02 mol/L.</li>
			<li>Disuelva Histodenz en 30 mL de tampón de fosfato de 0,02 mol/L agitando la solución durante 10 min con una barra de agitación magnética en la botella de almacenamiento final que pueda sellarse para minimizar la evaporación y la contaminación.</li>
			<li>Añadir azida sódica hasta una concentración total de 0,01% (p/v) y ajustar el pH a 7,5 con NaOH.</li>
			<li>Ajustar el IR variando la concentración final de Histodenz.</li>
			<li>Guarde el RIMS en RT durante meses. Deséchelo si se observa contaminación microbiana. NOTA: NO autoclave ninguna solución que contenga azida de sodio.</li>
		</ol></li>
		<li>Preparación de portaobjetos para estudio inmunohistoquímico<ol><li>Cree secciones de 5 μm de espesor con micrótomo. Aplique la sección de pañuelo a los portaobjetos cargados.</li>
			<li>Retire la parafina incubando los portaobjetos en >75% de xileno durante 10 min. Mueva los portaobjetos a un segundo recipiente con xileno durante 10 minutos más.</li>
			<li>Elimine el xileno sumergiendo los portaobjetos en EtOH al 100 % durante 10 minutos, luego en EtOH al 95 % durante 5 minutos y EtOH al 70 % durante 5 minutos.</li>
			<li>Enjuague los portaobjetos con H2O desionizado durante 5 min.</li>
			<li>Sumerja los portaobjetos en el tampón de recuperación de antígenos durante 25 minutos a 90-95 °C.</li>
			<li>Deje que el recipiente se enfríe a RT durante 1 h con agitación.</li>
			<li>Sumerja los portaobjetos en un tampón de remojo (0,01 mol/L PBS + 0,4% Triton X-100) durante 30 min a 4 °C.</li>
			<li>Rodee el pañuelo con una pluma PAP. Agregue PBS a cada portaobjetos y colóquelo en una cámara humidificada para evitar la desecación.</li>
			<li>Lavar los portaobjetos con PBS en RT con agitación durante 5 min.</li>
			<li>Bloquear con tampón de bloqueo (0,01 mol/L PBS + 10% Donkey Serum + 0,1% TX-100) durante 1 h con agitación.</li>
			<li>Incubar con un anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C.</li>
			<li>Al día siguiente, deje que los portaobjetos se calienten a RT durante 15 minutos.</li>
			<li>Lave los portaobjetos 3 veces con 0,01 mol/L de PBS + 0,2% de TritonX-100 durante 5 min.</li>
			<li>Incubar con un anticuerpo secundario diluido en tampón de bloqueo durante 1 h a RT con agitación.</li>
			<li>Lave los portaobjetos 3 veces con 0,01 mol/L de PBS + 0,2% de TritonX-100 durante 5 min.</li>
			<li>Lave los portaobjetos 3 veces con 0,01 mol/L de PBS durante 5 min.</li>
			<li>Coloque 1 gota de RIMS con un gotero y aplique un cubreobjetos.</li>
			<li>Aplica esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos para crear el sello.</li>
			<li>Como control negativo, se debe analizar una muestra sin el anticuerpo primario para demostrar la ausencia de tinción específica.</li>
		</ol></li>
		<li>Obtención de imágenes de portaobjetos inmunoteñidos<ol><li>Visualice los portaobjetos con un microscopio confocal de barrido láser con lentes de objetivo de 10x, 20x y 40x.</li>
			<li>Imagen a una resolución de 1024 x 1024 utilizando líneas láser apropiadas para los espectros de emisión de los anticuerpos secundarios utilizados.</li>
			<li>Cree figuras utilizando imágenes de proyección de máxima intensidad (MIP) de pilas Z para canales individuales y combinados (Figura 3).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Examen de mesoescala
<ol><li>Disección estereoscópica<ol><li>Realice disecciones delicadas enfocándose en estructuras diminutas o delgadas, como el nódulo auriculoventricular, la arteria del nódulo auriculoventricular y el plexo nervioso cardíaco (escala submilimétrica a milímetros) con una lámpara de escritorio de aumento con pinza, telescopios quirúrgicos o microscopio estereoscópico.</li>
	</ol></li>
	<li>Micro-TC NOTA: La tomografía computarizada se realiza después de la perfusión a presión y la fijación y en cualquier etapa de la disección utilizando un escáner de tomografía por emisión de micropositrones (PET)/TC (Figura 4).<ol><li>Calentar la fuente de rayos X por TC durante 25 minutos antes de la toma de imágenes.</li>
		<li>Coloque la muestra de corazón en la base del escáner.</li>
		<li>Mueva la cama del escáner a una posición horizontal de 544 mm y una posición vertical de 14 mm para centrar el corazón en el campo de visión (FOV) de la TC.</li>
