הפרויקט נתמך על ידי מענק NIH U01HL098180 מהלאומי ללב, ריאות ודם מכון. התוכן הוא באחריות בלעדית של כותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של הלאומי ללב, ריאות ודם מכון או המכונים הלאומי לבריאות

1. התקנת ריאגנטים 1.1 Dissection והדמיה בינוני L-15 בינוניות של ליבוביץ (L15) הוא השלים עם FBS (10%) ופניצילין, סטרפטומיצין (מ&quot;ל של פניצילין G נתרן ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של סטרפטומיצין סולפט 100 יחידות /) משמש גם במהלך המסיק וההדמיה של דגימות קנה נשימה. 2. עצרת לשכת תרבות רדודה מוקפת חומה התא נהג לקיים רקמה מקנה נשימה מוצג באיור 1. רצפת החדר היא זכוכית תחתית צלחת תרבות 35 מ&quot;מ. למעלה ובצד של החדר נוצרת על ידי הנחת פיסה קטנה של 0.3 יריעות סיליקון עבות מ&quot;מ על צלחת הזכוכית. שולי הגיליון הוא לחתוך כדי להתאים את צלחת תחתית העגולה והמרכז גזוז נוסף ליצירת חדר מרכזי רדוד (ראה שלבים 2.1-2.3). בחלק העליון של המכלול הזה, תלוש זכוכית עגול 18 מ&quot;מ כיסוי ממוקם כדי ליצור תא סגור מתאים להדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלוטין לכסות תלוש 18 מ&quot;מ עגול עם מכסה זכוכית מרובע של 0.3 יריעות סיליקון עבות מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים לנתיחה חדים רגילים לקצץ את יריעות סיליקון העודפים ממסביב לקצה של להחליק את המכסה (וכתוצאה מכך שכבה מעגלית של יריעות סיליקון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אזמל חד לחתוך ולהסיר מרובע של יריעות סיליקון (כ 10 מ&quot;מ מרובע) מאמצע להחליק את המכסה המכוסה (ובכך ליצור את החלק העליון והצדדים של חדר ההדמיה) מרכזית. </li></ol> 3. קציר והכנת קנה הנשימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים מקומי ולהשתמש בועדה ו / או הנחיות ממשלתיות ולהסיר קנה נשימה לתוך צלחת תרבות סטנדרטי פלסטיק 35 מ&quot;מ עם מספיק L15 תקשורת לרקמה לצלול (מחברים השתמשו בעכברים ממש לפני הלידה בהריון היום 16.5, ועד בעלי חיים יילוד, יילודים, ומבוגר 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרה של רקמה שאינה משויכת קנה הנשימה מחוברת לחלק החיצוני שלאת קנה הנשימה באמצעות נתיחה בוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגרון עם חתך רוחבי מתחת לסחוס cricoid באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 א, שורת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את סניפי הסימפונות העיקריים ימין ועל שמאל עם חתך רוחבי מעל קארינה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 א, שורת 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים עדינים ולשטוף את 2-3 פעמים עם הלום ~ 1 מ&quot;ל של מדיום הרחצה L15 עם Pipetman P1000 P1000 ועצה כדי לנקות את כל ריר ודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור את קטע 3-4 טבעת של קנה הנשימה באמצעות חתך רוחבי עם מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2, שורת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך longitudinally דרך אמצע שריר trachealis של קטע קצר זה קנה הנשימה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2, קו 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך longitudinally במרכז של טבעות הסחוס קנו נשימה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 ג </strong&gt;, קו), והשאיר את שני חלקים של קנה הנשימה רקמות מתאימות להדמיה (סעיף יחיד שמוצג באיור 2 ד). </li></ol> 4. ההדמיה cilia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגזרי העברה קנה נשימת רקמות, לוואי לומן למטה, אל אמצע צלחת 35 מ&quot;מ זכוכית תחתונה תרבות עם 100-200 μl של מדיום L-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את הזרימה שנוצרה ריסים להוסיף כמות קטנה של 0.20 מיקרומטר ניאון microspheres למדיום L-15 רחצה דגימת הרקמה מקנה נשימה (~ 1 x 10 11 חלקיקים / מ&quot;ל או 20 μl / מ&quot;ל של ההשעיה microsphere המימית Fluoresbrite 2.5%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את חדר ההדמיה שהוכן קודם לכן (ראה נוהל 1-3 לעיל) על גבי מדגם צד גיליון סיליקון קנה הנשימה למטה, עם מדגם קנה הנשימה הממוקם באמצע החדר המוקף חומה הרדוד שהוקם על ידי החלון חתוך ליריעות סיליקון (איור 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות מטה על coverslip כדי להבטיח מקום ובלהסיר כל L-15 תקשורת עודפת ממנצלים הקצוותGA P1000 קצה וP1000 Pipetman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר צלחת 35 מ&quot;מ הזכוכית התחתונה התרבות ומדגם קנה הנשימה במיקרוסקופ הפוכה עם אופטיקה 100X אובייקטיבית ודסק&quot;ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת רכישת סרט מצלמה ומהירות גבוהה לאסוף סרטים של תנועתיות ריסים ב 200 + פריימים לשנייה לאורך קנה הנשימה epithelia הריסים של מכורבל קצה של שריר trachealis (איור 2 ד מפורטים התיבה, E: ירושלים עדיין תמונה מסרט מוקלט) (סרט משלים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הדמיה epifluorescent FITC ואור נמוך מצלמת CCD (ראה רשימת ציוד למעלה), לאסוף סרטים של תנועת microsphere ניאון על פני ריסי epithelia קנה הנשימה על מנת לאפשר כימות מאוחר יותר של זרימה שנוצרה ריסים (משלים סרט 2). </li></ol> 5. Quantitation של תנועתיות צילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען סרטים צלמו דסק&quot;ש לחבילת תוכנת ImageJ ולאחר הטכניקה שתוארה על ידיעין דראמונד 13 להשתמש בכלי הקו למתוח קו סריקה חוצה את הריסים פועמים. &quot;Reslice&quot; של קו זה יוצר תמונה מסוג שבו רשם גלי תנועת ריסים מעבר לקו מייצרת דפוס גל. מספר הפיקסלים בין כל שיא גל נמדד (פיקסל אחד = מסגרת סרט אחד) שממנו ניתן לחשב את מספר הפעימות לדקה (כלומר הרץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד סרטי cilia תזרים עומס ניאון חרוז לתוך חבילת תוכנת ImageJ, ולהשתמש בתוסף MTrackJ 14 כדי לעקוב אחר אופן ידני חרוזי ניאון על פני השטח של epithelia קנה הנשימה ולתת לתוכנה ליצור מהירות ויווני חרוז לכל חרוז במעקב. </li></ol> יש להקפיד בעת שימוש בחרוזי ניאון לכמת זרימה כמו המרחק מהריסים פועמים חזק יכול להשפיע על עוצמת זרם נמדדת. תנועת חרוז בתוספת 2 סרט היא דוגמה טובה לכך. בדוגמה זו חרוזהתנועה היא מהירה על פני השטח של ריסי מכות ונושרים באופן משמעותי לחרוזים רחוקים יותר בתקשורת הרחצה. כדי לשלוט על זה, צריכים להיות שנאסף העתקי חרוז רק במרחק קבוע מעל epithelia הריסים בכל הדגימות על מנת לאפשר השוואה נכונה צריכה להתבצע. לבסוף, כדי לקבל נתונים יציגים בזרימת נוזל, חרוזים צריכים להיות במעקב במשך זמן רב ככל האפשר, אנחנו מעדיפים להשתמש בשירים חרוזים שמכסים תאי 10 + ריסים לחישוב זרימת נוזל.

