We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.

NOTA: El rendimiento de tales sistemas de ensayo depende del equipo de laboratorio HTS disponible. Este protocolo es facilitado por un Tecan Freedom EVO 200 robot, que lleva a cabo el manejo de líquidos en formato de 96 pocillos. La miniaturización al formato de 384 pocillos también es posible. El sistema de manipulación de líquidos robótico se coloca bajo una campana de flujo laminar a fin de mantener condiciones asépticas durante todos los pasos experimentales. Si no incluye la automatización de manejo de líquidos está disponible, el protocolo se puede adaptar fácilmente al formato de bajo rendimiento. Proyección Primaria 1. Día 1: Preparar y células de semillas NOTA: Sembrar las células para producir 80% de confluencia en el momento de ensayar la actividad de la luciferasa, es decir, 48 hr después de la siembra. <ol><li> Resuspender tripsinizaron células de neuroblastoma CHP134-mycn3UTR a una concentración de 2 × 10 5 células / ml en RPMI que contiene 10% de FBS y 1% de L-glutamina. Durante 27 placas de preparar al menos 250 ml de<html> suspensión celular teniendo en cuenta el manejo de líquidos, comederos volúmenes muertos y pasos de pipeteo repetidas. Verter la suspensión de células en el depósito estéril y colóquelo en el escritorio robot. </li><li> Coloque 9 blancos de fondo plano placas de 96 pocillos con código de barras y una caja de 200 l puntas de pipeta estériles sobre el escritorio robot. Mezclar la suspensión celular con la pipeta antes de cada paso dispensación para evitar las células de sedimentación por gravedad. Dispensar 75 l de células en cada pocillo de placas 9 para obtener una densidad final de 1,5 × 10 4 células por pocillo. </li><li> Se cubren las placas con las tapas y se dejan fuera de la incubadora durante 30 minutos para permitir que las células se sedimentan en el fondo del pozo. Esto minimizará los efectos de borde. </li><li> Repetir los pasos 1.2 y 1.3 dos veces con el fin de preparar un número total de 27 placas. </li><li> Coloque las placas a 37 ° C y 5% de CO 2 y se incuba durante 24 horas. </li></ol> 2. Día 2: Tratar las células con compuestos de la biblioteca ntent &quot;&gt; NOTA: La biblioteca de moléculas pequeñas Spectrum colección consta de 2.000 compuestos dispuestas en 8 filas y 10 columnas en 25 placas de 96 pocillos a la concentración de 10 mM en DMSO Los pozos en las primeras y últimas columnas se dejan vacíos para los controles. ensayos de cribado. Compuesto se realizan típicamente a una concentración de compuesto 1-10 mu M 8. El protocolo de selección descrito aquí fija 2 mu M como la concentración de trabajo y 24 hr como el punto final del ensayo. <ol><li> Descongele 9 placas de biblioteca compuesto a temperatura ambiente. </li><li> Preparar dos cubetas con soluciones% DMSO 0,5 PBS PBS estéril y y colocarlos en el escritorio robot. Para cada placa de biblioteca, preparar y etiquetar en consecuencia una placa de dilución - un polipropileno placa de 96 pocillos de fondo en U con un volumen de trabajo de al menos 400 l. Llenar cada pocillo de las columnas 2 a 11 de placas de dilución con 398 l de PBS estéril utilizando puntas fijas del controlador de líquido. Llenar las columnas 1 y 12 con 50 l de PBS estérilcon 0,5% de DMSO a fin de reproducir la concentración del vehículo en los pocillos de control (0,02%). </li><li> Coloque dos placas de la biblioteca, las placas de dilución correspondiente etiquetados, dos cajas de 50 l puntas de pipeta estéril y seis placas de células en el escritorio robot. Destape placas células. </li><li> Pipetear 2 l de la solución madre 10 mM de una de dos placas de la biblioteca en la placa de dilución correspondiente y mezclar bien. Esto dará lugar a una concentración de compuestos intermedios de 50 mM. Utilizando el mismo conjunto de