Doy las gracias a la Dra. Jessica Domínguez Rieg para la lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association (Desarrollo Científico subvención 10SDG2610034), una W. Gottschalk Beca de Investigación de la Sociedad Americana de Nefrología Carl, el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales O&#39;Brien Center for Acute Kidney Injury Investigación ( P30DK079337), y el Departamento de Asuntos de Veteranos.

1. Soluciones <ol><li> 0,85% de NaCl: 8,5 g de NaCl / 1 l ddH 2 O (8,5 g / L). </li><li> 0,5 mol / L de HEPES pH 7,4 (disolver 59,6 g de HEPES en 0,5 l de ddH 2 0 y ajustar el pH a 7,4 usando NaOH 10 N). </li></ol> 2. Preparación de la solución de inyección con FITC-inulina <ol><li> Pesar con FITC-inulina para preparar una solución al 5% y se disuelven en 0,85% de NaCl (generalmente 100 mg / 2 ml de 0,85% de NaCl) por calentamiento a 90 ° C hasta que esté completamente disuelto. </li><li> Pesar disuelto solución de FITC-inulina y peso nota. </li><li> Corte un pedazo de 20 cm de la membrana de diálisis (peso molecular de corte: 1000) y poner en ddH 2 O durante 30 minutos para retirar los residuos de NaN 3 de la membrana y enjuague varias veces después. </li><li> Llenar disuelto FITC-inulina en membrana de diálisis y sellar adecuadamente con cierres. </li><li> Pesar la membrana entera de diálisis. </li><li> Coloque la membrana de diálisis en 1 l de solución de NaCl 0,85% y revuelva lentamente protegido de la luz durante 24 horas a rotemperatura de OM. </li><li> Pesar la membrana entera de diálisis nuevo y calcular la nueva concentración (agua osmóticamente mover en la membrana y FITC no unido, o unido con FITC-inulina &lt;1.000 peso molecular se moverá fuera de la membrana, por lo que la concentración de FITC-inulina disminuirá sustancialmente) . </li><li> La nueva concentración de FITC-inulina (c) se calcula utilizando la siguiente fórmula: C = N / V, donde n = cantidad de FITC-inulina inicial, V = volumen nuevo (diferencia en el peso de un tubo de diálisis antes y después de la diálisis más el volumen inicial de solución de FITC-inulina). </li><li> Antes de su uso esterilizar solución dializada FITC-inulina por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras. </li><li> Mantenga FITC-inulina protegido de la luz (papel de aluminio) a 4 ° C. Dializada y esterilizado FITC-inulina se puede utilizar durante un máximo de 2 semanas. Participó FITC-inulina puede ser disuelto por re-calentamiento a 90 ° C durante unos pocos minutos. </li></ol> Nota: si se utilizaFITC-sinistrina 16-18, que no requiere diálisis, todos los pasos necesarios para la diálisis pueden ser omitidos. 