		<li>Adquiera imágenes de TC a 80 kVp, 150 μA, con 720 proyecciones durante un tiempo de exploración de 1 minuto a una resolución espacial de 200 μm.</li>
		<li>Reconstruya los datos de TC con un campo de visión de 12 cm x 12 cm x 10 cm y una matriz de vóxeles de 600 x 600 x 500, y guárdelos como un archivo DICOM.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Examen a macroescala
<ol><li>Perfusión y fijación a presión NOTA: Los autores modifican las técnicas de perfusión y fijación a presión previamente descritas y las aplican a los corazones humanos no fallantes rechazados para trasplante 14,19,20,21.<ol><li>Utilice bombas de alto caudal para la fijación de la perfusión. Use etanol14 al 100 %, PFA al 4 % o formalina al 10 % para el fijador. NOTA: El corazón se recupera con la aorta ascendente, el tronco pulmonar y las venas cavas y pulmonares resecados lo más distalmente posible y se administran en la solución23 de la Universidad de Wisconsin.</li>
		<li>Utilice dos cánulas quirúrgicas de 20-24 Fr para la perfusión cardíaca derecha e izquierda. Para la perfusión del corazón derecho, canula la vena cava superior y coloque un respiradero en el tronco pulmonar o la arteria pulmonar con jeringas de plástico de 12 a 30 ml de tamaño medio cortado con puntas Luer-Lock conectadas a llaves de paso de tres vías.</li>
		<li>Ocluya la vena cava inferior y la otra arteria pulmonar con un cordón después de colocar una jeringa de plástico medio cortada con llave de tamaño adecuado o un tubo centrífugo de 1,5-5,0 ml.<ol><li>Para la perfusión anterógrada del corazón izquierdo, canula una de las venas pulmonares y coloque un orificio de ventilación en el extremo distal de la aorta con las jeringas de plástico de 12-30 ml de tamaño medio cortado con puntas Luer-Lock conectadas a llaves de paso de tres vías.</li>
			<li>Para la perfusión retrógrada del corazón izquierdo, canula una de las ramas del arco aórtico y coloca un respiradero en otra rama del arco aórtico. Coloque las puntas de las cánulas en ambos ventrículos.</li>
		</ol></li>
		<li>Ocluya los orificios de otros vasos con cordel después de insertar una jeringa de plástico medio cortada cerrada de tamaño adecuado o un tubo de microcentrífuga de 1,5-5,0 ml. Use una gasa delgada para cubrir la parte de inserción de las jeringas/tubos/cánulas para evitar fugas y deslizamientos. Repare las fugas grandes con sutura, bandas o aglomeraciones. Se permiten pequeñas fugas.</li>
		<li>Suspende el corazón en un recipiente de plástico.</li>
		<li>Conecte un tubo de plástico blando de 22-24 Fr a cada cánula e inserte el otro extremo del tubo en el recipiente lleno de fijador.</li>
		<li>Hacer circular el fijador a través de los circuitos del corazón derecho e izquierdo utilizando una bomba de alto flujo configurada a aproximadamente 100-300 mL/min para el corazón derecho y 200-400 mL/min para el corazón izquierdo para lograr aproximadamente 20 mmHg en el ventrículo derecho y 80 mmHg en el ventrículo izquierdo, respectivamente.</li>
		<li>Mantener la perfusión a 4 °C durante 24 h.</li>
		<li>Lavar el corazón con 0,01 mol/L de PBS durante 30 min agitando cuatro veces.</li>
		<li>Almacene el corazón en 0,01 mol/L de PBS/azida de sodio al 0,02% a 4 °C. NOTA: La fijación de presión-perfusión solo es efectiva para un corazón fresco, no para un corazón recuperado de un cadáver embalsamado.</li>
	</ol></li>
	<li>Disección macroscópica<ol><li>Realizar la disección progresiva con registros fotográficos en cada etapa de la disección.</li>
		<li>Para mantener la relevancia clínica, preste especial atención a evitar distorsionar/deformar cualquier estructura para mantener la morfología fisiológica del corazón.</li>
		<li>Obtener imágenes de las estructuras diana utilizando la orientación clínicamente relevante, como la orientación oblicua anterior derecha.</li>
	</ol></li>
	<li>Fotografía<ol><li>Coloque el corazón fijo y perfundido a presión en un trípode con una plataforma montada con múltiples puntas y la capacidad de girar 360grados.</li>
		<li>Fotografíe el corazón con una cámara réflex digital de un solo lente (Figura 5)24 mientras usa múltiples paneles de luz de diodo emisor de luz colocados en los soportes C y una amplia tela de fondo dúvredn negra.</li>
		<li>Fotografíe con el objetivo con una distancia focal larga (200 mm) a una distancia de trabajo de 4-6 pies para minimizar la distorsión del sujeto14.</li>
