Este protocolo mejora considerablemente el contraste entre los tejidos de la planta parásita y el hospedador en muestras que serán analizadas mediante microtomografía. La técnica aquí descrita acelera el proceso de perfusión de contraste a través de la muestra, permitiendo el análisis de tejidos y estructuras específicas formadas entre la planta parásita y el huésped. El enfoque de vacío es muy sencillo y no debería ofrecer dificultades.
El aparato de perfusión, por otro lado, puede ser un poco difícil de configurar. Pero la práctica previa podría ayudar. Para muestras pequeñas no leñosas, se puede utilizar el método de vacío para la aplicación.
Mientras que el método de profusión debe usarse para muestras que son más grandes y leñosas, incluido un segmento del tallo o raíz huésped. Si utiliza el método de vacío, coloque la muestra en el vial que contiene la solución de contraste. A continuación, coloque el vial en una cámara de vacío o desecador conectado a una bomba de vacío.
Retire la tapa del vial y cierre la cámara de vacío o el desecador. Compruebe que no haya grietas en la cámara de vacío o en el desecador. Abra la válvula de escape de la cámara o el desecador para forzar la salida del aire.
Encienda la bomba y espere hasta que la presión alcance aproximadamente 20 pulgadas de mercurio, o 10 psi. Cierre la cámara o la válvula de escape del desecador para evitar que el aire vuelva a entrar. Luego apague rápidamente la bomba.
Deje la muestra al vacío durante al menos dos horas. Si utiliza el método de profusión, seleccione el tanque de suministro de acuerdo con el tamaño de la muestra. Para muestras pequeñas, se puede usar una jeringa de 50 mililitros sin aguja como tanque.
Conecte un extremo de un tubo de plástico transparente al tanque de suministro. Luego conecte el otro extremo a una válvula de dos o tres vías. Conecte un segundo tubo a una salida diferente en la válvula.
Asegure el tanque de suministro en una posición elevada sin desmontar el aparato configurado en el paso anterior. Cierre la válvula de tres o dos vías para evitar que el líquido salga del sistema de tuberías y vierta la solución de contraste en el tanque de suministro. Asegúrese de que no haya burbujas de aire grandes en el sistema de tuberías y cierre la válvula nuevamente, dejando el aparato en su lugar.
Para preparar la muestra para la profusión de la solución de contraste, manténgala sumergida en líquido y corte la punta del extremo proximal del tallo o raíz huésped. Abra cuidadosamente la válvula para permitir que la solución de contraste fluya lentamente y llene el tubo de plástico conectado al tanque mientras mantiene el extremo abierto del sistema en una posición ligeramente elevada para evitar que la solución contrastante se derrame. Conecte el extremo proximal del tallo o raíz huésped en la muestra al extremo abierto del sistema de tubos.
Deje que la solución perfunda la muestra durante al menos dos horas o hasta que la solución se acumule dentro del recipiente. Cierre la válvula y desconecte cuidadosamente la muestra del aparato. Lave la muestra sumergiéndola en agua durante dos minutos.
Coloque la muestra en una toalla de papel a temperatura ambiente para permitir que el exceso de agua se evapore durante dos a cinco minutos sin permitir que la muestra se seque por completo. Envuelva la muestra en una película de parafina y evite doblar la película sobre la muestra. La micro-tomografía computarizada se puede aprovechar para comprender mejor las complejas estructuras de las plantas parásitas y su interacción con los huéspedes de una manera tridimensional no destructiva.
Los protocolos descritos aquí funcionan para diferentes sistemas de micro-TC. Sin embargo, la configuración y los parámetros dependen del sistema y de las muestras. Las imágenes de microscopio de rayos X 3D fueron tan efectivas como las secciones anatómicas observadas bajo un microscopio óptico para analizar la organización y topología del tejido en la interfaz del huésped parásito.
Sobre la base de la diferencia de color blanco brillante y gris oscuro debido a la absorción diferencial de la solución de contraste, es posible observar la abundancia de parénquima que rodea el núcleo vascular del haustorio. El núcleo vascular se observa fácilmente en secciones transversales, ya que dos hebras vasculares están separadas por parénquima. El endoparásito Viscum minimum, que crece dentro de una planta huésped suculenta, mostró células de parénquima que almacenan carbohidratos en forma de almidón.
La diferencia en la absorción de yodo permitió la detección de la intrincada red de hebras corticales formadas por el endoparásito dentro del cuerpo huésped. Los resultados obtenidos para Cuscuta Americana y Struthantus marcianus ayudan a ilustrar la conveniencia del enfoque de microtomografía para muestras pequeñas y grandes, respectivamente. La sección virtual en serie de Sibelium fungiforme mostró que los vasos en la raíz del huésped se bifurcan en el tubérculo parásito, y que la continuidad del xilema entre las dos plantas está formada por la conexión de vaso a vaso a través de placas de perforación.
El procedimiento descrito aquí se puede combinar con otras técnicas, como la segmentación virtual, para proporcionar nuevos conocimientos sobre la estructura tridimensional de la conexión entre las plantas parásitas y sus huéspedes. Esta técnica ha allanado el camino para analizar diferentes aspectos de la biología de las plantas parásitas, incluido el desarrollo de endoparásitos y la funcionalidad de las conexiones hiperparasitarias.