3. Inyección y extracción de sangre <ol><li> Tome el peso corporal (pc) de los ratones antes del experimento. </li><li> Anestesie ratones brevemente con isoflurano. </li><li> Para alto rendimiento de 6 ratones por favor siga el protocolo proporcionado en la Figura 3. </li><li> Inyectar 2 l / g de peso corporal de dializado con FITC-inulina en el plexo retroorbital, 24 mediante el uso de una aguja G30 ½ (eliminar burbujas de aire de 100 l jeringa Hamilton por primera usando una aguja G26 en ½ y luego cambiar a un G30 ½ en la aguja para inyección). </li><li> Cortar 1 mm de la cola del ratón con tijeras una vez y recoger la sangre a los 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 y 75 min después de la inyección en Na-Heparina minicapillaries. Seal minicapillaries después de la extracción de sangre con el cha-sello. </li><li> Mantener las muestras protegidas de la luz. </li><li> Ponga sellada minicapillaries dentro hematocapilares crit y centrifugar durante 5 min. </li><li> Romper minicapillaries usando un cortador de diamantes y toda transferencia de plasma con la pipeta en un tubo de 0,2 ml. </li><li> Hacer una dilución 1:10 mediante el uso de 2 l de plasma y 18 l 0,5 mol / L de HEPES (pH 7,4) en el nuevo tubo de 0,2 ml (muestras podrían ser almacenados durante la noche a 4 ° C durante las mediciones de fluorescencia). </li><li> Mida 2 l de muestra diluida con NanoDrop 3300 por duplicado. La descripción y el uso del instrumento se describe aquí 5. </li></ol> 4. Elaboración de Normas <ol><li> Recoger la sangre de los ratones de la misma cepa de fondo en heparina recubierto capilares hematocrito, girar hacia abajo y se diluye 1:10 con 0,5 mol / L de HEPES (pH 7,4), por lo general 80 l de plasma + 720 l de HEPES. </li><li> Diluir solución inyectable FITC-inulina con plasma de ratón diluido para obtener las siguientes diluciones estándar: 01:10: 10 l sin diluir solución de FITC-inulina + 90 l plasma de ratón diluido 1:100: 10 y mu; L (01:10) + solución de 90 l de plasma de ratón diluido 1:1.000: 10 l (1:100) + solución de 90 l de plasma de ratón diluido 1:2.000: 30 l (01:01) + solución de 30 l de plasma de ratón diluido 1:10.000: 10 l (01:05) + solución de 40 l de plasma de ratón diluido 1:20.000: 20 l (01:01) + solución de 20 l de plasma de ratón diluido 1:100.000: 10 l (01:05) + solución de 40 l de plasma de ratón diluido La concentración de los estándares dependerá de la diálisis y siempre será diferente para cada preparación de FITC-inulina. Es necesario introducir la concentración para la curva estándar nuevo cada vez. </li><li> Analizar los datos para calcular la tasa de filtración glomerular con el software apropiado (por ejemplo, GraphPad Prism) mediante el uso de una función de decaimiento exponencial de dos fases como se describe aquí en 15, 20 y se muestra en la sección de resultados Representante. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate.">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li><li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatinine:+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases.">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li><li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. 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D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. 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Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li><li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

