تم دعم المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح U01HL098180 من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد أو المعاهد الوطنية للصحة

1. إعداد الكواشف 1.1 تشريح والتصوير متوسطة وتستكمل L-15 متوسطة ليبوفيتش (L15) مع FBS (10٪)، والبنسلين، الستربتوميسين (100 وحدة / مل من البنسلين G الصوديوم و 100 ميكروغرام / مل من كبريتات الستربتوميسين) يستخدم على حد سواء أثناء الحصاد والتصوير من عينات القصبة الهوائية. 2. الضحلة المسورة الجمعية غرفة الثقافة يظهر غرفة تستخدم لعقد أنسجة القصبة الهوائية في الشكل 1. أرضية الغرفة هو الزجاج القاع 35 مم طبق الثقافة. يتم إنشاء ورأس الجانب من الغرفة عن طريق وضع قطعة صغيرة من 0.3 ملم الأغطية سيليكون سميكة على طبق زجاج. يتم قطع حافة الورقة لتناسب الطبق السفلي جولة وقلص المركز كذلك على تشكيل الغرفة المركزية الضحلة (انظر الخطوات 2،1-2،3). على رأس هذا التجمع، ويتم وضع 18 ملم جولة غطاء زجاجي زلة لإنشاء غرفة مغلقة مناسبة للتصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي كامل 18 ملم جولة زجاج الغطاء زلة مع مربع من 0.3 ملم الأغطية سيليكون سميكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع معيار مقص تشريح حاد تقليم قبالة الأغطية سيليكون الزائدة من حول حافة الغطاء زلة (مما أدى إلى طبقة دائرية من ألواح السيليكون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مشرط حاد قطع وإزالة الساحة المركزية من ألواح السيليكون (حوالي 10 مم مربع) من الوسط من انزلاق الغطاء مغطاة (وبالتالي تشكيل الجزء العلوي والجانبين من غرفة التصوير). </li></ol> 3. القصبة الهوائية الحصاد وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران وفقا لرعاية الحيوان المؤسسية المحلية واستخدام اللجنة و / أو المبادئ التوجيهية الحكومية وإزالة القصبة الهوائية إلى البلاستيك 35 مم طبق ثقافة معيار مع ما يكفي من L15 وسائل الإعلام إلى الأنسجة يغرق (قد استخدمت من الكتاب الفئران قبل الولادة في يوم من الحمل 16.5، وصولا إلى حديثي الولادة، الأطفال حديثي الولادة، والكبار الحيوانات 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غير القصبة الهوائية الأنسجة المرتبطة بها ثبتت على الجزء الخارجي منالقصبة الهوائية باستخدام تشريح حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحنجرة مع قطع عرضية أسفل الغضروف الحلقي باستخدام مقص تشريح الدقيقة (الشكل 2A، خط 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الفروع القصبية الأساسي الأيمن والأيسر مع قطع عرضية فقط فوق كارينا باستخدام مقص تشريح الدقيقة (الشكل 2A، سطر 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد بلطف القصبة الهوائية مع ملقط غرامة وتدفق التجويف 2-3 مرات مع ~ 1 مل من الاستحمام L15 المتوسطة مع Pipetman P1000 P1000 وتلميح لإلغاء تحديد أي المخاط والدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع جزء من حلقة 3-4 القصبة الهوائية باستخدام قطع عرضية مع مقص تشريح الدقيقة (الشكل 2B، خط 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع طولي خلال منتصف العضلات رغامية من هذا الجزء القصبة الهوائية قصيرة باستخدام مقص تشريح الدقيقة (الشكل 2B، سطر 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع طولي خلال منتصف الحلقات غضروف القصبة الهوائية باستخدام مقص تشريح الدقيقة (الشكل 2C </stroنانوغرام&gt;، خط)، وترك قسمين من القصبة الهوائية الأنسجة مناسبة للتصوير (مقطع واحد هو مبين في الشكل 2D). </li></ol> 4. التصوير