<ol>
	<li>Stannard, W., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+function+and+the+role+of+cilia+in+clearance.">Ciliary function and the role of cilia in clearance.</a> J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).</li><li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+and+maturation+of+cilia+generated+flow+in+the+newborn+and+postnatal+mouse+airway.">The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).</li><li>Aune, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+heterotaxy+with+single+ventricle+spectrum+of+cardiac+anomalies.">Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies.</a> Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).</li><li>Tan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotaxy+and+complex+structural+heart+defects+in+a+mutant+mouse+model+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia.</a> J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+sequencing+identifies+the+gene+Megf8+with+ENU-induced+mutation+causing+heterotaxy.">Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).</li><li>Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+scraping+in+diagnosing+ciliary+dyskinesia.">Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia.</a> Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).</li><li>Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+improving+the+diagnostic+approach.">Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach.</a> Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).</li><li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices.">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).</li><li>Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+3D+tissue+model+of+the+airway+wall+and+mucosa.">Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa.</a> Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cilia+in+zebrafish.">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations.">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li><li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia.">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

מדידה של תדירות פעימת ריסים (CBF) היא קלה יחסית באמצעות מיקרוסקופ כוח מטרות גבוהות וחומרת רכישת תמונה מהירה 13,15, ומסבירה מדוע מדידות CBF מהוות את הבסיס של רוב המחקרים החוקרים אישור mucociliary בבריאות ובחוליים. עם זאת, בעוד CBF המדידה היא חיונית להבנת אישור mucociliary, מדידה ש?...

