Los estudios se realizaron en el Irving Moskowitz y Cherna Centro de Nano e Imagen Bio-Nano en el Instituto Weizmann de Ciencias. Estamos muy agradecidos a Orna Yeger por su ayuda en el diseño y la ejecución de este protocolo.

1. Preparación de la muestra <ol><li> Después de extraer el tejido que ha de ser examinado, los tejidos mineralizados se puede colocar en el instrumento y la imagen. A la imagen del ratón un fémur deben seguir los siguientes pasos: <ol><li> Quitar mensaje pierna mortem de un embrión C57/Bl6 postceutus 18,5 días (E18.5). </li><li> Selle el extremo angosto de una punta de pipeta de poliestireno (20-200 l) con una resina epoxi o pegamento otro, y llenar la punta con el tampón de trabajo (PBS u otro). </li><li> Ajustar bien la pierna en la punta y sellar el otro extremo con la hoja de parafilm. </li><li> Coloque la punta de la pipeta en un soporte adecuado y seguir el protocolo del capítulo 3. Para visualizar el fémur de la pierna del embrión del ratón, el instrumento se encuentra en 40 KV y 200 mA. Para 8μ resolución 1000 imágenes de proyección de 4 aumentos tienen que ser adquiridos. </li></ol></li><li> No mineralizado tejidos tienen que ser fijado inicialmente y se tiñen con el fin de aumentar la atenuación de rayos X del tejido de interés mediante el uso de uno de los muchos protocolos disponibles 8,9. Para los pulmones de ratas y muestras similares, el protocolo de preparación es la siguiente: <ol><li> Implantación de Orthotopical no carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM) NCI-H460 en pulmones de ratas desnudas </li><li> Nódulos de cáncer de pulmón comenzará a ser detectable cuatro semanas desde la implantación </li><li> Sacrificio de las ratas y de inmediato se infunden con una solución salina mezclada con heparina </li><li> Inyectar con una solución diluida de Microfil (Flowtech), (2 ml de solución de compuesto, 3 ml de diluyente y 0,3 ml de agente de curado) en el ventrículo izquierdo a la mancha de la circulación bronquial </li><li> Extracto de los pulmones y el corazón de la rata </li><li> Inmovilizar la muestra (véase el capítulo 2 del protocolo) mediante el ajuste de la fuerza en un tubo de plástico de 50 ml </li><li> Crear una atmósfera saturada de etanol mediante la colocación en la parte inferior del tubo de un paño humedecido en etanol </li><li> Pegamento o tornillos del tubo en un soporte del instrumento </li><li> Continuar con la configuración de los parámetros de imagen (capítulo 3). Para la imagen completa de los pulmones de ratas de la fuente se establece en 40kV y 100 mA. Con el fin de alcanzar una resolución 16μ uno tiene que adquirir 2.500 imágenes de proyección con un aumento de 0.5x. </li></ol></li></ol> 2. Muestra de la inmovilización En alta resolución, es importante para evitar cualquier cambio en la posición de la muestra durante la medición. Para ello, la muestra está fuertemente fijado en un recipiente de plástico que se ajusta a su tamaño. Puntas de pipeta de poliestireno, plástico pipetas Pasteur o construidas especialmente para los titulares de plástico se utilizan en este sentido. De acuerdo a los requerimientos experimentales, la muestra puede ser examinada en el aire o inmersas en soluciones de etanol o de amortiguamiento. Inmovilización típicos y la colocación final de la etapa de embrión de ratón en el instrumento se muestra en la Fig. 1. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. La colocación final de la pierna de embriones de ratón en el instrumento micro CT. 3. Establecer los parámetros de adquisición: rayos X de tensión y corriente, CCD tiempo de exposición <ol><li> Colocado en un soporte, la muestra se coloca en la fase de rotación del instrumento </li><li> Una primera imagen de rayos X se toma con el voltaje y la corriente arbitrariamente. </li><li> Si la imagen es demasiado oscura, se debe aumentar el número de fotones en primer lugar, para aumentar un poco la corriente. Si esto no es suficiente, hay que aumentar un poco la energía de los fotones de rayos X, es decir, la tensión en el tubo de rayos X. </li><li> Si la imagen es demasiado brillante, lo primero que debe disminuir la tensión, entonces la corriente. </li><li> El brillo de la imagen se puede aumentar por hurgar en la basura. Hurgar en la basura de uno tiene en cuenta la intensidad de cada píxel de la imagen, mientras que hurgar en la basura de los dos toma la suma de cada matriz de píxeles de 2x2. La imagen es de 4 veces más brillante que en el caso de binning 1, sino que tendrá la mitad de la resolución. </li><li> Después de ajustar el brillo óptimo, hay que optimizar el tiempo de exposición de la cámara a un compromiso entre el mejor contraste de un lado y una duración razonable de la experiencia en otro lado. </li><li> El contraste de las imágenes, en especial de las muestras de baja absorción, se puede mejorar mediante el uso de filtros, que reducen el flujo de fotones, principalmente la de los fotones de menor energía. </li></ol> 4. Ejemplo de posicionamiento <ol><li> Elija el aumento de trabajo. Las opciones posibles son 0,5 x, 4x, 10x, 20x y 40x. El campo de visión disminuye con el aumento cada vez mayor. </li><li> Obtener la mejor resolución y campo de visión mediante el establecimiento de las distancias entre la fuente de rayos X y de la muestra y entre la muestra y el detector. El aumento de la distancia a la fuente de la muestra se reduce el campo de visión y aumenta la resolución. Muestra la distancia del detector tiene el efecto contrario. </li></ol> Todo el campo para ser visto en 3D debería estar presente en laproyección de la imagen en todos los ángulos. Se debe comprobar esto