أهداب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شرائح الأنسجة القصبة الهوائية، والجانب التجويف أسفل، على منتصف 35 مم أسفل الزجاج طبق الثقافة مع 100-200 ميكرولتر من L-15 متوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس التدفق ولدت أهداب إضافة كمية صغيرة من الفلورسنت 0.20 ميكرون المجهرية إلى المتوسطة L-15 الاستحمام عينة أنسجة القصبة الهوائية (~ 1 × 10 11 الجسيمات / مل أو 20 ميكرولتر / مل من Fluoresbrite 2.5٪ مائي التعليق المكروية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غرفة التصوير أعدت من قبل (انظر الإجراءات 1-3 أعلاه) على أعلى من السيليكون عينة القصبة الهوائية الجانبية ورقة أسفل، مع عينة القصبة الهوائية تقع في منتصف الدائرة الجدران الضحلة التي شكلتها نافذة يقتطع من الأغطية سيليكون (الشكل 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع بلطف إلى أسفل على ساترة لتأمين في مكان وإزالة أي فائض L-15 وسائل الاعلام من النقيب حوافGA P1000 P1000 طرف وPipetman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل أسفل الزجاج 35 مم طبق الثقافة وعينة القصبة الهوائية على مجهر مقلوب مع البصريات الهدف 100X ومدينة دبي للإنترنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام كاميرا عالية السرعة وفيلم برنامج الحصول على جمع الأفلام من حركية الأهداب في 200 + لقطة في الثانية على طول القصبة الهوائية ظهائر مهدبة من كرة لولبية من فوق حافة العضلات رغامية (الشكل 2D الوارد في الإطار، E: المثال لا تزال صورة من فيلم مسجل) (الفيلم تكميلية 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام التصوير epifluorescent FITC والإضاءة الخافتة CCD الكاميرا (انظر قائمة المعدات المذكورة أعلاه)، جمع أفلام الحركة المكروية الفلورسنت عبر السطح من ظهائر القصبة الهوائية مهدبة للسماح الكمي في وقت لاحق من أهداب تدفق ولدت (السينما التكميلية 2). </li></ol> 5. الكميات في القدرة على الحركة الأهداب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الأفلام المصورة في مدينة دبي للإنترنت حزمة البرامج يماغيج وبعد هذه التقنية التي وصفها أناعين دروموند 13 استخدام أداة خط لرسم خط النقطية عبور أهداب الضرب. A &quot;reslice&quot; من هذا الخط يولد نوع مخطاط التموج الصورة حيث حركة أهداب عبر خط يولد نمط الموجة. عدد وحدات البكسل بين كل ذروة الموجة لهم قياس (واحد بكسل = واحد إطار الفيلم) التي من خلالها عدد من نبضة في الدقيقة (أي هرتز) ويمكن بعد ذلك أن تحسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس تدفق أهداب ولدت تحميل الأفلام الفلورسنت حبة في حزمة البرمجيات يماغيج، واستخدام البرنامج المساعد MTrackJ 14 لتعقب يدويا الخرز الفلورسنت عبر السطح من القصبة الهوائية ظهائر والسماح للبرمجيات توليد سرعة حبة وتوجه لتعقب كل حبة. </li></ol> ينبغي توخي الحذر عند استخدام الخرز الفلورسنت لقياس التدفق والمسافة من أهداب الضرب يمكن أن تؤثر بقوة حجم التدفق المقاسة. حركة حبة في الفيلم التكميلي 2 هو خير مثال على ذلك. في هذا المثال حبةحركة سريعة على سطح أهداب الضرب ويسقط بشكل ملحوظ قبالة لحبات بعيدا في وسائل الإعلام الاستحمام. للسيطرة على هذا، يجب فقط أن تجمع اقتفاء أثر حبة على مسافة ثابتة فوق ظهائر مهدبة في جميع العينات للسماح المقارنات الصحيحة في هذا الشأن. وأخيرا، للحصول على بيانات ممثل على تدفق السوائل، ينبغي تتبع حبات لأطول فترة ممكنة، ونحن نفضل استخدام المسارات الخرزة التي تغطي الخلايا المهدبة 10 + لحساب تدفق السوائل.