consejos, prescindir 3 l de la dilución 50 mM en 3 blancos placas de 96 pocillos con código de barras con las células. Esta dilución sistema tiene como resultado en 2 mM concentración de cada compuesto de trabajo probados. NOTA: Para evitar manipulaciones innecesarias con los consejos, utilice un conjunto completo de 96 puntas desde el principio, a pesar de que las placas de la biblioteca contienen sólo 80 compuestos. Esto es posible ya que la primera y la última columna de las placas de la biblioteca están vacías. </li><li> Reemplace las puntas de pipeta y repetir Step 2.4 para la segunda placa de biblioteca. </li><li> Cubra las placas de células y devolverlos a la incubadora durante 24 horas. </li><li> Repita los pasos 2.3 a 2.6 veces más de dos de las placas de la biblioteca restantes. </li></ol> 3. Día 3: Realizar ensayo de luciferasa NOTA: Antes de realizar el ensayo de luciferasa, es posible multiplexar con un ensayo de viabilidad celular basado en la reducción de la resazurina a fin de obtener un índice de viabilidad celular de cada pocillo 9. Multiplexación luciferasa y ensayo de viabilidad ensayos como resultado una reducción de la señal de luciferasa que, sin embargo, puede ser ignorada si las células proporcionan nivel suficientemente alto de actividad de luciferasa. La actividad de luciferasa se ​​puede detectar mediante una variedad de reactivos de ensayo de luciferasa 10,11 comerciales y caseras con señal luminiscente estable. <ol><li> Equilibrar el reactivo de luciferasa reconstituido de elección a temperatura ambiente. Asegúrese de que el volumen es suficiente para todas las placas ensayadas. Para 27 de placaSe requerirá s 170 ml de reactivo de luciferasa teniendo en cuenta el manejo de líquidos, comederos volumen muerto y pasos de pipeteo repetidas. Verter el reactivo de luciferasa en un depósito y colocarlo en el escritorio robot. </li><li> Retire 9 placas con células de la incubadora, colocarlos en el escritorio robot, descubrir y esperar hasta alcanzar la temperatura ambiente. Añadir 50 l de reactivo de luciferasa por plato bien por plato. Entre las placas, introducir un retardo igual al tiempo de lectura de la luminiscencia de una placa. Esto asegurará que todas las placas se miden en intervalos iguales de tiempo desde la adición del reactivo. </li><li> Después de una incubación de 30 min, colocar la primera placa en el luminómetro y medir la luminiscencia después de un breve paso agitación. Repita para todas las placas. Registre el código de barras de cada placa y asociarlo al archivo de datos correspondiente para evitar errores que surgen a partir de un gran número de placas manipulados. </li><li> Repita los pasos 3.2 a 3.3 veces para los 18 restantes placas con células. </li&gt; <li> Recoger el reactivo luciferasa restante y almacenarlo a -20 ° C. </li></ol> 4. Día 4: Análisis de datos <ol><li> Proceso de los datos experimentales usando la normalización de todas las muestras a la media de los controles tratados con vehículo en forma de placa. Para cada compuesto biblioteca, calcular el valor medio X y SD en triplicado. </li><li> Seleccione un máximo de regulación y abajo de la regulación éxitos estableciendo un umbral de X ± k × SD, donde la x valor medio y SD se calculan sobre todos los valores de ensayo procesada, y k es una constante definida. </li><li> Seleccione un umbral arbitrario de corte &lt;20% de los controles tratados con vehículo cuando una reducción de la señal de luciferasa está muy probablemente relacionados con la toxicidad del compuesto. Descartando los accesos por debajo de este umbral se reducirá significativamente un número de golpes falsos positivos en la lucha contra el cribado. NOTA: En lugar de normalización basado en el control, los datos experimentales pueden ser procesados ​​aplicando puntuación Z o su robusta analógica B snúcleo 