Proje, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü NIH hibe U01HL098180 tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kalp, Akciğer resmi görüşlerini temsil etmez, ve Kan Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri

1. Reaktifler Kurulum 1.1 Diseksiyon ve Görüntüleme Orta Leibovitz L-15 ortamına (L15) trakea örneklerin hasat hem de görüntüleme sırasında kullanılan FBS (% 10) ve Penisilin-Streptomisin (100 birim / penisilin G sodyum ve streptomisin sülfat, 100 mg / ml arasında mi) ile ilave edilir. 2. Sığ Kaleli Kültür Odası Meclis Trakea doku tutmak için kullanılan haznesi Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Odanın zemini cam 35 mm kültür çanak dip olduğunu. Odasının üst ve yan cam tabak içinde 0.3 mm kalınlığında silikon kaplama küçük bir parça yerleştirilerek oluşturulur. Sayfanın kenarı yuvarlak alt çanak uyacak şekilde kesilir ve merkez daha (adım 2.1-2.3 bakınız) sığ bir merkezi oda oluşturmak için kesilir. Bu montaj üzerine, bir 18 mm yuvarlak cam kapak kayma görüntüleme için uygun bir kapalı odasına oluşturmak için yerleştirilir. <ol><li> Tamamen 0,3 mm kalınlığında silikon kaplama bir kare ile bir 18 mm yuvarlak cam kapak kayma kapsamaktadır. </li><li> Standart keskin diseksiyon makas kapak kayma (silikon kaplama dairesel bir tabaka ile sonuçlanan) kenarında gelen aşırı silikon kaplama keserek ile. </li><li> Keskin bir neşter kesip ve kapalı kapak kayma (böylece görüntüleme odasının üst ve yan oluşturan) ortasından silikon kaplama (yaklaşık 10 mm kare) merkezi bir kare kaldırmak ile. </li></ol> 3. Trakea Hasat ve Hazırlık <ol><li> Yerel kurumsal hayvan bakımı uygun olarak fareler Euthanize ve komite ve / veya hükümet yönergeleri izleyin ve batığın doku kadar L15 medya (yazar kadar, sadece gebelik gün 16,5 doğum önce fareler kullanmış olan standart bir plastik 35 mm kültür çanak içine trakea çıkarın , yeni doğan yenidoğan ve yetişkin hayvanların 2). </li><li> Dış bağlı olmayan trakea ilişkili doku çıkarmakkünt diseksiyon kullanarak trakea. </li><li> Sadece mikro diseksiyon makas (Şekil 2A, hat 1) kullanarak krikoid kıkırdak altında enine kesim ile gırtlak çıkarın. </li><li> Mikro diseksiyon makas (Şekil 2A, hat 2) ile sadece karina üzerinde enine kesim ile sol ve sağ ana bronş dalları çıkarın. </li><li> Yavaşça ince forseps ile trakea tutun ve herhangi bir mukus ve kan temizlemek için bir P1000 Pipetman ve P1000 ucu ile banyo L15 orta ~ 1 ml lümen 2-3 kez yıkayın. </li><li> Mikro diseksiyon makas (Şekil 2B, hat 1) ile enine bir kesik ile trakea bir 3-4 halka kesimi kesin. </li><li> Mikro diseksiyon makas (Şekil 2B, hat 2) kullanarak bu kısa trakea segmentinin trachealis kas ortasından uzunlamasına kesin. </li><li> Mikro diseksiyon makas (Şekil 2C kullanarak trakea kıkırdak halkaları ortasından uzunlamasına kesilir Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi) terk&gt;, çizgi). </li></ol> 4. Kirpikler Görüntüleme <ol><li> Transferi trakea doku parçaları, L-15 orta 100-200 ul ile 35 mm cam alt kültür çanak ortasında üzerine aşağı lümen tarafı,. </li><li> Kirpikler oluşturulan akış trakea doku örneği (1 x 10 ~ 11 partikül / ml ya da 2.5% sulu Fluoresbrite Mikro-kürecik süspansiyonu, 20 ul / ml), yıkanan L-15 ortamına floresan 0.20 um arasında bir miktar mikro eklemek ölçmek için kullanılabilir. </li><li> Silikon kaplama oyulmuş pencere oluşturduğu sığ duvarlı odanın ortasında bulunan trakea örnek ile, görüntüleme odasının aşağı trakea örnek silikon levha tarafında üzerine (yukarıda 1-3 Usul bakınız) önceden hazırlanmış yerleştirin (Şekil 1 .) </li><li> Yavaşça yerine sabitlemek için lamel aşağı doğru itin ve kenarları istimal emdiği L-15 ortamı çıkarınga P1000 ucu ve P1000 Pipetman. </li><li> 100X objektif ve DIC optik ile bir ters mikroskop 35 mm cam alt kültür çanak ve trakea örnek monte edin. </li><li> Yüksek hızlı bir kamera ve film satın alma yazılımı kullanarak 200 kirpikler motilite film toplamak + en siliyalı trakeal epitel boyunca saniye başına kare (Şekil 2D kutusu, E Outlined: Kayıtlı filmden örnek hareketsiz görüntü) trachealis kas kenarı kıvrılmış (Ek Film 1). </li><li> FITC epifluorescent görüntüleme ve düşük ışık CCD kamera (Yukarıdaki donanım listesine bakın) kullanarak, kirpikler oluşturulan akış (Ek Movie 2) daha sonra miktar izin vermek için siliyalı trakeal epitel yüzeyi boyunca floresan mikro-hareketin film toplamak. </li></ol> 5. Cilia Motilite kantitasyonu <ol><li> ImageJ yazılım paketi içine DIC görüntülü film yüklemek ve I tarafından tarif edilen teknik takip edilmekain Drummond 13 yenerek kirpikler geçen bir raster çizgi çizmek için satırı aracını kullanın. Bu hattın bir &quot;reslice&quot; hat boyunca kirpikler hareketi bir dalga üreten bir kymograph tipi görüntü oluşturur. Her dalga tepe arasındaki piksel sayısı onları ölçülen (bir piksel = bir film karesini) dakikada atım (yani Hz) sayısı hesaplanabilir hangi değil. </li><li> ImageJ yazılım paketi içine kirpikler oluşturulan akış yük floresan boncuk film ölçmek ve el trakea epitel yüzeyi boyunca floresan boncuk izlemek ve yazılım izlenen her boncuk için boncuk hız ve yön oluşturmak izin MTrackJ eklenti 14 kullanın. </li></ol> Dayak kirpikler mesafe olarak akışını ölçmek için güçlü ölçülen akış büyüklüğü etkileyebilir floresan boncuk kullanırken dikkat edilmelidir. Ek Film 2 boncuk hareketi bu bir iyi bir örnektir. Bu örnekte boncuktahareket dayak kirpikler yüzeyinde hızlı ve önemli ölçüde daha uzakta banyo medyada boncuk için devre dışı bırakır. Bu kontrol etmek için, boncuk iz tek doğru karşılaştırma yapılmasına izin vermek için bütün örneklerde silli epitel üzerinde sabit bir mesafede toplanmalıdır. Son olarak, sıvı akışı temsil verilerini elde etmek, boncuk mümkün olduğunca uzun süre için takip edilmelidir, biz sıvı akışı hesaplamak için 10 + siliyalı hücreleri kapsayacak boncuk parça kullanmayı tercih.