<ol>
	<li>Stannard, W., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+function+and+the+role+of+cilia+in+clearance.">Ciliary function and the role of cilia in clearance.</a> J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).</li><li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+and+maturation+of+cilia+generated+flow+in+the+newborn+and+postnatal+mouse+airway.">The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).</li><li>Aune, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+heterotaxy+with+single+ventricle+spectrum+of+cardiac+anomalies.">Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies.</a> Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).</li><li>Tan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotaxy+and+complex+structural+heart+defects+in+a+mutant+mouse+model+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia.</a> J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+sequencing+identifies+the+gene+Megf8+with+ENU-induced+mutation+causing+heterotaxy.">Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).</li><li>Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+scraping+in+diagnosing+ciliary+dyskinesia.">Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia.</a> Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).</li><li>Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+improving+the+diagnostic+approach.">Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach.</a> Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).</li><li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices.">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).</li><li>Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+3D+tissue+model+of+the+airway+wall+and+mucosa.">Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa.</a> Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cilia+in+zebrafish.">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations.">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li><li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia.">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

قياس تردد فاز أهداب (البرازيلي) من السهل نسبيا باستخدام المجهر أهداف السلطة العليا وصورة سريعة الأجهزة اكتساب 13،15، ويفسر لماذا تشكل قياسات الاتحاد البرازيلي أساس معظم الدراسات التحقيق التخليص مخاطي هدبي أثناء الصحة والمرض. ومع ذلك، في حين أن قياس البرازيلي ضروري لفهم التخليص مخاطي هدبي، وقياس البرازيلي وحده يتجاهل أهمية الكامنة وراء كل الهدبية تدفق لدت وأهداب الموجي فوز، وكلاهما من الصعب قياس، غالبا ما يتم تجاهلها، وربما لم تكن متطابقة مع الاتحاد البرازيلي. وينظر مثال عن كيفية زيادة البرازيلي قد لا تتوافق مع زيادة تدفق ولدت الهدبية في بعض المرضى الذين يعانون من الطفرات DNAH11. DNAH11 هو داينين ​​بروتين سلسلة ثقيلة axonemal، والطفرات التي تم الإبلاغ عن تسبب كلا فرط الحركة (أسرع) فاز الهدبية وغير طبيعية أهداب فوز الموجي الذي يتوقع أن يسبب مشاكل مع التخليص مخاطي هدبي 16. وsignificaNT الاستفادة من بروتوكول لدينا هو أنه يتيح لرؤية سهلة للأهداب في زوايا الحق في اتجاه فوز أهداب، والسماح لمشاهدة الملف الشخصي للأهداب التي هي الأمثل للتصوير عالي الدقة من أهداب شكل ضربات وأهداب ولدت تدفق السوائل عبر سطح أهداب الضرب، مما يتيح المقارنة المباشرة من الاتحاد البرازيلي مع أهداب فوز الموجي و / أو أهداب ولدت تدفق ضمن عينة واحدة. ميزة أخرى لهذه التقنية هو أن أهداب في المقطوع