12. Además, los enfoques estadísticos alternativos para la selección hit están disponibles 12. </li></ol> 5. Counter-screening NOTA: Los compuestos identificados en la pantalla principal (etiquetados &quot;hits&quot;) se confirman y se evaluó la especificidad por una contra-selección. <ol><li> Cereza recoger los éxitos seleccionados de las alícuotas almacenados en tubos con códigos de barras 2D individuales y crear nuevo &quot;hit placas&quot;, el ahorro de la disposición correspondiente. No te olvides de dejar posiciones libres para los controles. NOTA: En la ausencia de un sistema de cherry-picking eficiente, se podría probar tanto el control y 3 &#39;UTR células que llevan en paralelo en el cribado primario. En este caso, la selección específica de compuestos con efectos dependen únicamente de los introducido 3 &#39;UTR será posible después de la proyección primaria eliminando la necesidad de la lucha contra el cribado. Sin embargo, la proyección paralela en dos líneas celulares se duplicará el ensayocostes. </li><li> Siguiendo el protocolo para la detección primaria (sección &quot;Día 1: Preparar y células de semillas&quot;), para cada &quot;golpe plato&quot; preparar tres placas de 96 pocillos de cada células estables CHP134-mycn3UTR y CHP134-CTRL. </li><li> Siguiendo el protocolo para la detección primaria (sección &quot;Día 2: tratar las células con Biblioteca Compuestos&quot;), utilice cada placa éxito para tratar tres CHP134-mycn3UTR y tres placas CHP134-CTRL a 2 mM concentración de trabajo. NOTA: Mientras que la pantalla del contador descrito aquí se realiza por triplicado a la dosis única de 2 M, podría ser beneficioso para sustituir las réplicas estándar y probar los hits en 3 concentraciones de 10 diluciones que van de 2 M a 20 nM. La aplicación de este enfoque no sólo permitiría para confirmar los datos de la pantalla primaria, sino también para obtener datos de dosis-respuesta preliminar sobre los accesos primarios, minimizar las tasas de falsos positivos. En este caso, un análisis de tuberías diferente debe ser aplied para procesar los datos experimentales y confirmar los resultados. </li><li> Siguiendo el protocolo para la detección primaria (sección &quot;Día 3: Realizar ensayo de luciferasa&quot;), medir la actividad luciferasa en todas las placas CHP134-mycn3UTR y CHP134-CTRL. </li><li> Siguiendo el protocolo para la detección primaria (sección &quot;Día 4: Análisis de datos&quot;), normalizar los datos experimentales de los pocillos tratados con la media de los controles tratados con vehículo en la placa y el cálculo de la media y la SD sobre repeticiones. Para cada compuesto ensayado, calcular las veces el cambio de la actividad luciferasa en CHP134-mycn3UTR vs. células CHP134-CTRL. Seleccione veces el cambio arbitrario cortes de de&gt; 1,5 y significación valores de p de &lt;0,01. NOTA: En la configuración de ensayo descritos el parámetro determinante de la especificidad de golpe es un doble cambio significativo de la actividad luciferasa en CHP134-mycn3UTR vs. células CHP134-CTRL. Si es necesario, también se podría evaluar la toxicidad compuesto realizando simultáneamente un ensayo de viabilidad celular en el SEcompuestos seleccionada. Esto podría ser especialmente beneficioso si los accesos primarios son contra-examinados en un análisis de respuesta a la dosis. Para una dosis única, nuestra experiencia indica una fuerte correlación de la reducción de la actividad de luciferasa con una disminución de la viabilidad celular 6. Por lo tanto, la disminución de la actividad de luciferasa en las células diana así como células de control se puede considerar como un indicador de la toxicidad del compuesto a la concentración ensayada. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3&#8217; UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based ...

