El proyecto fue apoyado por el NIH subvención U01HL098180 Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre o de los Institutos Nacionales de la Salud

1. Reactivos de configuración 1.1 disección y la imagen Mediano Medio L-15 de Leibovitz (L15) se complementa con FBS (10%) y penicilina-estreptomicina (100 unidades / ml de penicilina G sódica y 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) se utiliza tanto durante la cosecha y la formación de imágenes de muestras de tráquea. 2. Asamblea Cámara Cultura Walled Shallow La cámara se utiliza para mantener el tejido tráquea se muestra en la Figura 1. El suelo de la cámara es el cristal tocó fondo 35 mm de placa de cultivo. La parte superior y lateral de la cámara se genera mediante la colocación de una pequeña pieza de 0,3 mm de espesor láminas de silicona en el plato de cristal. El borde de la lámina se corta para encajar el plato de fondo redondo y el centro se recorta adicionalmente para formar una cámara central superficial (consulte los pasos 2.1 a 2.3). En la parte superior de este conjunto, un mm ronda cubreobjetos de vidrio 18 se coloca para generar un recinto adecuado para la imagen. <ol><li> Cubra completamente a mm ronda cubreobjetos 18 vidrio con un cuadrado de 0,3 mm de espesor láminas de silicona. </li><li> Con tijeras de disección afilados estándar recorte el exceso de láminas de silicona alrededor del borde de la hoja de la cubierta (que resulta en una capa circular de láminas de silicona). </li><li> Con un escalpelo afilado, recortar y eliminar una plaza central de láminas de silicona (aproximadamente 10 mm cuadrados) desde el centro de la hoja de la cubierta cubierta (formando así la parte superior y los lados de la cámara de imágenes). </li></ol> 3. Tráquea Cosecha y preparación <ol><li> La eutanasia a los ratones de conformidad con cuidado animal institucional local y utilizar comité y / o directrices gubernamentales y quitar la tráquea en un plástico de 35 mm de placa de cultivo estándar con medios suficientes L15 tejido a sumergir (autores han utilizado ratones justo antes del nacimiento en el día de gestación 16,5, a través animales recién nacidos, neonatal y adulto 2). </li><li> Quitar el tejido asociado no tráquea unida al exterior dela tráquea utilizando disección roma. </li><li> Retire la laringe con un corte transversal justo por debajo del cartílago cricoides con tijeras de disección micro (Figura 2, línea 1). </li><li> Quite las ramas bronquiales principales izquierdo y derecho con un corte transversal justo por encima de la carina con tijeras de disección micro (Figura 2A, línea 2). </li><li> Aplique suavemente la tráquea con unas pinzas finas y lave el lumen 2-3 veces con ~ 1 ml de medio que baña L15 con un Pipetman P1000 y P1000 punta para borrar cualquier moco y sangre. </li><li> Cortar un segmento de anillo de 3 a 4 de la tráquea con un corte transversal con tijeras de disección micro (Figura 2B, línea 1). </li><li> Cortar longitudinalmente a través del centro del músculo traqueal de este segmento de tráquea corta con tijeras de disección micro (Figura 2B, línea 2). </li><li> Cortar longitudinalmente a través del centro de los anillos cartilaginosos traqueales utilizando tijeras de disección micro (Figura 2C </strong&gt;, línea), dejando dos secciones de tejido traqueal adecuada para imágenes (una sola sección se muestra en la Figura 2D). </li></ol> 4. Imágenes Cilia <ol><li> Transferencia de segmentos de tejido de tráquea, secundarios lumen hacia abajo, sobre el medio de un mm de fondo de cristal placa de cultivo de 35 con 100-200 l de medio L-15. </li><li> Para cuantificar el flujo generado por los cilios añadir una pequeña cantidad de microesferas fluorescentes de 0,20 micras para el medio L-15 bañar la muestra de tejido tráquea (~ 1 x 10 11 partículas / ml o 20 l / ml de la suspensión de microesferas 2,5% acuosa Fluoresbrite). </li><li> Coloque la cámara de imágenes preparado previamente (Véase el Procedimiento 1-3 más arriba) en la parte superior de la muestra lado de la lámina de silicona tráquea hacia abajo, con la muestra de tráquea situado en el centro de la cámara de pared poco profunda formada por la ventana de corte en la lámina de silicona (Figura 1 ). </li><li> Empuje suavemente el cubreobjetos para asegurar en su lugar y retire cualquier exceso de L-15 medios de comunicación de la usin bordesga P1000 y P1000 punta Pipetman. </li><li> Monte el 35 mm con fondo de cristal placa de cultivo y muestra la tráquea en un microscopio invertido con la óptica 100X objetivos y DIC. </li><li> Utilizando una cámara de alta velocidad y software de adquisición de película recoge las películas de la motilidad ciliar a 200 + fotogramas por segundo a lo largo del epitelio traqueal ciliadas del ovillo borde del músculo traqueal (cuadro, E Figura 2D Esbozado: Ejemplo de una imagen fija del vídeo grabado) (Película complementario 1). </li><li> Utilizando imágenes de epifluorescencia con FITC y una cámara CCD con poca luz (Ver lista de equipo anterior), recoge películas de movimiento de microesferas fluorescentes en toda la superficie del epitelio traqueal ciliadas para permitir la cuantificación posterior de flujo generado cilios (Película complementaria 2). </li></ol> 5. La cuantificación de la motilidad de los cilios <ol><li> Cargar películas con imagen DIC en el paquete de software ImageJ y siguiendo la técnica descrita por Iain Drummond 13 utilice la herramienta de línea para dibujar una línea de trama que cruza el cilios. A &quot;Reslice&quot; de esta línea genera una imagen de tipo quimógrafo donde el movimiento de los cilios a través de la línea genera un patrón de onda. El número de píxeles entre cada pico de onda se les midió (un pixel = un fotograma de la película) de la cual se puede calcular el número de latidos por minuto (es decir Hz). </li><li> Para medir los cilios generado películas de cuentas fluorescentes de carga de flujo en el paquete de software ImageJ, y usar el plugin MTrackJ 14 para realizar un seguimiento de forma manual perlas fluorescentes través de la superficie de la tráquea epitelios y dejar que el software de generar la velocidad del grano y la direccionalidad para cada talón seguimiento. </li></ol> Se debe tener cuidado cuando se utiliza perlas fluorescentes para cuantificar el flujo como la distancia desde el cilios pueden influir fuertemente en la magnitud de flujo medida. El movimiento del talón en Suplementario Película 2 es un buen ejemplo de esto. En este ejemplo perlasel movimiento es rápido en la superficie de los cilios de latir y se reduce significativamente fuera de los granos más lejos en los medios de comunicación de baño. Para controlar esto, los trazados de talón sólo deben recogerse a una distancia fija por encima del epitelio ciliado en todas las muestras para permitir comparaciones correctas a realizar. Por último, para obtener datos representativos sobre el flujo de fluido, los granos deben ser rastreados por el mayor tiempo posible, preferimos utilizar pistas de talón que cubren las células ciliadas + 10 para el cálculo de flujo de fluido.