por la rotación de la muestra en diferentes ángulos y por traer la muestra lo más cerca posible al eje de rotación. Para ello, se deben seguir los siguientes pasos: <ol start="3"><li> Tomar una imagen a 0 grados, y luego girar la muestra a -20 grados. Si el volumen deseado se ha desplazado lateralmente, se debe corregir su posición mediante el reposicionamiento del eje de rotación. </li><li> Después de la corrección, la muestra se va a girar en otro ángulo y la posición corregida de nuevo, hasta que el campo de interés dentro de la imagen en todos los ángulos desde -90 hasta 90 grados. </li></ol> 5. Tomografía de alta resolución <ol><li> Durante la medición, la muestra se gira un pequeño ángulo a la vez y en cada imagen el ángulo de proyección uno se toma. El número total de imágenes es siempre un compromiso entre la resolución deseada en un lado y el momento de la medición y el tamaño del archivo en otro lado. Como se muestra en la figura 2, cada proyección individual incluye todos los cortes en la muestra superpuestos uno sobre otro, y por lo tanto no puede revelar la estructura 3D de la muestra. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Imágenes de la proyección de los pulmones de ratas a los 0 ° (A), 45 º (B) y 90 ° (C) el ángulo de rotación. <ol start="2"><li> Sólo después de tomar imágenes de proyección por lo menos entre -90 y 90 grados, se puede proceder a la reconstrucción del volumen de muestra. Reconstrucción tarda entre 10 minutos y 2 horas, dependiendo del software utilizado y el número de proyecciones. Una vez más, la calidad final de la imagen 3D es un compromiso entre la resolución deseada y el tiempo que se quiere gastar y el tamaño del archivo resultante. </li></ol> 6. Imagen de calibración de la báscula El nivel de pixel (valor) en una imagen reconstruida es único para esa imagen. Con el fin de comparar dos imágenes diferentes, una escala de intensidad única tiene que ser impuestas a cada imagen. Por esta <ol><li> Ejecutar una tomografía con un estándar de fantasma con las mismas condiciones experimentales que para la muestra </li><li> Vuelva a calibrar la imagen de muestra con los valores obtenidos para el fantasma. La escala más común es el Hounsfield (o CT) escala. De 4 aumentos el valor del fondo de 15.000 (de agua o PBS) fue reemplazado por 0 y el valor máximo de 35.000 para que el hueso fue sustituido por el estándar de valor Hounsfield de 3000. Otros valores de píxeles el resultado de la interpolación lineal o la extrapolación sobre la base de esos límites. </li></ol> 7. Procesamiento de imágenes y análisis Después de obtener imágenes de alta resolución, se tiene que extraer la información relevante mediante el uso de software de análisis de imagen. El paquete de software que se utiliza tiene que ser diseñado para trabajar con archivos de gran tamaño (hasta 20GB). 8. Resultados representante Una representación de un fémur de un ratón C57/Bl6 en el día embrionario 18.5 (E18.5) - cuatro días después del inicio del proceso de mineralización se muestra en la Fig. 3. Las capas de mineral son claramente visibles (blanco), mientras que los tejidos blandos no son visibles en esta preparación. Tomamos 1000 imágenes de proyección con un aumento lineal de 4x. La resolución final es de 8 micras. Un análisis cuidadoso de la representación de volumen se muestra en la Fig. 1, muestra que la fracción de volumen de hueso (la fracción del volumen del hueso que está ocupado por tejido mineralizado) es de 0,18, y la densidad mineral ósea es de 723 mg / cm 3. Estos valores nos permiten comparar esta estructura con los huesos en otras etapas de desarrollo. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Representaciones diferentes de una imagen en 3D de un embrión de ratón fémur. El (sección transversal) transversal (A), la sagital (medio-lateral) sección (B) y una fotografía de la representación de volumen (C) se muestran. La Figura 4 muestra una imagen en 3D de los pulmones de una rata hembra desnuda (RNU), 12 semanas de edad, implantada ortotópicamente con carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM) NCI-H460. 2500 imágenes de proyección se tomaron con un aumento lineal de 0,5 x, lo que garantiza una resolución final de 16 micras. La imagen muestra los vasos Microfil manchadas de sangre (hasta un diámetro de 20 micras). El análisis de la imagen muestra que cuatro semanas después de la implantación, el cáncer de los nódulos múltiples se forman. Que están cubriendo una parte importante del volumen pulmonar (17%). La mayoría de las manchas pulmonar se encuentran en las zonas periféricas de los tumores. De manera significativa, como se muestra en la Fig. 4B, varios buques de sangre están presentes también en el interior de los nódulos, que abarca, según el análisis preliminar de un 3% de su volumen. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Imagen en 3D de los nódulos de crecimiento del cáncer en las rataspulmón. Una instantánea de la representación de volumen (A) y una sección a través del volumen (B) se muestran. El cáncer de los nódulos están marcados con flechas. Movie 1. Renderización de volumen del fémur del ratón en la figura 1. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">Haga clic aquí para ver la película.</a> Movie 2. Renderización de volumen de los pulmones de ratas en la Figura 2. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">Haga clic aquí para ver la película.</a> Movie 3. Las secciones seriadas a través de los pulmones. Los nódulos aparecen como zonas grises en la mayoría de los cortes. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">Haga clic aquí para ver la película.</a>