	</ol></li>
	<li>Anaglifos<ol><li>Para mostrar imágenes anaglíficas, reconstruya un par de fotografías o imágenes renderizadas en volumen a partir de conjuntos de datos de TC con una diferencia de 10° en el ángulo de rotación en el plano horizontal.</li>
		<li>Convierta un conjunto de estas imágenes bidimensionales (2D), denominadas estereogramas, en anaglifos utilizando el software gratuito16.</li>
		<li>Para ver un anaglifo, use anteojos rojos/cian.</li>
	</ol></li>
	<li>Fotogrametría NOTA: La fotogrametría es la ciencia aplicada a la generación de una reconstrucción tridimensional de la superficie a partir de múltiples fotografías bidimensionales tomadas desde diferentes ángulos17.<ol><li>Cuelgue la muestra en C-Stands o colóquela en la mesa giratoria para obtener cientos de fotografías multidireccionales con un teléfono inteligente.</li>
		<li>Genere el modelo 3D en formato FBX utilizando software disponible en el mercado.</li>
	</ol></li>
	<li>Tomografía computarizada NOTA: La tomografía computarizada se puede realizar después de la perfusión y fijación a presión y en cualquier etapa de la disección.<ol><li>Suspende la muestra de corazón de una barra colocada en la parte superior del recipiente. Para evitar que el corazón se balancee durante la exploración, sostenga la base del corazón con puntas de plástico fijadas en la parte inferior del recipiente. Por lo tanto, el aire servirá como un contraste negativo.</li>
		<li>Realice la tomografía computarizada utilizando un escáner de tomografía computarizada de fila de detectores múltiples disponible en el mercado con los siguientes parámetros: voltaje del tubo de 120 kV, corriente del tubo de 800-900 mA y una rotación del pórtico de 280 ms. La longitud de la dosis del producto es generalmente de 500-1200 mGy.cm.</li>
		<li>Reconstruya los datos de la imagen axial utilizando los siguientes parámetros: un espesor de sección, 0,6 mm; un intervalo incremental, 0,3 mm; un campo de visión, lo más pequeño posible (generalmente 100-200 mm); y una matriz, 512 × 512.</li>
	</ol></li>
	<li>Disección virtual<ol><li>Analice las imágenes de la tomografía computarizada utilizando el software disponible en el mercado para generar imágenes de disección virtuales. NOTA: La disección virtual es una modificación del proceso de representación del volumen en el que el foco se desplaza a las paredes de las cámaras y vasos cardíacos18. En este proceso, el umbral manual elimina prácticamente la cámara mejorada de los conjuntos de datos originales.</li>
		<li>Visualice las paredes, los tabiques y las válvulas no mejorados con disección virtual para producir imágenes similares a la disección macroscópica. A diferencia de la disección macroscópica de las muestras de corazón, los planos de corte durante la disección virtual son prácticamente ilimitados. Casi cualquier vista se puede recrear para visualizar las estructuras de interés según sea necesario.</li>
	</ol></li>
	<li>Impresión 3D<ol><li>Abra el archivo compatible de la muestra de corazón en el software de la impresora 3D.</li>
		<li>Utilice el perfil de 0,10 mm Fast DETAIL para la configuración de impresión en la impresora 3D y reduzca la velocidad de impresión a 20 mm/s. Habilite Generar material de soporte.</li>
		<li>Utilice el perfil del filamento de TPU para "Configuración del filamento" en la impresora 3D.</li>
		<li>Utilice el perfil de la boquilla Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 para "Configuración de la impresora" en la impresora.</li>
		<li>Una vez completado el corte, guarde el archivo BGCODE en una unidad flash USB para la impresión 3D.</li>
		<li>Utiliza el filamento TPU de 1,75 mm para imprimir en 3D la muestra de corazón humano. Antes de la impresión 3D, seca el filamento de TPU durante 6 h con un secador de filamentos.</li>
		<li>Para reducir la tensión del filamento durante la impresión 3D, coloque la bobina de filamento en un soporte de bobina con un rodamiento incorporado para facilitar la rotación de la bobina de filamento. Realice la impresión 3D utilizando una impresora 3D disponible en el mercado con una lámina de acero texturizada con recubrimiento en polvo.</li>
		<li>Retire con cuidado los materiales de soporte cuando se complete la impresión 3D.</li>
	</ol></li>
</ol>