ניתוח של תפקוד ריסי ניעתי בepithelia הנשימה חשוב בניסוי להבהרת גורמים הגנטיים וסביבתיים שיכול להשפיע על אישור mucociliary ובריאות ריאתי 1. הפרוטוקול פשוט פיתחה להדמית עכבר הנשימה epithelia מספק שיטה יעילה לחקור את תנועתיות ריסי נשימה במודלים של עכברים שעברו מוטציה ונוקאאוט ודורש מיומנויות בסיסיות בלבד בנתיחת רקמות קנה הנשימה עכבר והדמיה vivo לשעבר של תנועתיות ריסי נשימה עם videomicroscopy ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה הוקם ומעודן במהלך מסך mutagenesis עכבר בקנה מידה גדול, כדי לאפשר הערכה מהירה של תפקוד ריסי ניעתי (תדירות פעימות ריסים, צורת פעימת ריסים, זרימה שנוצרה cilia) במוטנטים עם מחלת לב מולדת הקשורים heterotaxy 2-5. טכניקות קיימות בשימוש כדי ללמוד תנועתיות ריסי דרכי הנשימה יכולה להיות מקובצים או סוג vivo לשעבר החריף או לוןטווח גר במבחנת גישות ניסיוניות. ניסויים אקוטיים כוללים הדמיה vivo לשעבר של ביופסיות אדם מכחול האף / נשימה 6,7 וניתוח של סעיפי נשימה רוחביים פשוטים 8. במבחנת הגישות להשתמש בטכניקות של תרביות תאים שונות כדי ליצור גיליונות של epithelia מובחן ריסים כמו בתרבויות ממשק נוזלי אוויר או תרבויות השעיה נשימה 9-11. עם זאת, טכניקות הנשימה reciliation epithelia אלה דורשות השקעה משמעותית מאוד בזמן ובאימונים לפני כל תאי אפיתל ריסים שמישים מיוצרים לניסויים (4-6 שבועות 9,10). בעוד ניתוח vivo לשעבר חריף של ביופסיות מברשת אפיתל נשימה משמש בדרך כלל למחקרים קליניים בבני אדם, שיטה זו אינה שמישה במחקרי עכבר בשל החמירה פגיעה ברקמות מכאנית 12. הטכניקה שתוארה בפרוטוקול זה לניתוח של mousדואר קנה הנשימה דרכי הנשימה epithelia הוא לא רק פשוט לביצוע, אבל זה לא דורש כישורים מיוחדים ולא לנתיחה כל ציוד מיוחד מלבד אלו סטנדרטי להדמיה על ידי videomicroscopy. ישנם יתרונות רבים לפרוטוקול זה פשוט. ראשית, כפי שקציר הרקמה מקנה נשימת העכבר הוא מהיר וקל לביצוע, שהוא מאפשר להערכה מהירה של תפקוד ריסי נשימה במספר רב של עכברים. זה יכול לכלול ניתוח חריף של ההשפעות לטווח הקצרים של טיפולים שונים במבחנה. שנית, להיות טכניקת vivo לשעבר, אפיתל דרכי הנשימה הריסים נשאר קשור אליו שבבסיס רקמות תומכות ובכך לשמור על מסלולים הקשורים תא איתות. לכן בהשוואה במבחנת reciliated הנשימה epithelia, הכנה זו היא ייצוג טוב יותר של הסביבה הטבעית ברקמות גוף חייה. שלישית, פרוטוקול זה מאפשר רכישה של מספר הפרמטרים כמותיים שונים שיכול לספק הערכה האובייקטיבית של f ריסי ניעתימשיחה. לבסוף, בניגוד לשיטות קיימות אחרות לשם ויזואליזציה ריסי דרכי הנשימה, פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של הריסים בזווית ישרה לכיוון הכה הריסים, המאפשר צפייה בפרופיל של הריסים שהם אופטימלי להדמיה ברזולוציה גבוהה של פעימת ריסים ודור גל metachronal . פרוטוקול זה יכול להיות שונה במספר הדרכים לטפל במגוון רחב של צרכי ניסיוניים, כגון התפקיד של סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר על תפקוד דרכי הנשימה ריסים ודור / תחזוקה של קצב נשימה ריסים והתפשטות גלי metachronal.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz's L-15 Medium </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>21083-027 </td>
 <td>No phenol red </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum </td>
 <td>Hyclone </td>
 <td>SH30088.03 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>15140-122 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x fine forceps </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-4976 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5676 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5620 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-9801-15 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 pipetman </td>
 <td>Gilson, Inc </td>
 <td>F123602 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 tips </td>
 <td>Molecular BioProducts </td>
 <td>2079E </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 mm round glass cover slips </td>
 <td>Fisher Scientific </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic 35 mm culture dishes </td>
 <td>Corning </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom 35 mm culture dishes </td>
 <td>Warner Instruments </td>
 <td>W3 64-0758 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick </td>
 <td>AAA Acme Rubber Co </td>
 <td>CASS-.012X36-63908 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.20 &mu;m diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td>
 <td>Polysciences </td>
 <td>09834-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters </td>
 <td>Lecia</td>
 <td>DMIRE2 </td>
 <td>Brand is not critical. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters</td>
 <td>Lecia </td>
 <td></td>
 <td>Brand is not critical.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope stage Incubator</td>
 <td>Lecia </td>
 <td>11521749 </td>
 <td>Not required if imaging cilia at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed camera bright field </td>
 <td>Vision Research </td>
 <td>Phantom v4.2 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 125 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed fluorescent camera </td>
 <td>Hamamatsu </td>
 <td>C9100-12 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 10 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Movie analysis software</td>
 <td>National Institutes of Health</td>
 <td>ImageJ with MtrackJ plugin</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