<ol>
	<li>Stannard, W., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+function+and+the+role+of+cilia+in+clearance.">Ciliary function and the role of cilia in clearance.</a> J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).</li><li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+and+maturation+of+cilia+generated+flow+in+the+newborn+and+postnatal+mouse+airway.">The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).</li><li>Aune, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+heterotaxy+with+single+ventricle+spectrum+of+cardiac+anomalies.">Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies.</a> Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).</li><li>Tan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotaxy+and+complex+structural+heart+defects+in+a+mutant+mouse+model+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia.</a> J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+sequencing+identifies+the+gene+Megf8+with+ENU-induced+mutation+causing+heterotaxy.">Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).</li><li>Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+scraping+in+diagnosing+ciliary+dyskinesia.">Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia.</a> Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).</li><li>Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+improving+the+diagnostic+approach.">Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach.</a> Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).</li><li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices.">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).</li><li>Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+3D+tissue+model+of+the+airway+wall+and+mucosa.">Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa.</a> Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).</li><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells:+selection+of+a+proliferative+population.">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cilia+in+zebrafish.">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+cell+and+particle+tracking.">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations.">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li><li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia.">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kirpikler yendi frekans ölçümü (CBF) yüksek güç mikroskobu amaç ve hızlı görüntü elde etme donanım 13,15 kullanarak nispeten kolaydır, ve CBF ölçümleri sağlık ve hastalık sırasında mukosiliyer klerens araştıran en çalışmaların temelini oluşturan açıklıyor. CBF ölçüm tek başına CBF mukosiliyer temizleme, ölçüm anlamak için gereklidir Ancak, siliyer oluşturulan akış ve ölçmek için daha zor genellikle göz ardı edilir, her ikisi de kirpikler yendi dalga, hem de te...