حديثا القصبة الهوائية الاحتفاظ قدرتهم على الفوز بطريقة منسقة عبر السطح كله من ظهارة التنفسي، مما يتيح سهولة ارتباط بين الاتحاد البرازيلي ولدت تدفق أهداب. ولم يلاحظ مثل هذه الحركة الهدبية منسقة في reciliating الماوس الثقافات الظهارية القصبة الهوائية، والتي غالبا ما هدبي سيئة وتظهر فاز أهداب في اتجاهات عشوائية 9،10. فاز الهدبية منسقة لوحظ باستخدام تقنية ظهائر القصبة الهوائية وصفها هنا يمكن أن توفر وسيلة لطnterrogate آليات تنظيم ضربات الهدبية التنسيق ودوره المحتمل في إزالة مخاطي هدبي. فإن الجزء الأكثر تحديا من هذا البروتوكول للبحوث أن يكون إعداد القصبة الهوائية، بما في ذلك تبادل المعلومات من النسيج الضام والدهون من سطح القصبة الهوائية (الشكل 2A)، والقطع طوليا خلال منتصف العضلات رغامية (الشكل 2B، سطر 2). نجد استخدام جيد مقص تشريح الدقيقة أساسي لكلا المقاصة الأنسجة وtrachealisotomy اللاحقة. وعلاوة على ذلك، نجد أنه من الأسهل استخدام الجزء السفلي من القصبة الهوائية الأمامية فقط إلى كارينا حيث يتفرع القصبة الهوائية إلى الشعب الهوائية الأولية اليسار واليمين كما في عضلة رغامية هنا هو أوسع. ومع ذلك، مع خبرة كافية، أي طول القصبة الهوائية، أو في الواقع الشعب الهوائية الأولية يمكن أن تستخدم بنجاح لتوليد أفلام ذات جودة عالية من القدرة على الحركة وأهداب أهداب توليد التدفق. ممكن التقنيةالمشاكل المرتبطة بهذا البروتوكول وتشمل العينة القصبة الهوائية تتحرك أثناء التصوير و / أو العينة عدم القدرة على أن يقدموا إلى التركيز. كل من هذه المشاكل يمكن أن تنشأ إذا تم إضافة الكثير من L-15 مع العينة و / أو كان الغطاء غرفة التصوير زلة لا ضغط عليها بشكل آمن، وهذا يتسبب في عينة لتعويم داخل غطاء غرفة زلة مما أدى إلى حركة عينة أو نموذج العائمة فوق الطائرة التركيز مما يجعل من المستحيل التركيز. لتجنب هذا فمن المهم أن نحاول وتقليل كمية السائل المستخدم لتحميل كل عينة القصبة الهوائية. وإمكانية تحديد هذه التقنية هو أن قياس تدفق السوائل أهداب المولدة قد لا تتطابق تماما في النقل مخاطي هدبي الجسم الحي. لدينا الحقائق من تدفق أهداب ولدت من ~ 10 ميكرون / ثانية هو أقل بكثير من 100 ميكرون / ثانية النقل مخاطي هدبي ذكرت باستخدام الماوس في الجسم الحي القصبة الهوائية 17. هذا الاختلاف هو على الارجح بسبب أهداب يجري مغمورة في وسائل الإعلام كما OPPosed لتتحرك ببساطة طبقة رقيقة من المخاط عبر واجهة الهواء السائل. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له فائدة كبيرة للمقارنة النسبية من الحركة الهدبية بين عينات مختلفة. وتجدر الإشارة إلى أنه في حين أجريت هذه التقنية والبيانات التجريبية المقدمة هنا في درجة حرارة الغرفة، ودرجة الحرارة نفسها تلعب دورا هاما في تنظيم نشاط أهداب. وينظر الاتحاد البرازيلي في الإنسان عن طريق الأنف والقصبة الهوائية عينات لتكون مرتبطة خطيا مع درجة الحرارة بين 5-20 درجة مئوية، مع زيادة طفيفة في الاتحاد البرازيلي ينظر بين 20-45 ° C 18. ونحن نرى وجود علاقة مماثلة بين درجة الحرارة والبرازيلي في عينات مجرى الهواء الماوس (الملاحظات غير منشورة). وهكذا، في حين أننا نشاط أهداب سجل في درجة حرارة الغرفة لتقييم سريع للعيوب محتملة في حركية الأهداب في فئرانا معدلة وراثيا رواية، ونحن أيضا احتضان بعض العينات عند 37 درجة مئوية لتحديد نشاط أهداب في ظل الظروف الفسيولوجية. لإنجاز هذا المجهر القياسية CH حضانةالعنبر يمكن استخدامها للحفاظ على العينات عند 37 درجة مئوية. سوف تعديلات بسيطة على هذا البروتوكول جعلها أداة قوية لتقييم تنظيم نشاط أهداب مجرى الهواء من قبل مجموعة واسعة من العوامل مثل دور وكلاء الدوائية، ودرجة الحرارة، والعوامل الوراثية والتعرض لعوامل بيئية، و / أو عوامل ميكانيكية مثل الحمل المخاط على مجرى الهواء وظيفة الأهداب وتوليد / صيانة مجرى الهواء فاز أهداب.