Análisis 3D Integral de Corazones Humanos desde Escalas Micro a Macro

<ol>
	<li>Tawara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Das+reizleitungssystem+des+s&#228;ugetierherzens.+Eine+anatomisch-histologische+studie+&#252;ber+das+atrioventrikularb&#252;ndel+und+die+purkinjeschen+f&#228;den.">Das reizleitungssystem des s&#228;ugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie &#252;ber das atrioventrikularb&#252;ndel und die purkinjeschen f&#228;den.</a> Jena: Gustav fischer. , (1906).</li><li>Stephenson, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+peripheral+neural+circuits+that+regulate+heart+rate+using+optogenetic+and+viral+vector+strategies.">Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies.</a> Nature Communications. 10, 1944 (2019).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Mcalpine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+and+coronary+arteries:+An+anatomical+atlas+for+clinical+diagnosis,+radiological+investigation,+and+surgical+treatment.">Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment.</a> Springer-verlag. , (1975).</li><li>Mori, S., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoscopic+three-dimensional+anatomy+of+the+heart:+Another+legacy+of+dr.+Wallace+a.+Mcalpine.">Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine.</a> Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).</li><li>Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereogram+of+the+living+heart,+lung,+and+adjacent+structures.">Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures.</a> Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).</li><li>Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photogrammetry+of+perfusion-fixed+heart:+Innovative+approach+to+study+3-dimensional+cardiac+anatomy.">Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy.</a> JACC Case Rep. 21, 101937 (2023).</li><li>Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+dissection:+Emerging+as+the+gold+standard+of+analyzing+living+heart+anatomy.">Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30 (2020).</li><li>Thomas, A. C., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+cardiac+pathology+using+perfusion-fixation.">The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation.</a> Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).</li><li>Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+pressure+fixation+apparatus+for+hearts.">Controlled pressure fixation apparatus for hearts.</a> Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).</li><li>Iaizzo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visible+heart(r)+project+and+free-access+website+'atlas+of+human+cardiac+anatomy.">The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy.</a> Europace. 18, 163-172 (2016).</li><li>Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+staining+for+paraffin-embedded+lung+cancer+tissue.">Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue.</a> J Vis Exp. (201), e65850 (2023).</li><li>Tripathy, S., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+organ+preservation:+Current+prospective+and+challenges.">Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges.</a> Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).</li><li>Mori, S., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+cardiac+anatomy+(anatomical+basis+of+cardiac+interventions.+Vol.+1).">Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1).</a> Cardiotext. , (2022).</li><li>Crosado, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenoxyethanol-based+embalming+for+anatomy+teaching:+An+18+years'+experience+with+crosado+embalming+at+the+university+of+otago+in+new+zealand.">Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand.</a> Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).</li><li>Titmus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workflow+for+the+creation+of+photorealistic+3d+cadaveric+models+using+photogrammetry.">A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry.</a> J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).</li><li>Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+applications+of+virtual+reality+in+cardiovascular+medicine.">Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine.</a> JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).</li><li>Maresky, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+reality+and+cardiac+anatomy:+Exploring+immersive+three-dimensional+cardiac+imaging,+a+pilot+study+in+undergraduate+medical+anatomy+education.">Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education.</a> Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).</li><li>Mori, S., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+three-dimensional+cardiac+imaging+using+leading-edge+holographic+display.">Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display.</a> Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).</li></ol>

El presente estudio demuestra el proceso exhaustivo para analizar muestras obtenidas de corazones humanos completos. Los resultados representativos muestran exámenes anatómicos a micro y macroescala realizados de forma rutinaria para un solo corazón. Dado que una muestra de corazón humano es extremadamente valiosa, un enfoque multiescala es ideal y eficaz para no desperdiciar ninguna parte de la muestra mediante la aplicación de múltiples protocolos para diversos fines, incluido el descubrimiento en la investigaci?...