Durante un largo período de regulación transcripcional de la expresión génica se cree que desempeñan un importante papel exclusivo, si no en el control de la producción de proteínas. La acumulación de pruebas, sin embargo, indica que la regulación post-transcripcional contribuye tanto como, si no más, que la regulación transcripcional para determinar la abundancia de proteínas celulares 1,2. El control post-transcripcional de la expresión génica es mucho más compleja y elaborada que estaba en primer pensamiento. De hecho, todas las diversas etapas de control post-transcripcional han surgido para ser regulada, incluyendo el procesamiento de ARNm, la localización, la rotación, la traducción 3, así como la metilación reversible de ARN recientemente descrita 4. Desde un número de procesos de regulación post-transcripcional potencialmente afectado, el ensayo descrito a continuación se centra en aquellos que involucran &#39;región no traducida (3&#39; UTR del mRNA 3). 3 &#39;UTR afecta ampliamente ARNm destino principalmente a través de la interacción específica de pr ARN vinculanteoteins y ARNs no codificantes a sus secuencias reguladoras y / o estructuras secundarias 5. Por lo tanto, las pequeñas moléculas que alteran estas interacciones o interfieren con las vías de transducción de señales de aguas arriba se desplazará el equilibrio que regula la abundancia de proteínas. Este enfoque terapéutico es de particular importancia para las patologías humanas para las que existan pruebas que muestran que los genes relevantes de la enfermedad son sometidos a la regulación post-transcripcional, lo que representa, pues, un objetivo potencial para la intervención farmacológica. Por lo tanto, los sistemas que permiten la detección de moduladores de los niveles de mRNA &#39;a través de la interferencia con los mecanismos de control post-transcripcional en un formato de alto rendimiento pueden llegar a ser herramientas valiosas en la identificación de nuevos tratamientos potenciales. El ensayo de gen indicador basado en células descrito permite la identificación de compuestos capaces de modular mRNA destino a través de mecanismos dependientes de su extremo 3 &#39;UTR. Consiste en varias c directorOMPONENTES (Figura 1) y requiere algunos pasos preliminares para validar la viabilidad del ensayo. En primer lugar, el constructo indicador está diseñado para incluir la UTR 3 &#39;de un gen de interés. La 3 &#39;UTR se fusiona con el extremo de un gen informador tal como luciferasa de luciérnaga (Figura 1). Cualquier cambio en los mecanismos de control post-transcripcional ejercidas a través de la insertado 3 &#39;UTR se alterar la estabilidad y / o eficacia de traducción de esta transcripción quimérico, resultando en niveles variados de luciferasa. Por lo tanto, los cambios en la actividad de luciferasa sirven como medida indirecta de la regulación post-transcripcional afectada del gen de interés. El segundo componente del sistema es un constructo indicador de control, un plásmido de expresión idéntica que expresa el mismo gen informador, pero que no contiene ningún 3 &#39;UTR. Los dos plásmidos informadores pueden ser diseñados en el laboratorio usando protocolos de biología molecular convencionales o adquirirse de fuentes comerciales. La selección de una línea celular apropiada es fundamental para la construcción de ensayo. ¿Qué línea celular es el modelo óptimo depende de numerosos factores que van desde los requisitos clínicos como semejanza máxima a la patología a cuestiones prácticas, como acaba de características disponibilidad, transfectability y crecimiento. Es importante destacar que, antes de proceder uno debe asegurarse de que la fusión de 3 &#39;UTR del gen reportero tiene un efecto esperado en el nivel de la transcripción quimérico. La ausencia de diferencia significativa en la señal de luciferasa a partir de la 3 &#39;UTR de soporte y control reportero construcciones transfectadas transitoriamente en las células seleccionadas indicaría que el 3&#39; UTR no es funcional en este modelo celular, lo que provocó para la búsqueda de los alternativos. Para el formato de alto rendimiento, los 3 &#39;UTR-cojinete y el control de luciferasa reportero construcciones deben integrarse de manera estable en la línea celular seleccionada. El uso de un integrado de forma estable sobre transfectadas transitoriamentelínea celular es preferible por varias razones. Esto ampliará la elección de un modelo celular incluyendo líneas de células difíciles de transfectar, disminuir la variabilidad en los datos derivados de las fluctuaciones en la eficiencia de la transfección, disminuir los costes. Por otra parte, sobre las células de transfección transitoria son muy a menudo sobrecargados con un plásmido de ADN que conduce a la saturación del sistema. En estas configuraciones un aumento adicional en la expresión reportero podría ser un reto, lo que resulta en una disminución de la sensibilidad hacia compuestos potenciales upregulating. Finalmente, cuando todos los componentes del ensayo se configuran, es fundamental antes de pasar al formato de alto rendimiento para determinar la viabilidad de la prueba, es decir, si la actividad de la luciferasa puede ser de hecho arriba y hacia abajo reguladas específicamente a través de la insertado 3 &#39; UTR. Los mejores controles serían pequeñas moléculas informado de modular la estabilidad o la traducibilidad del ARNm a través de UTR 3 &#39;de interés. Si tener estos esno es posible, se aceptan los controles de sustitución que imitan el efecto deseado. Estos podrían ser miRNAs o proteínas de unión al ARN conocidos para ejercer sus efectos mediante la