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C57/Bl6 del ratón en el día embrionario 18.5 (E18.5) es cuatro días después del inicio del proceso de mineralización. En esta etapa de desarrollo, el hueso del futuro está hecha de muchas capas de osteoids mineralizada, ve claramente en la figura 3. En este punto, hay que destacar que los tejidos mineralizados se puede visualizar en una resolución más baja, con diferentes instrumentos que requieren menos manipulación de las muestras. El protocolo actual (y el instrumento de micro CT utilizados en ella), además de proporcionar mayor resolución, ofrece la máxima flexibilidad para el usuario para elegir los mejores parámetros geométricos de la medida. Resultados de la figura 4 muestran que en los modelos animales de cáncer de pulmón ortotópico, humanos no pequeñas de cáncer de pulmón de células puede inducir a la contratación de los vasos sanguíneos y neovascularización. Consideramos que el tejido pulmonar se trasladó tampoco, ni ha cambiado su forma durante la medición. El usuario debe tomar precauciones especiales para evitar estos cambios en una tomografía. Para algunas muestras, especialmente para los tejidos blandos, hay que construir dispositivos de sujeción especiales que inmovilizan perfectamente la muestra durante la medición. Por desgracia, la presencia de fugas de alta de agente de contraste en el entorno de los tumores impide una cuantificación fiable de los vasos sanguíneos periféricos. Como resultado de las imágenes están teñidas por un agente de tinción sobre todo en los bordes, que está claramente presente en las películas 2 y 3. No pudimos evitar que el derrame, pero la información útil sobre los nódulos de cáncer, incluyendo su tamaño, forma y la presencia de vasos sanguíneos interior no se vio afectada. Claramente podría concluir que al menos para la circulación bronquial que se ha estudiado aquí, el suministro de sangre periférica participa en la perfusión del tumor, con algunos de perfusión presente también en el interior del tumor.