Hava yolu epitel içinde hareketli kirpikler fonksiyon analizi mukosiliyer temizleme ve akciğer sağlığı 1 etkileyebilir genetik ve çevresel faktörlerin ortaya çıkması için deneysel önemlidir. Görüntüleme fare havayolu epitel için geliştirilen basit bir protokol mutant ve nakavt fare modellerinde hava yolu kirpikler motilite sorgulamak için etkili bir yöntem sağlar ve fare trakeal doku diseksiyonu ve yüksek çözünürlüklü videomikroskopi ile hava yolu kirpikler motilite ex vivo görüntüleme sadece temel becerileri gerektirir. Bu protokol heterotaksi 2-5 ile ilişkili konjenital kalp hastalığı olan mutantlar hareketli kirpikler fonksiyonunun hızlı değerlendirme (kirpikler yendi frekans, kirpikler yendi şekli, kirpikler oluşturulan akış) izin vermek için büyük çaplı bir fare mutagenez ekran sırasında kurulan ve rafine oldu. Havayolu kirpikler hareketliliği incelemek için kullanılan mevcut tekniklerin akut ex vivo türü veya boylam ya toplanabilirin vitro deneysel yaklaşımlar ger terim. Akut deneyler ex vivo insan burun / hava yolu fırça biyopsi görselleştirme 6,7 ve basit enine havayolu bölüm 8 analizini içerir. In vitro yaklaşımlar, hava sıvı arayüzü kültürler ya da hava yolu süspansiyon kültürleri 9-11 gibi farklı siliyalı epitel yaprak oluşturmak için çeşitli hücre kültürü teknikleri kullanmaktadır. Herhangi bir kullanılabilir siliyalı epitel hücreleri deney (4-6 hafta 9,10) için üretilen önce Ancak, bu hava yolu epitel reciliation teknikleri zaman ve eğitim çok önemli bir yatırım gerektirir. Solunum yolu epitel fırça biyopsilerin akut ex vivo analiz yaygın insan klinik çalışmalar için kullanılır, bu yöntem şiddetlenir mekanik doku yaralanması 12 bağlı fare çalışmalarda kullanılabilir değildir. Mutabakatnamelere analizi için bu protokolde belirtilen tekniğiE trakea hava yolu epitel çalıştırmak için sadece basit değildir, ama özel bir diseksiyon becerileri ne videomikroskopi tarafından görüntüleme için bu standart dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez. Bu protokol için pek çok avantajı vardır. Fare trakea doku hasat gerçekleştirmek için hızlı ve kolay olduğu gibi, önce, farelerin, çok sayıda hava yolu kirpikler fonksiyonu hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için izin verir. Bu in vitro tedavi farklı kısa vadeli etkileri akut analizi içerebilir. İkinci olarak, bir ex vivo tekniği olan, siliyalı hava yolu epitel bu destek dokularını altta yatan bağlı kalır ve böylece ilgili hücre sinyal yolları korumak. Bu nedenle in vitro reciliated solunum yolu epitel hücrelerinde ile karşılaştırıldığında, bu hazırlık vivo doku ortamda doğal daha iyi bir temsilidir. Üçüncü olarak, bu protokol sağlayan hareketli kirpikler f değerlendirilmesini sağlar farklı kantitatif bir dizi parametre edinimimerhem. Son olarak, havayolu kirpikler görselleştirme için diğer mevcut yöntemlerle aksine, bu protokol kirpikler yendi yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve metachronal dalga üretimi için en uygun olan kirpikler Profil görünümü sağlayan, kirpikler yendi yönüne dik açılarda kirpikler görselleştirme sağlar . Bu protokol, farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya hava yolu kirpikler fonksiyonu ve üretim / bakım gibi mukus yük gibi mekanik faktörlerin rolü deneysel ihtiyaçlarını geniş bir yelpazede ele yolları bir dizi değiştirilebilir havayolu kirpikler yendi ve metachronal dalga yayılımı.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 Medium </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>No phenol red </td></tr><tr><td>Fetal bovine serum </td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x fine forceps </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>Micro dissection scissors </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel </td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman </td><td>Gilson, Inc</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P1000 tips </td><td>Molecular BioProducts</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18 mm round glass cover slips </td><td>Fisher Scientific</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Plastic 35 mm culture dishes </td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom 35 mm culture dishes </td><td>Warner Instruments</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>Silicone sheet 0.012&quot; (0.3 mm) thick </td><td>AAA Acme Rubber Co</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0.20 &amp;mu;m diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td><td>Polysciences</td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters </td><td>Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>Brand is not critical. </td></tr><tr><td>100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters</td><td>Lecia</td><td></td><td>Brand is not critical.</td></tr><tr><td>Microscope stage Incubator</td><td>Lecia</td><td>11521749</td><td>Not required if imaging cilia at room temperature</td></tr><tr><td>High-speed camera bright field </td><td>Vision Research</td><td>Phantom v4.2</td><td>Brand is not critical. Must be faster than 125 fps</td></tr><tr><td>High-speed fluorescent camera </td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-12</td><td>Brand is not critical. Must be faster than 10 fps</td></tr><tr><td>Movie analysis software</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ with MtrackJ plugin</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo method for high resolution imaging of cilia motility in rodent airway epithelia