unión a la 3 &#39;UTR de interés. Evaluación de dichos controles antes de la proyección primaria no sólo indica la funcionalidad del ensayo desarrollado, sino que también permite para la estimación de su rango dinámico, la sensibilidad y el rendimiento en el formato de alto rendimiento. Utilizando el protocolo descrito que exhibió una biblioteca 2000-compuesto 6. El neuroblastoma, el tumor sólido extracraneal más frecuente de la infancia, se utilizó como modelo biológico y el 3 &#39;UTR del oncogén MYCN, cuya amplificación predice fuertemente resultado adverso de neuroblastoma, como un gen diana 7. La figura 2 describe el diseño experimental. La proyección se dividió en tres carreras con el tamaño del lote de 27 placas proyectadas en una carrera. El lote de 27 placas de biblioteca incluye Spectrum CollectionPlacas n.1-n.8 + n.25 (primera pista), n.9-n.16 + n.25 (segundo plazo) y n.16-n.24 + n.25 (tercera pista), cada placa proyectó por triplicado. Por lo tanto, una placa de biblioteca (n.25) se ensayó en las tres carreras que hacen posible la comparación inter-run. El protocolo a continuación describe una sola corrida de 9 placas de bibliotecas analizadas por triplicado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Culture plate 96-well White</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6005688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6008190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">100 ml disposable trough for reagents</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td>10 613 048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">300 ml disposable robotic reservoir</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">PB12001301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 50&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Robot tips DITI 200&#956;L Sterile</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30038617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">3711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">ONE-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">RPMI</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-918F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">PBS-1X, w/o Ca++, Mg++</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:239px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">The Spectrum collection (compound library)</td>
			<td style="width:239px;">MicroSource Discovery Systems</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan Freedom EVO200 robot&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Tecan F200 multiplate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for chemical modulators of post-transcriptionally regulated genes

Tanto transcripcional y post-transcripcional regulación tienen un profundo impacto en los genes de expresión. Sin embargo, los ensayos de cribado basados ​​en células comúnmente adoptadas se centran en la regulación transcripcional, siendo destinado esencialmente a la identificación de moléculas promotoras de metas. Como resultado, los mecanismos post-transcripcionales se descubren en gran medida por el desarrollo de fármacos dirigidos expresión génica. Aquí se describe un ensayo basado en células destinado a investigar el papel de la &#39;región no traducida (3&#39; UTR del 3) en la modulación de la suerte de su ARNm, y en la identificación de compuestos capaces de modificarla. El ensayo se basa en el uso de un constructo informador de luciferasa que contiene el 3 &#39;UTR de un gen de interés integrado de manera estable en una línea celular relevante para la enfermedad. El protocolo se divide en dos partes, con el foco inicial en el cribado primario dirigido a la identificación de moléculas que afectan a la actividad de luciferasa después de 24 h de tratamiento. La segunda parte del protocolodescribe el contador de detección necesario discriminar compuestos que modulan la actividad de la luciferasa específicamente a través de la UTR 3 &#39;. Además del protocolo detallado y resultados representativos, proporcionamos consideraciones importantes sobre el desarrollo del ensayo y la validación de la exitosa (s) en la diana endógeno. El ensayo de gen indicador basado en células descrito permitirá a los científicos identificar moléculas que modulan los niveles de proteína a través de post-transcripcional mecanismos que dependen de un &#39;UTR 3.

Utilizando el enfoque descrito, que exhibió una biblioteca 2000-compuesto de moduladores potenciales de los mecanismos de control post-transcripcional ejercida a través de la 3 &#39;UTR del gen MYCN. La Figura 3 representa los resultados de la criba primaria ejemplificado por una sola placa biblioteca. Señal de luciferasa se muestra como porcentaje de controles tratados con vehículo se obtuvo mediante la medición de la actividad de luciferasa en placas por triplicado de células CHP134-myc...

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K vistas.  University of Trento. Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Video: High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Investigación

Biología

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Un ensayo de cribado para la identificación de moduladores fluorescente de canales GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperación de adultos de pez cebra Corazones para aplicaciones de alto rendimiento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Plataforma modular de selección automatizados de alto rendimiento de exopolisacáridos Junto con el análisis de carbohidratos de la huella digital de alta sensibilidad

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...