El autor recibió fondos para cubrir los costos de esta publicación por Thermo Fisher Scientific.

El presente trabajo describe una técnica para la determinación de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes por inyección de un solo bolo y el análisis de fluorescencia en 8 muestras de sangre de dos fases de decaimiento exponencial. Una medición de la TFG en 1 ratón toma 75 min. Mediante el uso de un diagrama de flujo especial, es posible medir la tasa de filtración glomerular de 6 ratones en 130 min. Es factible que repetir este protocolo de diagrama de flujo de hasta 4 veces por día y medir la TFG en 24 ratones. Hemos modificado este método de manera que es posible recoger la sangre de un pequeño recorte de cola en lugar de punción vena de la cola, que es más rápido y más fácil para los investigadores para llevar a cabo en comparación con la punción vena de la cola. Mediante el uso de 10 l capilares hematocrito y una dilución 1:10, es posible reducir la cantidad total de sangre necesaria a &lt;100 l. Por último, se mide la fluorescencia utilizando un NanoDrop 3300 fluorospectrometer, que permite la determinación de la fluorescencia en 1-2 l de muestra diluida. Este método le dará al interesado investigatora verdadero valor del FG. En contraste, las mediciones de creatinina en ratones tienen varias debilidades incluyendo &quot;gama ciega creatinina&quot; y las dificultades relacionadas con la determinación específica y sensible. El &quot;rango ciego de creatinina&quot; limita su función como un marcador para la TFG porque la creatinina sérica se mantiene en el intervalo normal hasta 50% de la función renal se pierde 19. Dado que varios investigadores utilizan ratones modificados genéticamente en sus investigaciones para estudiar la fisiología renal y la fisiopatología, esto lleva al siguiente problema: suponiendo un ratón knockout de genes X tendría una tasa de filtración glomerular significativamente menor (un 40%) en comparación con un ratón de tipo salvaje, un de detección sencilla mediante la comparación de la creatinina plasmática no detectar esta diferencia. La necesidad de un buen método preciso de la determinación de la TFG se hace más crítica cuanto más pequeña de las diferencias en la tasa de filtración glomerular convertirse. Los ratones tienen altas concentraciones de cromógenos no-creatinina en su plasma y orina que interfieren con la comercialmenteensayos de creatinina disponibles. Como consecuencia de ello, los ensayos que se basan en la reacción de Jaffé picrato alcalino sobreestimación concentración de creatinina en el plasma en comparación con la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) determinación 6, 13. Otra limitación es que la creatinina en suero está por debajo de los límites de detección de los varios ensayos disponibles comercialmente en comparación con determinación por HPLC. Sin embargo, mediante el uso de reacciones enzimáticas investigadores fueron capaces de determinar la creatinina plasmática en ratones 10, 22. TFG en un rango similar se encontraron en ratones conscientes usando un método de inyección de un solo bolo similar así como aclaramiento urinario FITC-inulina 14. En contraste con su protocolo, el protocolo de uso de recorte cola no requiere precauciones especiales para preservar la integridad de los vasos en comparación con vena de la cola o punción de la vena safena. Para el aclaramiento urinario / plasma basado FITC-inulina es necesario implantar quirúrgicamente dos millas osmóticanipumps. Dos bombas son necesarias para alcanzar suficientes altas concentraciones de estado estacionario en plasma FITC-inulina que se distinguen claramente del fondo. Esto también requiere el uso de jaulas metabólicas para una recolección de orina completa y cronometrada. Las jaulas deben ser enjuagados para dar cuenta de una pérdida de 25-37% de FITC-inulina, que se produce de otro modo sin enjuagar. Los peligros de la utilización de este método FITC-inulina son limitadas. Los investigadores deben ser conscientes de los siguientes: (i) asegurar que no haya burbujas de aire en la jeringa usada para la inyección de la solución de FITC, (ii) la inyección retrobulbar completa debe lograrse porque la cantidad inyectada determina la tasa de filtración glomerular calculada, y ( iii) ratones serán más probable orinar durante el experimento de 75 min TFG, por lo que evitar la contaminación de las muestras de sangre con la orina, que tendrá una muy alta concentración de FITC-inulina como consecuencia de la capacidad de concentración de los riñones. Ventajas generales of este método FITC-inulina incluyen los siguientes: (i) es una técnica no radiactivo, (ii) es posible repetir las mediciones varias veces en el mismo ratón, (iii) el ensayo puede llevarse a cabo en ratones conscientes, ( iv) no se requiere ninguna muestra de orina, y (v) una opción de alto rendimiento se puede utilizar. Desventajas de la sola inyección en bolo incluyen la necesidad de diálisis de FITC-inulina, que puede ser superado mediante el uso de una mejor FITC-marcador, FITC-sinistrina, que está disponible ahora y puede ser medida transcutánea usando un dispositivo miniaturizado especial 18. A pesar de que la TFG se mide, no es posible medir excreciones fraccionales de fluido o iones con este método. Tomados en conjunto, este método proporciona la viabilidad de un método de alto rendimiento para la medición de la TFG en ratones conscientes. Por lo tanto, esta técnica podría ser de interés para otros investigadores que están interesados ​​en la determinación de la función renal en ratones.