تحليل وظيفة أهداب متحركة في مجرى الهواء ظهائر المهم تجريبيا لتوضيح العوامل الوراثية والبيئية التي يمكن أن تؤثر التخليص مخاطي هدبي والصحة الرئوية 1. بروتوكول بسيط وضعت لتصوير الماوس الهوائية ظهائر يوفر وسيلة فعالة لاستجواب مجرى الهواء حركية الأهداب في نماذج الماوس متحولة وخروج المغلوب، وتتطلب فقط المهارات الأساسية في الماوس القصبة الهوائية تشريح الأنسجة والتصوير فيفو السابقين من الشعب الهوائية أهداب حركية مع ارتفاع videomicroscopy القرار. أنشئ هذا البروتوكول وصقلها على نطاق واسع خلال شاشة الطفرات الماوس للسماح للتقييم السريع للوظيفة أهداب متحركة (تردد فاز أهداب، شكل فوز أهداب، الأهداب تدفق ولدت) في المسوخ مع أمراض القلب الخلقية المرتبطة توضع مغاير 2-5. ويمكن تصنيف التقنيات الحالية المستخدمة لدراسة مجرى الهواء حركية الأهداب إلى إما حادة السابقين نوع الجسم الحي أو LONGER المصطلح في مناهج تجريبية في المختبر. وتشمل التجارب الحادة التصور فيفو السابقين من الأنف / الهوائية الخزعات فرشاة الإنسان 6،7 وتحليل بسيط المقاطع الهوائية عرضية 8. النهج في المختبر استخدام مختلف تقنيات زراعة الخلايا لتوليد ورقة من ظهائر مهدبة متباينة مثل في الهواء واجهة الثقافات السائل أو مجرى الهواء الثقافات التعليق 9-11. ومع ذلك، هذه الهوائية ظهائر تقنيات reciliation تتطلب استثمارات كبيرة جدا في الوقت والتدريب قبل أن يتم إنتاج أي الخلايا الظهارية مهدبة صالحة للاستخدام لإجراء التجارب (4-6 أسابيع 9،10). في حين تحليل فيفو السابقين الحاد في مجرى الهواء الخزعات فرشاة الظهارية تستخدم عادة للدراسات اكلينيكية على البشر، وهذه الطريقة غير قابلة للاستخدام في دراسات الماوس بسبب تفاقم إصابة الأنسجة الميكانيكية 12. هذه التقنية المبينة في هذا البروتوكول لتحليل مذكرات التفاهمه القصبة الهوائية مجرى الهواء ظهائر ليست بسيطة فقط لتنفيذ، لكنه لا يتطلب مهارات خاصة ولا تشريح أي معدات متخصصة إلى جانب تلك القياسية للتصوير بواسطة videomicroscopy. هناك العديد من المزايا في هذا البروتوكول بسيطة. أولا، لأن الحصاد الأنسجة القصبة الهوائية الفأر هو سريعة وسهلة لتنفيذ، لأنها تتيح للتقييم السريع للمجرى الهواء وظيفة الأهداب في عدد كبير من الفئران. هذا ويمكن أن تشمل تحليل حاد من الآثار على المدى القصير من مختلف العلاجات في المختبر. ثانيا، كونه تقنية فيفو السابقين، يبقى ظهارة مهدبة مجرى الهواء مرفقة به الكامنة وراء الأنسجة الداعمة وبالتالي الاحتفاظ المرتبطة الخلية مسارات الإشارات. ولذلك بالمقارنة مع مجرى الهواء في المختبر reciliated ظهائر، هذا الإعداد هو تمثيل أفضل للبيئة الطبيعية في أنسجة الجسم الحي. ثالثا، يسمح هذا البروتوكول الاستحواذ على عدد من العوامل الكمية المختلفة التي يمكن أن توفر تقييما موضوعيا لمتحركة و أهدابمرهم. أخيرا، وعلى النقيض من الأساليب الحالية أخرى لمجرى الهواء التصور أهداب، وهذا البروتوكول يسمح لتصور من أهداب في زوايا الحق في اتجاه فوز أهداب، والسماح مشاهدة الملف الشخصي للأهداب التي هي الأمثل لتصوير عالية الدقة من فوز أهداب وتوليد موجة metachronal . هذا البروتوكول يمكن تعديلها في عدد من الطرق لمعالجة مجموعة واسعة من الاحتياجات التجريبية مثل دور وكلاء الدوائية، والعوامل الوراثية والتعرض لعوامل بيئية، و / أو عوامل ميكانيكية مثل الحمل المخاط على مجرى الهواء وظيفة الأهداب وتوليد / صيانة الهوائية أهداب فوز وmetachronal انتشار الموجات.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz's L-15 Medium </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>21083-027 </td>
 <td>No phenol red </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum </td>
 <td>Hyclone </td>
 <td>SH30088.03 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>15140-122 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x fine forceps </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-4976 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5676 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro dissection scissors </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-5620 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>Roboz </td>
 <td>RS-9801-15 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 pipetman </td>
 <td>Gilson, Inc </td>
 <td>F123602 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 tips </td>
 <td>Molecular BioProducts </td>
 <td>2079E </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 mm round glass cover slips </td>
 <td>Fisher Scientific </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic 35 mm culture dishes </td>
 <td>Corning </td>
 <td>430588 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom 35 mm culture dishes </td>
 <td>Warner Instruments </td>
 <td>W3 64-0758 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick </td>
 <td>AAA Acme Rubber Co </td>
 <td>CASS-.012X36-63908 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.20 &mu;m diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td>
 <td>Polysciences </td>
 <td>09834-10 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters </td>
 <td>Lecia</td>
 <td>DMIRE2 </td>
 <td>Brand is not critical. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters</td>
 <td>Lecia </td>
 <td></td>
 <td>Brand is not critical.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope stage Incubator</td>
 <td>Lecia </td>
 <td>11521749 </td>
 <td>Not required if imaging cilia at room temperature</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed camera bright field </td>
 <td>Vision Research </td>
 <td>Phantom v4.2 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 125 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed fluorescent camera </td>
 <td>Hamamatsu </td>
 <td>C9100-12 </td>
 <td>Brand is not critical. Must be faster than 10 fps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Movie analysis software</td>
 <td>National Institutes of Health</td>
 <td>ImageJ with MtrackJ plugin</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