Dado que la función sigue a la forma, la comprensión de la arquitectura del corazón es fundamental para apreciar su fisiología. A pesar de que numerosas investigaciones han revelado la anatomía cardíaca desde la micro hasta la macroescala 1,2,3, múltiples preguntas siguen sin resolverse, especialmente las relacionadas con la anatomía cardíaca humana. Esto se debe, en parte, a que los estudios básicos centrados en la anatomía funcional generalmente utilizaban corazones de animales 4,5,6, que a menudo son distintos de los corazones humanos 1,7,8. Además, cada estudio individual, incluso aquellos que utilizan muestras de corazón humano, tiende a centrarse en estructuras muy específicas, lo que dificulta la aplicación de los hallazgos en el contexto de todo el corazón. Esto es aún más cierto si las estructuras enfocadas están en micro o mesoescala, como el perinexus9 y los plexos ganglionares10.
En este contexto, el estudio estructural sistémico del corazón humano rechazado para trasplante ofrece una oportunidad única y poco común para obtener un atlas completo de las estructuras cardíacas en foco a escalas microscópicas y macroscópicas11. Los protocolos de examen microscópico incluyen la limpieza de tejidos (imágenes tridimensionales (3D) habilitadas para inmunomarcaje modificado de órganos aclarados con solvente, iDISCO+)12,13 y tinción inmunohistoquímica. Los protocolos de examen mesoscópico incluyen disección estereoscópica, macrofotografía y tomografía microcomputarizada (TC). Los protocolos de examen macroscópico incluyen disección macroscópica14, fotografía (incluyendo anaglifos y fotogrametría)15,16,17, TC, disección virtual 18 e impresión 3D del corazón físico o virtualmente disecadoo completo 17. En preparación para el examen macroscópico, se realiza la fijación presión-perfusión para mantener la arquitectura 3D y la morfología fisiológicamente relevante del corazón 14,19,20,21. La aplicación combinada de estas técnicas es única y crucial para correlacionar distintas características anatómicas en el contexto de la arquitectura 3D del corazón humano.
Dado que la oportunidad de obtener una muestra de corazón humano no patológico es extremadamente limitada, el enfoque multiescala descrito en este documento maximiza el uso de la muestra. Mediante la aplicación de varios procedimientos que se describen a continuación, los resultados representativos ilustrarán al lector cómo los hallazgos se pueden utilizar para múltiples propósitos, incluido el descubrimiento en la investigación científica11 (análisis exhaustivos de la inervación cardíaca, distribución de los plexos ganglionares), la mejora de los procedimientos clínicos (simulación para enfoques quirúrgicos e intervencionistas) y la educación anatómica (demostración real en 3D de la anatomía cardíaca).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>713-605-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle - Cy3 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab93680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>139 103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm</td>
			<td>NinjaTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>Decon laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNEXT PET/CT</td>
			<td>SOFIE Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histodenz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN (black edition)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Imaris 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer</td>
			<td>Sunjin Labs</td>
			<td>iSpacer 3mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIRI Engine</td>
			<td>KIRI Innovation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAD-2 - Vertical &#38; Multi-channels Peristaltic Pump</td>
			<td>LONGER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightview XL&#160;</td>
			<td>Brightech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (Certified ACS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon D850</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4</td>
			<td>NinjaTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Prusa MK4 3D printer</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 32%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycam</td>
			<td>Polycam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrusaSlicer 2.7.1</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARA-Engine</td>
			<td>pita4 mobile LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaniverse</td>
			<td>Niantic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold Antiface Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>7144.8-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOMATOM Definition AS</td>
			<td>Siemens Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Field Surgi-Spec Telescopes,&#160;</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope System SZ61</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoPhoto Maker</td>
			<td>Free ware developed by Masuji Suto</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziostation2</td>
			<td>Ziosoft, AMIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pipeline for multi-scale three-dimensional anatomic study of the human heart