La tasa de formación de ultrafiltrado de plasma en el glomérulo se ha convertido en la base para la evaluación de la función renal (filtrado glomerular TFG). El marcador ideal para determinar la TFG debe ser filtrada libremente, ni secretado o reabsorbido y no metabolizada. Tal comportamiento se encontró que era cierto para la inulina, y la depuración de inulina se ha convertido en un estándar de oro para la determinación de la TFG 3. Mientras que el aclaramiento de creatinina se utiliza ampliamente como una medida de la tasa de filtración glomerular en los seres humanos y los animales, la creatinina no cumple los requisitos de un marcador ideal TFG. Alrededor de 10 - 40% de la depuración de creatinina en los seres humanos es la consecuencia de la secreción tubular activa 1, 11, y la secreción renal de creatinina también es prominente en ratones y ratas 4, 7, 9, 22. La disfunción renal se sabe que aumenta la secreción tubular de creatinina que limita su valor como un marcador de la TFG 1, 2. Hemos demostrado previamente que el transportador de aniones orgánicos isoforma3 (OAT3) contribuye a la secreción de creatinina renal murina 22. Sin embargo, la depuración de inulina normalmente requiere el uso de inulina marcado radiactivo (3 H o 14 C). La determinación radiactiva de inulina puede ser utilizado tanto en los ratones anestesiados y consciente, pero alberga las desventajas de numerosas normas de seguridad estrictas y las cuestiones de manipulación inherentes con el uso de isótopos radiactivos. En ese sentido, los preparativos de remoción quirúrgica para la determinación de la TFG son mucho tiempo, así como de terminales en la naturaleza. En 1999. Lorenz et al 12 introdujo FITC-inulina como un marcador de un solo nefrona TFG en ratones anestesiados. Cinco años más tarde Qi et al. 15 determina toda renal TFG en ratones conscientes utilizando FITC-inulina. Protocolos alternativos están utilizando FITC-inulina como un marcador exógeno para medir la TFG en ratones conscientes y anestesiados. Estos protocolos conservan la sensibilidad de inulina radiactivo mediante el uso de fluorescencia DETECTIy en eludir las desventajas de trabajar con un marcador marcado radiactivo. El ensayo de FITC-inulina fue modificado por otros 7, 8 y 22, somos 23 para tomar ventaja de la capacidad de microvolumen de la NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Esto permite reducir el volumen total de la muestra necesario para &lt;100 l de sangre por medición TFG. Con el método y el protocolo de alto rendimiento proporcionada en esta publicación, se demuestra la factibilidad de medir la TFG en un máximo de 24 ratones conscientes por día. Esta técnica podría ser útil para otros investigadores que estudian murino TFG y esperamos que sustituirá a los métodos menos precisos como los índices de la función renal, como la creatinina y nitrógeno de urea en sangre.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

La medición de la tasa de filtración glomerular (TFG) es el estándar de oro en la evaluación de la función renal. Actualmente, los investigadores determinar la TFG midiendo el nivel del biomarcador de creatinina endógena o exógena aplicada radiactivo inulina marcada (3 H o 14 C). La creatinina tiene el inconveniente sustancial de que las cuentas de la secreción tubular proximal para obtener ~ 50% del total de la excreción de creatinina renal y por lo tanto, la creatinina no es un marcador fiable TFG. Dependiendo del experimento llevado a cabo, la depuración de inulina puede ser determinada por una inyección única en bolo o infusión intravenosa continua (minibomba osmótica o intravenosa). Ambos enfoques requieren la recogida de plasma o plasma y orina, respectivamente. Otros inconvenientes de inulina marcado radiactivo incluyen el uso de isótopos, consume mucho tiempo la preparación quirúrgica de los animales, y el requisito de un experimento de terminal. Aquí se describe un método que utiliza una única inyección en bolo deisotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con inulina y la medición de su fluorescencia en 1-2 l de plasma diluido. Mediante la aplicación de un modelo de dos compartimentos, con 8 colecciones de sangre por ratón, es posible medir la tasa de filtración glomerular en un máximo de 24 ratones por día utilizando un protocolo especial de flujos de trabajo. Este método sólo se requiere breve anestesia con isoflurano con todas las muestras de sangre que se recoge en un ratón que no sea sobrio y despierto. Otra ventaja es que es posible seguir los ratones durante un período de varios meses y tratamientos (es decir, haciendo experimentos emparejados con cambios en la dieta o aplicaciones de drogas). Esperamos que esta técnica de medición de la TFG es útil para otros investigadores que estudian la función del riñón del ratón y sustituirá a los métodos menos precisos para estimar la función renal, como la creatinina plasmática y urea en la sangre.