<ol>
	<li>Stannard, W., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+function+and+the+role+of+cilia+in+clearance.">Ciliary function and the role of cilia in clearance.</a> J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).</li><li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+and+maturation+of+cilia+generated+flow+in+the+newborn+and+postnatal+mouse+airway.">The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).</li><li>Aune, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+heterotaxy+with+single+ventricle+spectrum+of+cardiac+anomalies.">Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies.</a> Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).</li><li>Tan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotaxy+and+complex+structural+heart+defects+in+a+mutant+mouse+model+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia.</a> J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+sequencing+identifies+the+gene+Megf8+with+ENU-induced+mutation+causing+heterotaxy.">Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).</li><li>Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+scraping+in+diagnosing+ciliary+dyskinesia.">Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia.</a> Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).</li><li>Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+improving+the+diagnostic+approach.">Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach.</a> Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).</li><li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices.">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).</li><li>Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+3D+tissue+model+of+the+airway+wall+and+mucosa.">Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa.</a> Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cilia+in+zebrafish.">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations.">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li><li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia.">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li></ol>

Los autores tienen nada que revelar.

Medición de la frecuencia de batido ciliar (CBF) es relativamente fácil de usar objetivos de microscopio de alta potencia y rápida adquisición de imágenes de hardware 13,15, y explica por qué las mediciones CBF forman la base de la mayoría de los estudios de investigación de la depuración mucociliar en la salud y la enfermedad. Sin embargo, mientras que la medición CBF es esencial para la comprensión de la depuración mucociliar, la medición de la CBF solo hace caso omiso de la importancia subyace...