ex vivo method for high resolution imaging of cilia motility in rodent airway epithelia

وقد أنشئت تقنية فيفو السابقين للتصوير الماوس الهوائية ظهائر للتحليل الكمي من أهداب متحركة وظيفة مهمة لنظرة ثاقبة وظيفة التخليص مخاطي هدبي. يتم قطع المقطوع حديثا الماوس القصبة الهوائية طوليا من خلال العضلات رغامية والتي شنت في غرفة الجدران الضحلة على طبق زجاج القاع. يتم وضع عينة القصبة الهوائية على طول محورها الطويل للاستفادة من العضلات رغامية إلى حليقة طوليا. وهذا يسمح التصوير من الحركة الهدبية في الملف الشخصي على طول القصبة الهوائية بأكملها. ويتم الحصول على أشرطة الفيديو في 200 لقطة / ثانية باستخدام التدخل التفاضلية المجهري التباين وعالية السرعة كاميرا رقمية للسماح التحليل الكمي من تردد ضربات أهداب والموجي الهدبية. مع إضافة الخرز الفلورسنت أثناء التصوير، وأهداب ولدت تدفق السوائل أيضا يمكن تحديده. الوقت بروتوكول يمتد ما يقرب من 30 دقيقة، مع 5 دقائق لإعداد غرفة، 5-10 دقيقة لعينةتصاعد مستمر، و 10-15 دقيقة للvideomicroscopy.