FG se calcula utilizando la siguiente fórmula: TFG = n / (A/K1 + B/K2), donde n = cantidad inyectada (n = c • V, donde c = concentración de FITC-inulina, V = volumen inyectado) A = casilla de verificación Período1, intersección y de la eliminación K1 = constante para la eliminación de la caries B = Span2, intersección y de distribución K2 = constante de desintegración para la distribución Nota: A, K1, K2 y B son abreviaturas dadas por GraphPad Prism, cada software capaz de analizar dos fases de decaimiento exponencial se puede utilizar, sin embargo, otro software científico podría utilizar diferentes abreviaturas. Mediante el empleo de un ajuste de la curva de decaimiento exponencial de dos fases, que se basa en las concentraciones de FITC-inulina en plasma, se debe obtener una curva similar a la mostrada en la Figura 1. Cálculo de FG por la fórmula anterior se muestra (y como se describe en aquí &lt;sup&gt; 20) permite detectar el deterioro de la función renal 15 o hiperfiltración glomerular 8, 23 tal como se encuentra en ratones con diabetes mellitus tipo 1 (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> Figura 1. Para medir la TFG en ratones conscientes, se utiliza la cinética plasmática de FITC-inulina después de una inyección intravenosa de una dosis única. Para el cálculo de la TFG, se emplea un modelo de dos compartimentos. En el modelo de dos compartimentos, la fase inicial de la decadencia rápida representa la redistribución de FITC-inulina desde el compartimiento intravascular al fluido extracelular. La fase más tarde, con lenta decadencia de la concentración de FITC-inulina, refleja predominantemente aclaramiento sistémico del plasma. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> Figura 2. Detection de hiperfiltración diabética en ratones de tipo salvaje. diabetes mellitus tipo I fue inducida por la aplicación intraperitoneal de estreptozotocina (STZ, 50 mg / kg durante 5 días consecutivos). TFG se determinó antes (basal) y 5 semanas después de la inducción de la diabetes. Debido a la retroalimentación túbulo glomerular, un aumento en la reabsorción proximal principal causa hiperfiltración diabética temprana 21 un hallazgo que se puede reproducir en los ratones de tipo salvaje (n = 10, p &lt;0,01 vs basal mismo ratón). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> Figura 3. Diagrama de flujo para la medición de la TFG en un conjunto de 6 ratones. Para medir toda renal TFG por el método de inyección de bolo único, 8 muestras de sangre debe ser recogido en 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 y 75 min después de la inyección de FITC-inulina. Los números indican los puntos de tiempo. Los números entre paréntesis indican el número de muestras. Los puntos del tiempo la izquierda de la línea vertical de color rojo indican la inyecciónpuntos de tiempo (a los 0, 11, 22, 33, 44 y 55 min). Cada ratón se marca con un color diferente. Para extracciones de sangre secuenciales seguir las flechas. Los recuadros grises indican cuando el siguiente ratón debe estar preparado para la anestesia con isoflurano antes de la inyección. El uso de este protocolo el tiempo mínimo entre 2 colecciones de sangre de diferentes ratones es de 1 min.

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A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

La medición de la tasa de filtración glomerular (TFG) es el estándar de oro para la evaluación de la función renal. Aquí se describe un método de alto rendimiento que permite la determinación de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes mediante el uso de una sola inyección en bolo, la determinación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) de la inulina en plasma y el cálculo de la TFG por un modelo de decaimiento exponencial de dos fases.

Un método de alto rendimiento para la medición de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

43.1K vistas.  University of California, San Diego. La medición de la tasa de filtración glomerular (TFG) es el estándar de oro para la evaluación de la función renal. Aquí se describe un método de alto rendimiento que permite la determinación de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes mediante el uso de una sola inyección en bolo, la determinación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) de la inulina en plasma y el cálculo de la TFG por un modelo de decaimiento exponencial de dos fases.

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A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Investigación

Biología

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

Alto Rendimiento de medición y clasificación de P orgánico en las muestras ambientales

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Capa de hielo: Un método para el cultivo Arabidopsis Y plantas de tomate en las placas de 96 pocillos de alto rendimiento para genotipado

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Demostración Laboratorio Fisiología: tasa de filtración glomerular en una rata

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...