Mukosiliyer temizleme fonksiyonu içgörü için önemli hareketli kirpikler fonksiyonunun kantitatif analiz için görüntüleme fare havayolu epitel için bir ex vivo tekniği kurulmuştur. Taze hasat fare trakea trachealis kas ile uzunlamasına kesilir ve cam dipli çanak sığ bir duvarlı odasında monte edilir. Trakea örnek uzunlamasına kıvrılmasına trachealis kas yararlanmak için uzun ekseni boyunca konumlandırılmış. Bu tüm trakea uzunluğu boyunca profil görünümünde siliyer hareket görüntüleme sağlar. 200 kare / sn video kirpikler yendi frekans ve siliyer dalga kantitatif analiz sağlamak için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ve bir yüksek hızlı dijital fotoğraf makinesi kullanılarak elde edilir. Görüntüleme sırasında floresan boncuk eklenmesiyle, kirpikler üretilen sıvı akışı da belirlenebilir. Protokol süresi odası hazırlanması için 5 dakika ile yaklaşık 30 dakika,, örnek için 5-10 dakika açıklıklımontaj ve videomikroskopi için 10-15 dk.

Film oynatma% 100; kirpikler yendi (Ek Film 2 yönünde fark akışı ile; Kontrol havayolu kirpikler açıkça görülebilir ve koordineli bir şekilde (film oynatma 15% gerçek zamanlı için yavaşlar Ek Film 1) yenmek için görülen olmalıdır ) gerçek zamanlı. Kirpikler film kantitasyonu, Şekil 3&#39;te görülen benzer sonuçlar vermesi gerekir. Floresan boncuk izleme kirpikler oluşturulan akış hızı ölçümü (Şekil 3D) sağlar ise yü...

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia at JoVE.com

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

ex-vivo-method-for-high-resolution-imaging-cilia-motility-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

20.7K Görüntüleme.  University of Pittsburgh. Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.

Video: Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Nörobilim

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. Multiphoton microscopy (MPM) has become one of the most popular imaging modalities for biomedical study at cellular levels in vivo, advantages include high resolution, deep tissue penetration and minimal phototoxicity. We have designed an MPM imaging platform with a customized mouse eye holder and a stereotaxic stage for imaging ocular surface in vivo. Dual fluorescent protein reporter mouse enables visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers, and capillaries within the ocular surface. In addition to multiphoton fluorescence signals, acquiring second harmonic generation (SHG) simultaneously allows for the characterization of collagenous stromal architecture. This platform can be employed for intravital imaging with accurate positioning across the entire ocular surface, including cornea and conjunctiva.

Presented here is a multiphoton microscopic platform for live mouse ocular surface imaging. Fluorescent transgenic mouse enables the visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers and capillaries within the ocular surface. Non-linear second harmonic generation signals derived from collagenous structures provide label-free imaging for stromal architectures.

Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Biyomühendislik

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &ndash; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed due to challenges with different diagnostic modalities. Ciliary videomicroscopy, using Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), one of the diagnostic tools for PCD, is considered the optimal method to perform ciliary functional analysis (CFA), comprising of ciliary beat frequency (CBF) and beat pattern (CBP) analysis. However, DHSV lacks standardized, published operating procedure for processing and analyzing samples. It also uses living respiratory epithelium, a significant infection control issue during the COVID-19 pandemic. To continue providing a diagnostic service during this health crisis, the ciliary videomicroscopy protocol has been adapted to include adequate infection control measures.
Here, we describe a revised protocol for sampling and laboratory processing of ciliated respiratory samples, highlighting adaptations made to comply with COVID-19 infection control measures. Representative results of CFA from nasal brushing samples obtained from 16 healthy subjects, processed and analyzed according to this protocol, are described. We also illustrate the importance of obtaining and processing optimal quality epithelial ciliated strips, as samples not meeting quality selection criteria do now allow for CFA, potentially decreasing the diagnostic reliability and the efficiency of this technique.

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &#8211; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

To guarantee a successful and high-quality ciliary functional analysis for PCD diagnosis, a precise and careful method for respiratory epithelium sampling and processing is essential. To continue providing PCD diagnostic service during the COVID-19 pandemic, the ciliary videomicroscopy protocol has been updated to include appropriate infection control measures.

Dijital Yüksek Hızlı Siliyer Videomikroskopi Kullanarak Burun Fırçalama Örneklemesi ve İşleme – COVID-19 Pandemisine Adaptasyon

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

Primer İnsan Nazal Epitel Hücre Modellerinin Silia Beat Sıklığının Ölçülmesi İçin Toplanması, Genleştirilmesi ve Farklılaştırılması

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Tıp

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated clearance. Many clinically relevant defects in the mucociliary epithelium are inferred as they occur deep within the body. Here, we introduce a tractable 3D model for mucociliary epithelium generated from multipotent progenitors that were microsurgically isolated from Xenopus laevis embryos. The mucociliary epithelial organoids are covered with newly generated epithelium from deep ectoderm cells and later decorated with distinct patterned multiciliated cells, secretory cells, and mucus-producing goblet cells that are indistinguishable from the native epidermis within 24 h. The full sequences of dynamic cell transitions from mesenchymal to epithelial that emerge on the apical surface of organoids can be tracked by high-resolution live imaging. These in vitro cultured, self-organizing mucociliary epithelial organoids offer distinct advantages in studying the biology of mucociliary epithelium with high-efficiency in generation, defined culture conditions, control over number and size, and direct access for live imaging during the regeneration of the differentiated epithelium.