ex vivo method for high resolution imaging of cilia motility in rodent airway epithelia

טכניקת הדמיה vivo לשעבר עכבר הנשימה epithelia לניתוח כמותי של תפקוד ריסי ניעתי חשוב לתובנה פונקצית אישור mucociliary כבר נקבע. שנקטפו זה עתה בעכבר קנה הנשימה היא לחתוך longitudinally דרך שריר trachealis ורכובה בתא מוקף חומה רדוד על צלחת זכוכית בעל תחתית. המדגם קנה הנשימה ממוקם לאורך הציר הארוך שלה כדי לנצל את היתרון של שריר trachealis להתכרבל longitudinally. זה מאפשר הדמיה של תנועת הריסים בתצוגת הפרופיל לאורך קנה הנשימה כולה. קטעי וידאו ב200 מסגרות / שני מתקבלים באמצעות מיקרוסקופ לעומת פער התערבות ומצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה, כדי לאפשר ניתוח כמותי של תדירות פעימת ריסים וצורת גל הריסים. עם התוספת של חרוזי ניאון במהלך הדמיה, גם ניתן לקבוע את זרימת נוזל ריסים שנוצרו. זמן הפרוטוקול משתרע על פני כ -30 דקות, עם 5 דקות לחדר הכנה, 5-10 דקות למדגםהרכבה, ובמשך 10-15 דקות videomicroscopy.

ריסי נשימה שליטה צריכים להיות לעין וראה להכות באופן מתואם (סרט משלים 1; צפייה בסרט מואטת עד 15% בזמן אמת), עם זרימה מורגשת בכיוון של קצב ריסים (סרט משלים 2; צפייה בסרט היא 100% בזמן אמת). Quantitation של סרטי cilia אמור להניב תוצאות דומות לזה שניתן לראות באיור 3.<...

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia at JoVE.com

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

ex-vivo-method-for-high-resolution-imaging-cilia-motility-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

20.7K Views.  University of Pittsburgh. טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו /...

Video: Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

מיפוי Spatiotemporal של תנועתיות ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תכשירים מהמעיים

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. Here, we present an easy and inexpensive method that would be instrumental for testing new drugs decreasing uterine contractility. This method utilizes the unique ability of the entire mouse reproductive tract to exhibit spontaneous motility when maintained ex vivo in a Petri dish containing oxygenated Krebs buffer. This spontaneous motility resembles the wave-like myometrial activity of the human uterus, referred to as endometrial waves. To demonstrate the effectiveness of the method, we employed a well-known uterine relaxant drug, epinephrine. We demonstrate that the spontaneous motility of the entire mouse reproductive tract can be quickly and reversibly inhibited by 1 &#181;M epinephrine in this Petri dish model. Documenting the changes of uterine motility can be easily done using an ordinary smart phone or a sophisticated digital camera. We developed a MATLAB-based algorithm allowing motion tracking to quantify spontaneous uterine motility changes by measuring the rate of uterine horn movements. A major advantage of this ex vivo approach is that the reproductive tract remains intact throughout the entire experiment, preserving all intrinsic intrauterine cellular interactions. The major limitation of this approach is that up to 10-20% of uteri may exhibit no spontaneous motility. Thus far, this is the first quantitative ex vivo method for assessing spontaneous uterine motility in a Petri dish model.

Uterine contractions are important for the well-being of females. However, pathologically increased contractility may result in dysmenorrhea, especially in younger females. Here, we describe a simple ex vivo preparation allowing quick assessment of the efficacy of smooth muscle relaxants that may be used for treating dysmenorrhea.

שיטה Vivo Ex להערכת בדרכי הרבייה של העכבר לתנועתיות ספונטנית מעקב הרחם MATLAB מבוסס על התנועה אלגוריתם לניתוח נתונים

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video