Análisis de la función de cilios móviles en la vía aérea epitelios experimentalmente es importante para dilucidar los factores genéticos y ambientales que pueden afectar a la salud y el aclaramiento mucociliar pulmonar 1. El simple protocolo desarrollado para la formación de imágenes con el ratón vías respiratorias epitelios proporciona un método eficiente para interrogar a las vías respiratorias en la motilidad de los cilios modelos mutantes y ratón knockout y requiere solamente habilidades básicas del ratón en la disección del tejido traqueal y la formación de imágenes ex vivo de las vías respiratorias con la motilidad de los cilios videomicroscopy alta resolución. Este protocolo fue creado y perfeccionado durante una pantalla de mutagénesis ratón a gran escala para permitir una rápida evaluación de la función de los cilios móviles (frecuencia de batido ciliar, la forma de batido ciliar, el flujo generado cilios) en los mutantes con cardiopatía congénita asociada a heterotaxy 2-5. Las técnicas actuales utilizadas para estudiar las vías respiratorias cilios motilidad se pueden agrupar en ya sea el tipo ex vivo aguda o lonplazo ger en los enfoques experimentales in vitro. Experimentos agudos incluyen la visualización ex vivo de nasales / vías respiratorias humanas biopsias cepillo 6,7 y el análisis de las secciones transversales de las vías respiratorias simples 8. Los enfoques in vitro utilizan varias técnicas de cultivo celular para generar hojas de epitelio ciliado diferenciadas tales como en cultivos líquidos de interfaz de aire o cultivos en suspensión las vías respiratorias 9-11. Sin embargo, estas técnicas reciliation epitelios de las vías respiratorias requieren una inversión muy significativa en el tiempo y la formación antes de que las células epiteliales ciliadas utilizables se producen para la experimentación (4-6 semanas 9,10). Mientras que el análisis ex vivo aguda de las vías respiratorias epiteliales biopsias cepillo se utilizan comúnmente para los estudios clínicos humanos, este método no se puede utilizar en los estudios del ratón exacerbado debido a la lesión tisular mecánico 12. La técnica descrita en este protocolo para el análisis de los memorandos de entendimientoe las vías respiratorias epitelio traqueal no sólo es sencillo de ejecutar, pero no requiere de habilidades especiales de disección ni cualquier equipo especializado además de los estándar para la formación de imágenes por videomicroscopía. Hay muchas ventajas de este protocolo simple. En primer lugar, como el ratón la cosecha de tejidos tráquea es rápida y fácil de realizar, que permite una evaluación rápida de la función de los cilios las vías respiratorias en un gran número de ratones. Esto puede incluir el análisis aguda de los efectos a corto plazo de diferentes tratamientos en in vitro. En segundo lugar, siendo una técnica ex vivo, el epitelio de las vías respiratorias ciliado permanece unido a él que subyace tejidos de soporte y por lo tanto retener vías de señalización celular asociadas. Por lo tanto, en comparación con las vías respiratorias in vitro reciliated epitelios, esta preparación es una mejor representación de la natural en el entorno de tejido vivo. En tercer lugar, este protocolo permite la adquisición de un número de diferentes parámetros cuantitativos que pueden proporcionar la evaluación objetiva de los cilios móviles función. Por último, en contraste con otros métodos actuales para las vías respiratorias cilios visualización, este protocolo permite la visualización de los cilios en ángulos rectos a la dirección de batido ciliar, permitiendo vista de perfil de los cilios que es óptima para obtener imágenes de alta resolución de batido ciliar y la generación de ondas metachronal . Este protocolo puede ser modificado en un número de maneras de abordar una amplia gama de necesidades experimentales tales como el papel de los agentes farmacológicos, factores genéticos, exposición ambiental, y / o factores mecánicos, tales como la carga de moco en las vías respiratorias y la función de los cilios generación / mantenimiento de los vías respiratorias batido ciliar y la propagación de ondas metachronal.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz's L-15 Medium </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>21083-027 </td>
 <td>No phenol red </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum </td>
 <td>Hyclone </td>
 <td>SH30088.03 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>15140-122 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x fine forceps </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-4976 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5676 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5620 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-9801-15 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 pipetman </td>
 <td>Gilson, Inc </td>
 <td>F123602 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 tips </td>
 <td>Molecular BioProducts </td>
 <td>2079E </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 mm round glass cover slips </td>
 <td>Fisher Scientific </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic 35 mm culture dishes </td>
 <td>Corning </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom 35 mm culture dishes </td>
 <td>Warner Instruments </td>
 <td>W3 64-0758 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick </td>
 <td>AAA Acme Rubber Co </td>
 <td>CASS-.012X36-63908 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.20 &mu;m diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td>
 <td>Polysciences </td>
 <td>09834-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters </td>
 <td>Lecia</td>
 <td>DMIRE2 </td>
 <td>Brand is not critical. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters</td>
 <td>Lecia </td>
 <td></td>
 <td>Brand is not critical.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope stage Incubator</td>
 <td>Lecia </td>
 <td>11521749 </td>
 <td>Not required if imaging cilia at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed camera bright field </td>
 <td>Vision Research </td>
 <td>Phantom v4.2 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 125 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed fluorescent camera </td>
 <td>Hamamatsu </td>
 <td>C9100-12 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 10 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Movie analysis software</td>
 <td>National Institutes of Health</td>
 <td>ImageJ with MtrackJ plugin</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