El estudio detallado de los corazones humanos no defectuosos rechazados para trasplante ofrece una oportunidad única para realizar análisis estructurales a escala microscópica y macroscópica. Estas técnicas incluyen la limpieza de tejidos (imágenes tridimensionales (3D) habilitadas para inmunomarcaje modificado de órganos aclarados con solvente) y tinción inmunohistoquímica. Los procedimientos de examen mesoscópico incluyen la disección estereoscópica y la tomografía microcomputarizada (TC). Los procedimientos de examen macroscópico incluyen la disección macroscópica, la fotografía (incluidos los anaglifos y la fotogrametría), la tomografía computarizada y la impresión 3D del corazón o del corazón entero, disecado física o virtualmente. Antes del examen macroscópico, se puede realizar una fijación de presión-perfusión para mantener la arquitectura 3D y la morfología fisiológicamente relevante del corazón. La aplicación de estas técnicas en combinación para estudiar el corazón humano es única y crucial para comprender la relación entre las distintas características anatómicas, como la vasculatura coronaria y la inervación miocárdica, en el contexto de la arquitectura 3D del corazón. Este protocolo describe las metodologías en detalle e incluye resultados representativos para ilustrar el progreso en la investigación de la anatomía cardíaca humana.

As function follows form, understanding the architecture of the heart is fundamental for appreciation of its physiology. Although numerous investigations have revealed cardiac anatomy from micro- to macroscales1,2,3, multiple questions remain unresolved, especially those related to human cardiac anatomy. This is in part because basic studies focusing on functional anatomy generally utilized animal hearts4,5,6, which are often distinct from human hearts1,7,8. Furthermore, each individual study, even those using human heart samples, tends to focus on very specific structures, which renders it difficult to apply the findings in the context of the whole heart. This is even more so if the focused structures are at micro- or mesoscales, such as the perinexus9 and ganglionated plexuses10.
In this context, systemic structural study of the human heart rejected for transplantation provides a unique and rare opportunity to obtain a comprehensive atlas of cardiac structures in focus across microscopic and macroscopic scales11. Microscopic examination protocols include tissue clearing (modified immunolabeling-enabled three-dimensional (3D) imaging of solvent-cleared organs, iDISCO+)12,13, and immunohistochemical staining. Mesoscopic examination protocols include stereoscopic dissection, macro photography, and micro-computed tomographic (CT) scanning. Macroscopic examination protocols include gross dissection14, photography (including anaglyphs and photogrammetry)15,16,17, CT, virtual dissection18, and 3D printing of the physically or virtually dissected or whole heart17. In preparation for&#160;macroscopic examination, pressure-perfusion fixation is&#160;performed to maintain the 3D architecture and physiologically relevant morphology of the heart14,19,20,21.&#160;The combined application of these techniques is unique and crucial to correlate distinct anatomic features in the context of the 3D architecture of the human heart.
As the opportunity to obtain a non-pathological human heart sample is extremely limited, a multi-scale approach described herein maximizes the use of the sample. By applying various procedures described below, representative results will illustrate to the reader how the findings can be utilized for multiple purposes, including discovery in scientific research11 (comprehensive analyses of cardiac innervation, distribution of ganglionated plexuses), improvement of clinical procedures (simulation for surgical and interventional approaches), and anatomical education (real 3D demonstration of cardiac anatomy).

Autor destacado: Avance de la anatomía cardíaca humana a través del análisis multiescala de corazones

Pipeline para el estudio anatómico tridimensional multiescala del corazón humano

Knowing cardiac anatomy is fundamental to understanding cardiac physiology. Studies of functional anatomy have spanned the micro to macro scales, but have largely used animal hearts. Systematic study of donor human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to develop a comprehensive atlas that spans the microscopic to macroscopic scales.Through study of the human heart across different scales, we've demonstrated the exquisite innervation of the heart, identified cardiac anatomic structures to improve surgical and interventional approaches, and developed resources for anatomic education. The advantage of studying the human heart across different scales is that the detailed study of microscopic structures may be placed in the context of gross anatomy. The use of pressure profusion fixation maintains the physiologically relevant morphology of the heart.

Exámenes a microescala La aplicación de la limpieza de tejidos permite obtener imágenes de mayores volúmenes de tejido en 3D mediante microscopía confocal. En el corazón, se pueden visualizar los ganglios que contienen las neuronas cardíacas y el patrón neural de la inervación miocárdica (Figura 2). La figura 3 muestra una imagen confocal del miocardio del ventrículo izquierdo humano inmunoteñido para los nervios y las células mu...