We describe a simple protocol to develop mucociliary epithelial organoids from deep ectoderm cells isolated from Xenopus laevis embryos. The multipotent progenitors regenerate epithelial goblet cell precursors and allow live tracking of the initiation and progression of the cell transitions on the surface of organoids.

Kenopus Embriyonik Hücrelerden Mukosiyaliyer Epitel Organoidler: Nesil, Kültür ve Yüksek Çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Biyoloji

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a metachronal, synchronal fashion, these multiple, motile, actin-based organelles generate a cephalad fluid flow clearing the respiratory tract of inhaled pollutants and pathogens. With increasing environmental pollution, novel viral pathogens and emerging multi-drug resistant bacteria, cilia generated mucociliary clearance (MCC) is essential for maintaining lung health. MCC is also depressed in multiple congenital disorders like primary ciliary dyskinesia, cystic fibrosis as well as acquired disorders like chronic obstructive pulmonary disease. All these disorders have established, in some case multiple, mouse models. In this publication, we detail a method using a small amount of radioactivity and dual-modality SPECT/CT imaging to accurately and reproducibly measure MCC in mice in vivo. The method allows for recovery of mice after imaging, making serial measurements possible, and testing potential therapeutics longitudinally over time. The data in wild-type mice demonstrates the reproducibility of the MCC measurement as long as adequate attention to detail is paid, and the protocol strictly adhered to.

In this publication, we describe protocols for assessing airway mucociliary clearance (MCC) in mice in vivo utilizing dual-modality radionuclide imaging. This protocol is designed for a single photon emission computed tomography (SPECT) and computed tomography (CT) acquisition protocol using mouse whole body (MWB) collimators in a dual SPECT/CT system.

Farelerde Mukozdiliyel Temizliğin In vivo Değerlendirilmesi

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

<meta charset="utf8"></head><body>Diferansiye Hava Yolu Epitelinin Biyofiziksel Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway Epithelium

Differentiating primary lung airway epithelial cells in the air-liquid interface (ALI) is a popular technique to develop a multi-cellular pseudostratified airway epithelium that mimics the apical side of the lung airway. While the differentiation of primary lung airway cells is expected, the assessment of biophysical properties like ciliary function and membrane impermeability provides a quality assessment of the airway epithelium and ensures the reliability of the experiment. Here, we describe a straightforward protocol for the development of multi-cellular pseudostratified airway epithelium in ALI culture and assess two important biophysical properties: ciliary function and membrane impermeability. To determine ciliary function, we captured the ciliary movement of a 4-week differentiated airway epithelium using a high-speed camera attached to an inverted microscope, followed by quantifying ciliary beat frequency (CBF) using the Simon Amon Video Analysis (SAVA) system. We also measured transepithelial electrical resistance (TEER) using a volt-ohm meter to determine the epithelial barrier integrity of the airway epithelium.

<meta charset="utf8"></head><body>Psödostratifiye Akciğer Hava Yolu Epitelinin Siliyer Fonksiyonunun ve Membran Geçirimsizliğinin Belirlenmesi

Air-liquid interface culture is commonly used to develop pseudostratified airway epithelium by differentiating primary normal human bronchial epithelial cells that mimic the apical side of the lung airway. Here, we describe an easy protocol for determining its quality by monitoring its biophysical properties, such as ciliary function and membrane integrity.

Psödostratifiye Akciğer Hava Yolu Epitelinin Siliyer Fonksiyonunun ve Membran Geçirimsizliğinin Belirlenmesi

Differentiating primary lung airway epithelial cells in the air-liquid interface (ALI) is a popular technique to develop a multi-cellular pseudostratified ...