ex vivo method for high resolution imaging of cilia motility in rodent airway epithelia

Se ha establecido una técnica ex vivo para la imagen del ratón vías respiratorias epitelios para el análisis cuantitativo de la función de los cilios inmóviles importante para conocer a fondo la función mucociliar. Recién cosechada ratón tráquea se corta longitudinalmente a través del músculo traqueal y se monta en una cámara de paredes poco profundas en un plato con fondo de cristal. La muestra tráquea se coloca a lo largo de su eje largo para tomar ventaja del músculo traqueal a rizarse longitudinalmente. Esto permite formación de imágenes de movimiento ciliar en la vista de perfil a lo largo de toda la longitud traqueal. Videos en 200 cuadros / seg se obtienen utilizando microscopía de contraste diferencial de interferencia y una cámara digital de alta velocidad para permitir el análisis cuantitativo de la frecuencia de batido ciliar y la forma de onda ciliar. Con la adición de perlas fluorescentes durante la formación de imágenes, los cilios de flujo de fluido generada también se puede determinar. El tiempo de protocolo se extiende por aproximadamente 30 min, con 5 min para la preparación cámara, 5-10 min para la muestramontaje y 10-15 minutos para videomicroscopy.

Control de los cilios vía aérea debe ser claramente visible y visto de superar en forma coordinada (Película suplementario 1, la reproducción de películas es más lento que el tiempo real de 15%), con un flujo notable en la dirección del batido ciliar (Película Suplementario 2; reproducción de la película es 100% tiempo real). La cuantificación de las películas cilios debe producir resultados similares a la observada en la Figura 3. Colección de películas D...

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Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Se describe una técnica sencilla y fiable para la visualización y cuantificación de las vías respiratorias motilidad de los cilios y los cilios flujo generado a través del ratón tráquea. Esta técnica puede ser modificada para determinar cómo una amplia gama de factores que influyen en la motilidad de los cilios, incluyendo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposición ambiental, y / o factores mecánicos, tales como la carga de moco.

Método ex vivo de Imágenes de Alta Resolución de Motilidad Cilia en roedores las vías respiratorias epitelio

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

20.7K vistas.  University of Pittsburgh. Se describe una técnica sencilla y fiable para la visualización y cuantificación de las vías respiratorias motilidad de los cilios y los cilios flujo generado a través del ratón tráquea. Esta técnica puede ser modificada para determinar cómo una amplia gama de factores que influyen en la motilidad de los cilios, incluyendo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposición ambiental, y / o factores mecánicos, tales como la carga de moco.

Video: Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Las culturas de las células nerviosas de Aplysia para imágenes de alta resolución de los Conos de Crecimiento

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Investigación

Biología

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Vídeo de alta resolución de Seguimiento de la locomoción en adultos de Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparación, Imaging, y cuantificación de la superficie bacteriana Motilidad ensayos

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Mapeo espacio-temporal de la motilidad en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Preparaciones de los intestinos

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Una alta resolución Método de Seguimiento activación fosforilación dependiente de IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...