يجب أن يكون التحكم الهوائية أهداب مرئية وينظر للفوز بطريقة منسقة (الفيلم التكميلي 1؛ وتباطأ تشغيل الفيلم إلى الوقت الحقيقي 15٪) بشكل واضح، مع تدفق ملحوظ في اتجاه فوز أهداب (الفيلم التكميلي 2؛ تشغيل الفيلم هو 100٪ الوقت الحقيقي). تحديد الكميات من الأفلام أهداب ينبغي أن تسفر نتائج مماثلة لتلك التي شوهدت في الشكل 3. مجموعة من الأفلام DIC عالية السرعة يجعل من الممكن تحديد مقدار تردد فاز أهداب (الشكل 3C) ويعطي صورا جيدة للتقييم النوعي للشكل فوز أهداب، في حين أن تتبع من الخرز الفلورسنت يسمح لقياس سرعة تدفق أهداب ولدت (الشكل 3D) والاتجاهية (الشكل 3E). نحن نستخدم الاتجاهية لإعطاء مؤشر تدفق الخطية. يتم احتساب الاتجاهية بقسمة مجموع الإزاحة التي تقطعها الفلورسنت حبة (أي أقصرالمسافة بين بداية ونهاية نقاط من تتبع) من خلال المسافة يتحرك حبة فلوري خلال التتبع كله. وبالتالي، فإن حبة فلوري تتحرك في خط مستقيم يكون اتجاهها واحد في حين أن حبة فلوري التعرجات على نطاق واسع من صراط مستقيم سيكون لها الاتجاهية أقل بكثير من 1. لقد التقط عينات لمدة تصل إلى ساعة واحدة مع أي تغيير ملحوظ في وظيفة فاز أهداب. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50343/50343fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50343/50343fig1.jpg" /> الشكل 1. عرض متساوي القياس الموسع للثقافة إعداد طبق والقصبة الهوائية عينة لتحديد المواقع. NB: يجب أن يتم تجميعها ورقة ساترة والسيليكون قبل وضع العينة القصبة الهوائية في طبق الثقافة. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="4.25in"FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50343/50343fig2highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50343/50343fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2. مثال على القصبة الهوائية تشريح الماوس باستخدام هذا البروتوكول، ابتداء من القصبة الهوائية سليمة (A) إلى النتيجة النهائية المصورة (E) (انظر إجراء الخطوات من 3،2-3،8 لشرح من التسميات). أشرطة النطاق في AD تمثل 500 ميكرون. شريط النطاق في E يمثل 25 ميكرون. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5.4in" fo:src="/files/ftp_upload/50343/50343fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50343/50343fig3.jpg" /> الشكل (3). النتائج المتوقعة التي تم الحصول عليها باستخدام الماوس نوع البرية القصبة الهوائية عينة من إعداد بروتوكول الموصوفة هنا. (A) إطار واحدة من فيلم DIC عالية السرعة (انظر فيلم تكميلية 1 لفيلم DIC ممثل). (B) مسارات حركة أربع حبات الفلورسنت عبر المعالم من عينة ظهائر القصبة الهوائية (انظر تكميلية الفيلم 2 للفيلم الفلورسنت ممثل). (C) تردد ضربات الأهداب كميا من مدينة دبي للإنترنت عالية السرعة أفلام حركية الأهداب (ن = 41 قياسات نقطة عشوائية من 6 القصبات الماوس). (D) سرعة التدفق و (E) الاتجاهية تدفق كميا من تتبع حركة حبة فلوري عبر السطح من عينات ظهائر القصبة الهوائية (ن = 31 اقتفاء أثر حبة فلوري من 6 القصبات الماوس). تم تهجير البيانات كما يعني ± SEM. أشرطة النطاق 10 ميكرون. تكميلية الفيلم 1. فيلم DIC تظهر أهداب شكل ضربات وتدفق أهداب ولدت لوحظ باستخدام الماوس wildtype القصبة الهوائية عينة. وقد تم جمع الفيلم في 200 إطارا في الثانية، بينما هو تشغيل 30 إطارا في الثانية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50343/50343movie1.mov" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة الفيلم</a> . تكميلية فيلم 2. الفيلم من أهداب جنرال الكتريكتدفق nerated عبر الماوس القصبة الهوائية عينة wildtype باستخدام 0.20 ميكرون المجهرية الفلورسنت والمجهري epifluorescent. جمع الفيلم والمسرحية هو عودة 15 إطارا في الثانية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50343/50343movie2.mov" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة الفيلم</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia at JoVE.com

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

يوصف أسلوب سهل وموثوق بها لتصور وقياس حركية الهوائية أهداب أهداب وتدفق تم إنشاؤها باستخدام الماوس القصبة الهوائية. يمكن تعديل هذه التقنية لتحديد كيف يمكن لمجموعة واسعة من العوامل التي تؤثر على حركية الأهداب، بما في ذلك وكلاء الدوائية، والعوامل الوراثية والتعرض لعوامل بيئية، و / أو عوامل ميكانيكية مثل الحمل المخاط.

طريقة السابقين فيفو التصوير عالية الدقة في القدرة على الحركة الأهداب في القوارض مجرى الهواء الظهارة

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

ex-vivo-method-for-high-resolution-imaging-cilia-motility-rodent

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

20.7K Views.  University of Pittsburgh. يوصف أسلوب سهل وموثوق بها لتصور وقياس حركية الهوائية أهداب أهداب وتدفق تم إنشاؤها باستخدام الماوس القصبة الهوائية. يمكن تعديل هذه التقنية لتحديد كيف يمكن لمجموعة واسعة من العوامل التي تؤثر على حركية الأهداب، بما في ذلك وكلاء الدوائية، والعوامل الوراثية والتعر...

Video: Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

الخلية العصبية من الثقافات Aplysia عن التصوير عالية الدقة من المخاريط النمو

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

رواية<em&gt; خارج الحي</em&gt; الطريقة الثقافة لالجنينية القلب

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

التحضير والتصوير، والكمي لالسطحية الجرثومي على الحركة فحوصات

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

رسم الخرائط الزمانية المكانية في القدرة على الحركة في<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الاستعدادات للأمعاء

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

A عالية الدقة الطريقة لرصد تفعيل الفسفرة التي تعتمد من IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...