Para la adquisición de imágenes se ha utilizado una XCT-400 MICRO microfocussed sistema de rayos X producidos por tomografía Xradia, Concord, EE.UU.. Las imágenes fueron procesadas y analizadas utilizando ImageJ (NIH, EE.UU.), Avizo (VSG, Francia) y MicroView (General Electric, EE.UU.), los paquetes de software. Cualquier software de análisis de imágenes disponibles se pueden utilizar en lugar

high resolution 3d imaging of ex-vivo biological samples by micro ct

No destructivos visualización de volumen sólo se puede lograr por medio de técnicas tomográficas, de los cuales el más eficiente es la tomografía de rayos X micro computarizado (μCT). De alta resolución μCT es muy versátil y precisa (1-2 micras de resolución) técnica para su examen en 3D de la ex-vivo de muestras biológicas 1, 2. A diferencia de tomografía electrónica, el μCT permite el examen de hasta 4 cm de espesor muestras. Esta técnica requiere sólo unas pocas horas de la medición con respecto a las semanas en la histología. Además, μCT no se basa en los modelos 2D estereológica, por lo que pueden complementar y en algunos casos puede incluso sustituir a los métodos histológicos 3, 4, que son a la vez lento y destructivo. Acondicionamiento de la muestra y el posicionamiento en μCT es sencillo y no requiere de alto vacío o bajas temperaturas, que pueden afectar negativamente a la estructura. La muestra se coloca y se gira 180 º o 360 º entre un microfocused fuente de rayos X y un detector, que incluye un contador de centelleo y una precisa cámara CCD, para cada ángulo se toma una imagen en 2D, y luego todo el volumen se reconstruye con un de los algoritmos disponibles diferentes 5-7. La resolución en 3D aumenta con la disminución de la etapa de rotación. El protocolo de vídeo actual muestra los principales pasos en la preparación, la inmovilización y el posicionamiento de la muestra seguido de imágenes en alta resolución.

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

No destructivos visualización de volumen sólo se puede lograr por medio de técnicas tomográficas, de los cuales el más eficiente es la tomografía de rayos X micro computarizada (TC).

3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

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Research

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Bioengineering

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Investigación

Bioingeniería

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Velocímetro de Micro-partículas para Velocity perfil mediciones de flujos de sangre Micro

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Obtención de imágenes de tejidos biológicos por desorción ionización electrospray espectrometría de masas

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Posicionamiento adecuado y la contención de una rata de extremidades para la proyección de imagen enfocada de alta resolución del hueso utilizando la microarquitectura In Vivo Micro-tomografía computada

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Proyección de imagen 3D de alta resolución de la red Neuro-insular del páncreas humano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Imágenes de alta resolución de la dinámica nuclear en células vivas bajo tensión de tracción uniaxial

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...