Este protocolo presenta una línea completa para analizar muestras obtenidas de corazones humanos que abarcan las escalas microscópica y macroscópica.

Detailed study of non-failing human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to perform structural analyses across microscopic ...

pipeline-for-multi-scale-three-dimensional-anatomic-study-human

Research

JoVE Journal

Biology

Pipeline for Multi-Scale Three-Dimensional Anatomic Study of the Human Heart

226 vistas.  David Geffen School of Medicine at UCLA. Conocer la anatomía cardíaca es fundamental para comprender la fisiología cardíaca. Los estudios de anatomía funcional han abarcado desde la escala micro hasta la macro, pero han utilizado en gran medida corazones de animales. El estudio sistemático de los corazones humanos de donantes rechazados para trasplante ofrece una oportunidad única para desarrollar un atlas completo que abarque desde las escalas microscópicas hasta las macroscópicas.A...

Video: Autor destacado: Avance de la anatomía cardíaca humana a través del análisis multiescala de corazones

Detailed study of non-failing human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to perform structural analyses across microscopic and macroscopic scales. These techniques include tissue clearing (modified immunolabeling-enabled three-dimensional (3D) imaging of solvent-cleared organs) and immunohistochemical staining. Mesoscopic examination procedures include stereoscopic dissection and micro-computed tomographic (CT) scanning. Macroscopic examination procedures include gross dissection, photography (including anaglyphs and photogrammetry), CT, and 3D printing of the physically or virtually dissected or whole heart. Before macroscopic examination, pressure-perfusion fixation may be performed to maintain the 3D architecture and physiologically relevant morphology of the heart. The application of these techniques in combination to study the human heart is unique and crucial in understanding the relationship between distinct anatomic features such as coronary vasculature and myocardial innervation in the context of the 3D architecture of the heart. This protocol describes the methodologies in detail and includes representative results&#160;to illustrate progress in the research of human cardiac anatomy.

This protocol presents a comprehensive pipeline to analyze samples obtained from human hearts that span the microscopic and macroscopic scales.

Investigación

Biología

Enhanced 3D Confocal Imaging of Solvent-Cleared Human Heart Tissues

To begin, use a scalpel to dissect 4%paraformaldehyde-fixed human heart tissue to fit within the chamber for confocal microscopy. Dehydrate the heart specimens in a graded methanol series for one hour each at room temperature with agitation, followed by overnight immersion in a 66%dichloromethane and 33%methanol solution with agitation. The next day, bleach the sample by performing the indicated steps.Then rehydrate the specimen with a graded methanol series for one hour each with agitation. After immunolabeling, perform the following steps to prepare the tissue for imaging. Affix a chamber containing adhesive to a slide and apply nail polish around the perimeter of the chamber.Turn on the upright laser scanning confocal microscope equipped with a 5X lens. Using laser lines appropriate for the emission spectra of the fluorophores used, acquire Tile scan and z-stack images at a resolution of 1024 by 1024. At the microscale level, tissue clearing of heart samples allows visualization of ganglia containing cardiac neurons and the neural patterning of myocardial innervation.

Imágenes confocales 3D mejoradas de tejidos cardíacos humanos aclarados con solvente

Advanced Techniques in Cardiac Visualization from Gross Dissection to Virtual Reconstruction

After turning on a stereo microscope, perform delicate dissections on paraformaldehyde-fixed human heart tissue, focusing on structures such as the atrioventricular node, atrioventricular node artery, and cardiac nerve plexus. Place the heart sample on the scanner bed to acquire a CT image of the heart specimen. Using a 20 to 24 French surgical cannula, cannulate the superior vena cava for right heart perfusion.Then, occlude the inferior vena cava and another pulmonary artery with twine. Next, perform a progressive dissection of the heart tissue with photographic recordings at each stage of dissection. Using multiple light-emitting diode light panels set on C-stands with a wide black duvet and background cloth, photograph the heart with a digital single-lens reflex camera.Suspend the heart sample on a rotation table to obtain hundreds of multi-directional photographs with a smartphone. On Scaniverse and Polycam software, generate the 3D model of the heart in FBX format. Suspend the heart sample from a bar across the top of the container.Use a multi-detector row CT scanner to conduct CT scans of the heart. After generating virtual dissection images of the heart, visualize the non-enhanced walls, septa, and valves with virtual dissection to produce images similar to gross dissection.